CN105925546A - 艾纳香查尔酮合酶基因Bb-CHS、其编码蛋白质以及基因克隆方法 - Google Patents
艾纳香查尔酮合酶基因Bb-CHS、其编码蛋白质以及基因克隆方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种艾纳香查尔酮合酶基因Bb‑CHS,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1,一种艾纳香查尔酮合酶基因Bb‑CHS编码的蛋白质,氨基酸序列如SEQ ID NO:2,本发明还涉及RT‑PCR和RACE技术相结合,用于克隆艾纳香查尔酮合酶基因Bb‑CHS基因全长的方法。为进一步研究艾纳香Bb‑CHS基因的表达、调控奠定了基础,为Bb‑CHS基因参与艾纳香黄酮组成及调控机制研究提供参考,同时也为菊科植物Bb‑CHS基因功能和进化研究提供了新的背景资料。另外Bb‑CHS基因的大量表达,有助于提高艾纳香的生物学产量,同时提高植株有效成分榭皮素等类黄酮化合物的含量,从而同时提高艾纳香的产量和品质。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种基因及其克隆方法,同时也涉及到该基因编码蛋白质,尤其涉及一种艾纳香查尔酮合酶基因Bb-CHS、其编码蛋白质以及基因克隆方法。
背景技术
艾纳香(Blumea balsamifera L.DC.)为菊科艾纳香属多年生木质草本植物,主要分布于我国海南、贵州、广西、广东、云南、台湾等省。以其全草或地上部分入药,具有镇痛、发汗、祛风除湿、去痰止咳、通经止血等功效,在黎族、苗族、壮族等少数民族地区有着悠久的用药历史,是一种重要的民间药物。同时艾纳香也是获取天然冰片(艾片)的重要植物来源之一。并且,在精致艾片过程中所产生的艾油具有扩张血管、降低血压、抑制交感神经的作用,因而被广泛应用于医药行业。另外,艾油因其独特的芳香气味,还被广泛应用于香料以及化妆品行业。虽然以艾纳香为原材料的产品众多,然而关于其化学成分的研究较少。
对于艾纳香而言,其化学成分比较复杂,但具有药理作用的主要集中在黄酮类和挥发油成分上。关于艾纳香挥发油成分的研究:周欣等(2001)、马芝玉等(2009)采用GC/MS方法检测到艾纳香中挥发油成分主要为:L-龙脑、樟脑、β-石竹烯、芳樟醇、大叶香烯D、香木兰烯、顺-α-没药烯、β-荜澄茄油烯、γ-依兰油烯、ent-贝壳杉烯等萜类化合物。邓芹英等(1996),曹家庆等(2008),陈铭等(2009)分别对艾纳香中黄酮类成分进行了分析,主要含有艾纳香素、木犀草素、槲皮素、儿茶素以及阿亚黄素等。除此之外,艾纳香中还含有多其他种化合物,如小麦黄素、芹菜素、原儿茶酸(甲酯)、咖啡酸(甲酯)、香草酸等化合物。其中榭皮素等类黄酮化合物具有广泛的生理活性,在抗肿瘤方面具有良好的作用。
查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)是类黄酮类物质代谢合成过程中的关键酶,在植物与环境的相互作用中起到了重要的作用(如抗病、防止UV损伤、影响植物根瘤形成等),对植物的生长发育起着至关重要的作用,同时与植物的花色的形成密切相关。目前在研究植物生长发育及抗性中涉及较多研究,而从植物次生代谢及产物药理药效活性方面研究较少。
目前,CHS基因在高粱、玉米、矮牵牛、兰花、金鱼草、拟南芥、豆类和松树等植物上成功克隆,但目前还没有关于艾纳香查尔酮合酶(CHS)基因的相关报道。因此,对艾纳香查尔酮合酶基因的克隆以及对他们的生物学功能研究,将有助于明确艾纳香中类黄酮类次生代谢的分子机理,为调控其艾纳香中有效成分等奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足,提供一种首次从艾纳香种获得的查尔酮合酶基因。本发明的另一个目的是提供艾纳香查尔酮合酶编码的氨基酸序列及编码蛋白质性质生物信息学预测。同时,本发明还提供该艾纳香查尔酮合酶基因的克隆方法及引物对。
为了达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
本发明的第一个方面是提供一种艾纳香查尔酮合酶基因,从艾纳香(Blumeabalsamifera DC)中克隆,命名为Bb-CHS基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第二个方面是提供一种本发明第一个方面所述的艾纳香查尔酮合酶基因编码的蛋白质,命名为Bb-CHS蛋白质,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的艾纳香查尔酮合酶基因Bb-CHS的克隆方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)从艾纳香叶片中提取总RNA;
(2)以总RNA为模板进行反转录获得cDNA;
(3)设计简并引物对,进行PCR扩增,回收PCR产物,其中,简并引物对为:
PF1:TCACCAAACA AAGCCTGTCC,
PR1:TCACCCACCT CGTATTTTGC;
(4)PCR产物与pGEM-T easy Vector连接,连接产物转化E.coli JM109感受态细胞,采用蓝白斑筛选阳性克隆,筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序,获得Bb-CHS基因片段;
(5)以总RNA为模板,采用SMARTTM RACE Kit提供的反转录引物合成RACE第一链cDNA;根据获得Bb-CHS基因片段设计3’和5’末端快速扩增引物对,以RACE第一链cDNA为模板进行快速扩增,其中,3’和5’末端快速扩增引物对为:
Bb-CHS基因5’RACE引物:CACAAGGCTA TCAAGATGGG,
Bb-CHS基因3’RACE引物:CGGCCTTCGG TCAAACGGTT;
(6)步骤(5)得到的PCR产物经检测、回收、亚克隆和测序,获得Bb-CHS基因3’和5’末端序列,并进行拼接;
(7)根据上述拼接序列,于Bb-CHS基因开放阅读框两端设计全长cDNA扩增引物对,进行全长序列的克隆,其中全长cDNA扩增引物对为:
Bb-CHS基因5’引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT,
Bb-CHS基因3’引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
进一步地,步骤(5)中5’-&3’-RACE PCR反应体系为:TaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.4μl;10x Ex Taq Buffer,Mg2+plus 5μl;dNTP Mixture各2.5mmol/L,4μl;3’-RACE-ReadycDNA 1μl;GSP,10μmol/L,1μl;UPM,10x,5μl;ddH2O补充至50μl;
进一步地,步骤(7)中Bb-CHS基因全长序列的克隆的反应体系为:PCR反应总体积为50μl,1.5mmol/L MgCl2,4种dNTP各200μmol/L,引物各150ng,1.5U Taq plus DNApolymerase,高保真,100ng cDNA。
进一步地,步骤(1)中采用TRNzol法提取总RNA。
进一步地,步骤(2)中采用TaKaRa公司生产的PrimeScriptTM 1st Strand cDNASynthesis Kit进行反转录获得cDNA。
本发明的第四个方面是提供一种克隆本发明第一个方面所述的艾纳香查尔酮合酶基因Bb-CHS的简并引物对,其特征在于,所述简并引物对为:
PF1:TCACCAAACA AAGCCTGTCC,
PR1:TCACCCACCT CGTATTTTGC。
本发明的第五个方面是提供一种克隆本发明第一个方面所述的艾纳香查尔酮合酶基因Bb-CHS的3’和5’末端快速扩增引物对,所述3’和5’末端快速扩增引物对为:
Bb-CHS基因5’RACE引物:CACAAGGCTA TCAAGATGGG,
Bb-CHS基因3’RACE引物:CGGCCTTCGG TCAAACGGTT。
本发明的第六个方面是提供一种克隆本发明第一个方面所述的艾纳香查尔酮合酶基因Bb-CHS的全长cDNA扩增引物对,所述全长cDNA扩增引物对为:
Bb-CHS基因5’引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT,
Bb-CHS基因3’引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
本发明的第七个方面是提供一种克隆本发明第一个方面所述的艾纳香查尔酮合酶基因Bb-CHS的引物组,所述引物组包括简并引物对、3’和5’末端快速扩增引物对、以及全长cDNA扩增引物对,其中,
所述简并引物对为:
PF1:TCACCAAACA AAGCCTGTCC,
PR1:TCACCCACCT CGTATTTTGC;
所述3’和5’末端快速扩增引物对为:
Bb-CHS基因5’RACE引物:CACAAGGCTA TCAAGATGGG,
Bb-CHS基因3’RACE引物:CGGCCTTCGG TCAAACGGTT;
全长cDNA扩增引物对为:
Bb-CHS基因5’引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT,
Bb-CHS基因3’引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
本发明的有益效果是:
本发明涉及一种艾纳香查尔酮合酶基因Bb-CHS与编码的蛋白质及其克隆方法。本发明采用RT-PCR与RACE技术相结合的方法,对艾纳香种Bb-CHS基因进行了研究,首次从艾纳香叶片中克隆得到Bb-CHS基因全长序列,并对其所编码的氨基酸序列进行了分析,为进一步研究艾纳香Bb-CHS基因的表达、调控奠定了基础,为Bb-CHS基因参与艾纳香黄酮组成及调控机制研究提供参考,同时也为菊科植物Bb-CHS基因功能和进化研究提供了新的背景资料。另外Bb-CHS基因的大量表达,有助于提高艾纳香的生物学产量,并同时提高植株有效成分榭皮素等类黄酮化合物的含量,从而同时提高艾纳香的产量和品质。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明,以更好地理解本发明。
步骤1,选用艾纳香(Blumea balsamifera DC)叶片作为试验材料,采用TRNzol法提取总RNA,其含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测。
步骤2,以总RNA为模板,采用TaKaRa公司生产的PrimeScriptTM 1st Strand cDNASynthesis Kit进行反转录获得cDNA。
步骤3,以该cDNA为模板,根据NCBI上其他植物CHS基因保守区域,设计简并引物对,进行PCR扩增,简并引物对为:
PF1:TCACCAAACA AAGCCTGTCC,
PR1:TCACCCACCT CGTATTTTGC;
反应体系为:PCR反应总体积为50μl,1.5mmol/L MgCl2,4种dNTP各200μmol/L,引物各150ng,1.5U Taq plus DNA polymerase(高保真),100ng cDNA。
PCR反应条件为:
步骤4,PCR产物回收后与pGEM-T easy Vector连接,连接产物转化E.coli JM109感受态细胞,采用蓝白斑筛选阳性克隆,筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序,获得Bb-CHS基因片段:
步骤5,根据上述Bb-CHS基因片段设计3’和5’末端快速扩增(RACE)引物对;
Bb-CHS基因5’RACE引物:CACAAGGCTA TCAAGATGGG,
Bb-CHS基因3’RACE引物:CGGCCTTCGG TCAAACGGTT。
步骤6:采用SMARTTM RACE Kit提供反转录引物,以总RNA为模板,进行反转录,合成RACE第一链cDNA:
3’-RACE-Ready cDNA反应体系:Total RNA 1μg,3’-RACE CDS Primer:1μl,补ddH2O至终体积5μl;
5’-RACE-Ready cDNA反应体系:Total RNA 1μg,3’-RACE CDS Primer 1μl,BDSMART IITM Oligonucleotide 1℃温育2min,补ddH2O至终体积5μl。
将各反应体系混匀后,短暂离心,于70℃温育2min,迅速于冰中冷却2min,短暂快速离心后,在反应管中加入下列试剂:5X First-Strand Buffer 2μl,DTT 1μl,dNTP Mix 1μl,BD PowerScript Reverse Transcriptase 1μl,加ddH2O补至10μl,混匀,短暂离心,42℃温育1h,加入100μl Tricine-EDTA缓冲液稀释反应产物;72℃加热10min,4℃保存备用。
步骤7,采用3’和5’末端快速扩增(RACE)引物对,以RACE第一链cDNA为模板进行快速扩增。
5’-&3’-RACE PCR反应体系:TaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.4μl,10x Ex Taq Buffer(Mg2+plus)5μl,dNTP Mixture(各2.5mmol/L)4μl,3’-RACE-Ready cDNA 1μl,GSP(10μmol/L)1μl,UPM(10x)5μl,ddH2O补充至50μl。
PCR反应条件:
步骤8,PCR产物经检测、回收、亚克隆和测序。获得Bb-CHS基因3’和5’末端序列,并进行拼接。
步骤9,根据上述拼接序列,于Bb-CHS基因开放阅读框(ORF)两端设计全长cDNA扩增引物对:
Bb-CHS基因5’引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT,
Bb-CHS基因3’引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
进行Bb-CHS基因全长序列的克隆:
反应体系为:PCR反应总体积为50μl,1.5mmol/L MgCl2,4种dNTP各200μmol/L,引物各150ng,1.5U Taq plus DNA polymerase(高保真),100ng cDNA。
PCR反应条件为:
PCR产物经检测、回收、亚克隆和测序,获得Bb-CHS基因全长序列SEQ ID NO:1,其编码的氨基酸序列SEQ ID NO:2。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只是作为范例,本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种从艾纳香中获得的艾纳香查尔酮合酶基因Bb-CHS,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种权利要求1所述的艾纳香查尔酮合酶基因Bb-CHS编码的蛋白质,其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种权利要求1所述的艾纳香查尔酮合酶基因Bb-CHS的克隆方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)从艾纳香叶片中提取总RNA;
(2)以总RNA为模板进行反转录获得cDNA;
(3)设计简并引物对,进行PCR扩增,回收PCR产物,其中,简并引物对为:
PF1:TCACCAAACA AAGCCTGTCC,
PR1:TCACCCACCT CGTATTTTGC;
(4)PCR产物与pGEM-T easy Vector连接,连接产物转化E.coli JM109感受态细胞,采用蓝白斑筛选阳性克隆,筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序,获得Bb-CHS基因片段;
(5)以总RNA为模板,采用SMARTTM RACE Kit提供的反转录引物合成RACE第一链cDNA;根据获得Bb-CHS基因片段设计3’和5’末端快速扩增引物对,以RACE第一链cDNA为模板进行快速扩增,其中,3’和5’末端快速扩增引物对为:
Bb-CHS基因5’RACE引物:CACAAGGCTA TCAAGATGGG,
Bb-CHS基因3’RACE引物:CGGCCTTCGG TCAAACGGTT;
(6)步骤(5)得到的PCR产物经检测、回收、亚克隆和测序,获得Bb-CHS基因3’和5’末端序列,并进行拼接;
(7)根据上述拼接序列,于Bb-CHS基因开放阅读框两端设计全长cDNA扩增引物对,进行全长序列的克隆,其中全长cDNA扩增引物对为:
Bb-CHS基因5’引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT,
Bb-CHS基因3’引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
4.根据权利要求3所述的克隆方法,其特征在于,步骤(5)中5’-&3’-RACE PCR反应体系为:TaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.4μl;10x Ex Taq Buffer,Mg2+plus 5μl;dNTP Mixture各2.5mmol/L,4μl;3’-RACE-Ready cDNA 1μl;GSP,10μmol/L,1μl;UPM,10x,5μl;ddH2O补充至50μl。
5.根据权利要求3所述的克隆方法,其特征在于,步骤(7)中Bb-CHS基因全长序列的克隆的反应体系为:PCR反应总体积为50μl,1.5mmol/L MgCl2,4种dNTP各200μmol/L,引物各150ng,1.5U Taq plus DNA polymerase,高保真,100ng cDNA。
6.根据权利要求3所述的克隆方法,其特征在于,步骤(1)中采用TRNzol法提取总RNA;步骤(2)中采用TaKaRa公司生产的PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录获得cDNA。
7.一种用于克隆权利要求1所述的艾纳香查尔酮合酶基因Bb-CHS的简并引物对,其特征在于,所述简并引物对为:
PF1:TCACCAAACA AAGCCTGTCC,
PR1:TCACCCACCT CGTATTTTGC。
8.一种用于克隆权利要求1所述的艾纳香查尔酮合酶基因Bb-CHS的3’和5’末端快速扩增引物对,其特征在于,所述3’和5’末端快速扩增引物对为:
Bb-CHS基因5’RACE引物:CACAAGGCTA TCAAGATGGG,
Bb-CHS基因3’RACE引物:CGGCCTTCGG TCAAACGGTT。
9.一种用于克隆权利要求1所述的艾纳香查尔酮合酶基因Bb-CHS的全长cDNA扩增引物对,其特征在于,所述全长cDNA扩增引物对为:
Bb-CHS基因5’引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT,
Bb-CHS基因3’引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
10.一种用于克隆权利要求1所述的艾纳香查尔酮合酶基因Bb-CHS的引物组,其特征在于,所述引物组包括简并引物对、3’和5’末端快速扩增引物对、以及全长cDNA扩增引物对,其中,
所述简并引物对为:
PF1:TCACCAAACA AAGCCTGTCC,
PR1:TCACCCACCT CGTATTTTGC;
所述3’和5’末端快速扩增引物对为:
Bb-CHS基因5’RACE引物:CACAAGGCTA TCAAGATGGG,
Bb-CHS基因3’RACE引物:CGGCCTTCGG TCAAACGGTT;
全长cDNA扩增引物对为:
Bb-CHS基因5’引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT,
Bb-CHS基因3’引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
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