CN108070575A

CN108070575A - 一种唐古特大黄查尔酮合酶Rt-CHS1基因、蛋白质及克隆方法

Info

Publication number: CN108070575A
Application number: CN201711394028.8A
Authority: CN
Inventors: 胡延萍; 李毅; 王莉; 王钧; 钱前
Original assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Current assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2018-05-25

Abstract

本发明涉及一种唐古特大黄查尔酮合酶Rt‑CHS1基因、蛋白质及克隆方法，具体涉及生物基因克隆技术领域，采用RT‑PCR与RACE技术相结合的方法，对唐古特大黄Rt‑CHS1基因进行了研究，首次从唐古特大黄根中克隆得到Rt‑CHS1基因cDNA全长序列，并对其所编码的氨基酸序列进行了分析。本发明为进一步研究唐古特大黄Rt‑CHS1基因的表达、调控奠定了基础，为Rt‑CHS1基因参与唐古特大黄蒽醌类合成及调控机制研究提供参考，同时也为蓼科植物CHS1基因功能和进化研究提供了新的背景资料。另外，唐古特大黄Rt‑CHS1基因的克隆，对提高唐古特大黄中蒽醌类化合物含量和药材质量具有重要意义。

Description

一种唐古特大黄查尔酮合酶Rt-CHS1基因、蛋白质及克隆方法

技术领域

本发明属于生物基因克隆技术领域，具体涉及一种唐古特大黄查尔酮合酶Rt-CHS1基因、蛋白质及克隆方法。

背景技术

唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.)为蓼科(Polygonaceae)大黄属(Rheum L.)多年生草本植物，分布在西藏东部、青海、甘肃，生于海拔1700-4300米山坡林缘、灌丛中及半阴坡石堆中，是青藏高原特有物种。其干燥根及根茎入药，性寒，味苦；具有泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄之功效；为《中华人民共和国药典》(2015)中记载的三种“正品大黄”之一。

对于唐古特大黄而言，其化学成分包括蒽醌类、芪类、苯丁酮类和鞣质等，蒽醌类化合物是唐古特大黄重要的有效成分，其含量测定是评价唐古特大黄药材品质优劣的重要指标。蒽醌类化合物主要包括大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素和大黄素甲醚等，总量约3～5％，具有泻下、抗菌和抗肿瘤等功效。蒽醌类化合物是聚酮化合物的衍生物，其合成主要由植物III型聚酮化合物合酶催化的聚酮途径完成。聚酮化合物合酶作为植物体内蒽醌类化合物合成途径起始阶段的一种限速酶，其研究已成为近年来植物生理生化和分子生物学领域研究的热点之一。聚酮化合物合酶即查尔酮合酶超家族，包括查尔酮合酶(Chalconesynthase,CHS)、芪合成酶(Stilbene synthase,STS)、苯甲酮合酶(Benzalacetonesynthase,BAS)等，其同源性较高，氨基酸序列相似性达60-70％。

目前，CHS基因在矮牵牛、兰花、拟南芥等植物上已经成功克隆，关于唐古特大黄查尔酮合酶基因的报道甚少，尚未见唐古特大黄中CHS基因克隆及其编码的蛋白质氨基酸序列分析方面的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种唐古特大黄查尔酮合酶Rt-CHS1基因的克隆方法及引物序列，预测唐古特大黄Rt-CHS1编码的蛋白质氨基酸序列及其蛋白质性质。本发明填补了唐古特大黄Rt-CHS1基因序列尚未见报道的空白，将为唐古特大黄蒽醌类化合物合成途径研究奠定基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种唐古特大黄查尔酮合酶Rt-CHS1基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述基因的开放阅读框的长度为1179bp。

本发明还提供了一种表达该基因的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明还提供了一种唐古特大黄查尔酮合酶Rt-CHS1基因的克隆方法，包括以下步骤：

1)从唐古特大黄中提取总RNA；

2)以步骤1)得到的总RNA为模板进行反转录获得cDNA；

3)根据蓼科其他植物查尔酮合酶基因序列设计同源引物，以步骤2)得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，回收PCR产物；

4)将步骤3)得到的PCR产物测序，获得Rt-CHS1基因片段；

5)根据步骤4)获得的Rt-CHS1基因片段设计快速扩增引物，以根据步骤1)得到的总RNA合成的RACE第一链cDNA为模板，进行快速扩增PCR，回收快速扩增PCR产物；

6)将步骤5)得到的快速扩增PCR产物经过检测、回收、亚克隆和测序，获得Rt-CHS1基因的3’和5’末端，并进行拼接，得到拼接序列；

7)根据步骤6)所述拼接序列，设计全长cDNA扩增引物，进行全长序列的克隆。

优选的，步骤3)所述同源引物的序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

优选的，步骤6)所述快速扩增引物的序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

优选的，步骤8)所述全长cDNA扩增引物的序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

本发明首次从唐古特大黄中克隆出查尔酮合酶基因Rt-CHS1，为进一步研究唐古特大黄查尔酮合酶基因的表达、调控奠定了基础，为Rt-CHS1基因参与唐古特大黄蒽醌类化合物的合成及调控机制研究提供参考，且本发明的克隆方法操作简单，克隆基因准确率高。

附图说明

图1为唐古特大黄RNA提取电泳图，其中1～4为从唐古特大黄药材根提取得到的RNA，M为200bp ladder；

图2为CHS1基因片段PCR电泳图，其中1～2为用引物SEQ ID NO.3～4扩增CHS1基因的结果，3～6为用引物SEQ ID NO.5～6扩增CHS1基因的结果，7～10为用引物SEQ ID NO.7～8扩增CHS1基因的结果，M为200bp ladder；

图3为RACE电泳结果图，其中1～2为3’-RACE电泳结果，3～4为5’-RACE电泳结果，M:200bp ladder；

图4为RtCHS1基因序列与DQ205352.1基因序列比对结果；

图5为RtCHS1蛋白质氨基酸序列与ABB13607.1比对结果；

图6为唐古特大黄Rt-CHS1蛋白的二级结构，其中α-螺旋以长垂直线表示，伸展链以短垂直线表示，无规则卷曲以短线表示，β-转角以短线表示。

具体实施方式

在本发明中，所述唐古特大黄查尔酮合酶Rt-CHS1基因的开放阅读框的长度为1179bp；所述序列与蓼科植物掌叶大黄CHS1基因(DQ205352.1)序列相似性最高，达99.15％，不同之处有10处，分别为G→A(30bp处)、C→T(141bp处)、T→C(619bp处)、G→C(627bp处)、G→无(811bp处)、T→无(824bp处)、AG→无(833～834bp处)和无→G(843～844bp处)，具体对比结果如图4所示。

本发明中，所述Rt-CHS1基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。在本发明中，所述Rt-CHS1基因编码392个氨基酸，所述蛋白质的分子量为42.9835kDa，等电点为5.90，总平均疏水指数为-0.134。所述氨基酸与蓼科植物掌叶大黄(ABB13607.1)的相似性最高，达97.70％，区别于掌叶大黄的氨基酸序列位点在于DVPGLISKNIE→TCPGDLQTSR(271～281aa处)，具体对比结果如图5所示，二者活性催化位点(C165,H304,N337)和产物结合位点(E193,I194,T195,G217,I255,D256,G257,T265,F266,S339,P376)相同，所述不同之处不属于活性位点结合区域。

1)从唐古特大黄中提取总RNA；

2)以步骤1)得到的总RNA为模板进行反转录获得cDNA；

4)将步骤3)得到的PCR产物测序，获得Rt-CHS1基因片段；

本发明中，从唐古特大黄中提取总RNA。提取总RNA时，优选的以唐古特大黄的根状茎、根为提取对象，更优选的从根中提取总RNA，所述总RNA的提取方法优选的为CTAB-LiCl法，更优选的为程小丽等改良CTAB-LiCl法，所述改良CTAB-LiCl法具体参考大黄总RNA提取方法的研究(程小丽，魏胜利，刘春生，张晓芹.大黄总RNA提取方法的研究.时珍国医国药.2014(5):1214～1216)。

本发明中，以上述得到的总RNA为模板进行反转录获得cDNA。在本发明中，所述反转录前，优选的对提取得到的RNA进行检测，所述检测包括含量及质量检测、纯度检测，所述含量及质量检测优选的采用琼脂糖凝胶电泳检测；所述纯度检测优选的采用Nanodrop2000微量紫外分光光度计进行检测，所述纯度优选的为A₂₆₀/A₂₈₀＝1.85～2.12之间，更优选的为1.9～2.0之间。在本发明中，所述反转录采用试剂盒法进行，在本发明中，对进行反转录的试剂盒并没有特别限定，任何可满足反转录要求的试剂盒均可，优选的选用TaKaRa公司生产的PrimeScript^TM 1^st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录获得cDNA。

本发明中，根据蓼科其他植物查尔酮合酶基因序列设计同源引物，以上述得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，回收PCR产物。在本发明中，所述蓼科其他植物优选为为掌叶大黄和藏边大黄，根据NCBI上的这两种植物的CHS基因保守区域，分别利用Primer5软件设计引物，得到三对引物，所述引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。在本发明中，所述PCR扩增的反应体系为20μL体系，具体的为：

Ex Taq buffer(含MgCl₂)2.0μL，

dNTP mixture 2.5mmol/L 1.0μL，

引物100pmol/L各1.0μL，

Ex Taq polymerase 0.75U，

cDNA 100ng，

ddH₂O补足至20μL；

所述PCR反应的程序为：

在本发明中，所述SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对的退火温度为57℃，SEQID NO.5、SEQ ID NO.6及SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8的引物对的退火温度为55℃。在本发明中，PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳后回收。

将上述得到的PCR产物测序，获得Rt-CHS1基因片段。在本发明中，将上述得到的PCR产物测序，共获得三条基因片段，其序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15所示。

根据上述获得的Rt-CHS1基因片段设计快速扩增引物，以总RNA合成的RACE第一链cDNA为模板，进行快速扩增PCR，回收快速扩增PCR产物。在本发明中，根据获得的SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15序列设计快速扩增引物，所述引物的序列如SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10所示。在本发明中，所述RACE第一链cDNA优选的以SMART^TM RACE Kit提供的反转录引物，以总RNA为模板，进行反转录得到；所述反转录体系，优选的包括3’-RACE-Ready cDNA反应体系和5’-RACE-Ready cDNA反应体系，所述3’-RACE-Ready cDNA反应体系优选的包括总RNA，3’-CDS primer A及Sterile H₂O，所述总RNA的量优选的为1μg，所述3’-CDS primer A为SMART^TM RACE Kit提供的反转录引物，所述3’-CDS primerA的使用量优选的为1μL，补足无菌水至终体积，所述终体积优选的为12μL；5’-RACE-Ready cDNA反应体系优选的包括总RNA，5’-CDS primer A及Sterile H₂O，所述总RNA的量优选的为1μg，所述5’-CDS primer A为SMART^TM RACE Kit提供的反转录引物，所述5’-CDS primer A的使用量优选的为1μL，补足无菌水至终体积，所述终体积优选的为11μL。

在本发明中，为了达到反转录时的平衡，在5’-RACE-Ready cDNA反应体系中更优选的添加SMARTer II A Oligonuceleotide，所述SMARTer II A Oligonuceleotide的添加量优选的为1μL。将所述反应体系混匀后，短暂离心，于72℃温育3min，42℃冷却2min，冷却后，14000g下离心10s，把试剂收集在管底，并向反应管中加入下列试剂：5X First-StrandBuffer，DTT(100mM)，dNTP mixture(20mM)，RNase Inhibitor(40U/μL)，SMARTScribeReverse Transcriptase(100U)，所述5X First-Strand Buffer的添加量优选的为4μL，所述DTT(100mM)的添加量优选的为0.5μL，所述dNTP mixture的添加量优选的为1μL，所述RNase Inhibitor(40U/μL)的添加量为0.5μL，所述SMARTScribe Reverse Transcriptase(100U)的添加量为2μL。将上述试剂轻柔吸打混匀，短暂离心收集组分于管底。

在本发明中，所述RACE第一链cDNA的合成程序为PCR仪中42℃孵育90min，70℃加热10min。所述合成程序结束后，优选的在试管中添加Tricine-EDTA Buffer稀释第一链cDNA合成反应产物，所述Tricine-EDTA Buffer的添加量优选的为10μL，所述稀释后，在-20℃下保存备用。

在本发明中，所述快速扩增PCR的反应体系优选的为SeqAmp DNA polymerase 1.0μL,2X SeqAmp Buffer 25.0μL,dNTP mixture各2.5mmol/L 2.0μL,3’-or 5’-RACE-ReadycDNA 2.5μL,10X UPM 5.0μL,SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10 10μmol/L 1.0μL,ddH₂O补足50μL；

所述快速扩增PCR的反应程序为：

将上述快速扩增PCR产物经过检测、回收、亚克隆和测序，获得Rt-CHS1基因的3’和5’末端，并进行拼接，得到拼接序列。在本发明中，共获得三条Rt-CHS1基因片段，所述Rt-CHS1基因片段的序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示，将所述三条基因片段进行拼接，拼接后得到序列如SEQ ID NO.16所示。

根据上述得到的拼接序列，设计全长cDNA扩增引物，进行全长序列的克隆。在本发明中，所述设计全长cDNA扩增引物，在拼接序列的开放阅读框两端设计引物，所述全长cDNA扩增引物的序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；所述全长序列的克隆体系优选的为20μL体系，所述体系内包括Ex Taqbuffer 2.0μL(含MgCl₂)，dNTP mixture各2.5mmol/L1.0μL，引物100pmol/L各1.0μL，Ex Taq polymerase 0.75U,100ng cDNA，ddH2O补足至20μL。在本发明中，所述全长序列的克隆方法优选与上述克隆方法相同。

下面结合实施例对本发明提供的唐古特大黄查尔酮合酶Rt-CHS1基因、蛋白质及克隆方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

RNA提取：选用唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.)根作为实验材料，采用程小丽等(2014)改良CTAB-LiCl法提取总RNA，其含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测，RNA电泳结果如图1所示，Nanodrop2000微量紫外分光光度计检测其A₂₆₀/A₂₈₀＝1.9～2.0之间，表明所提RNA纯度较高。

反转录合成cDNA：以总RNA为模板，采用TaKaRa公司生产的PrimeScript^TM 1stStrand cDNA Synthesis Kit进行反转录获得cDNA。

Rt-CHS1基因片段扩增：以该cDNA为模板，根据NCBI上其他蓼科植物CHS基因保守区域，Primer Premier 5软件设计引物，进行PCR扩增，其引物对序列如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4，SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6及SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示，反应体系为：PCR反应总体积为20μL，Ex Taqbuffer 2.0μL(含MgCl₂)，dNTP mixture各2.5mmol/L 1.0μL，引物100pmol/L各1.0μL，Ex Taq polymerase 0.75U,100ng cDNA，ddH2O补足至20μL。

PCR反应条件为：

PCR电泳结果如图2所示。

PCR产物直接送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，获得Rt-CHS1基因片段；

根据获得的Rt-CHS1基因片段设计快速扩增引物，以总RNA合成的RACE第一链cDNA为模板，进行快速扩增PCR，回收快速扩增PCR产物；PCR电泳结果如图3所示；

将上述快速扩增PCR产物经过检测、回收、亚克隆和测序，获得Rt-CHS1基因的3’和5’末端，并进行拼接，得到拼接序列；

根据上述得到的拼接序列，设计全长cDNA扩增引物，进行全长序列的克隆。

Rt-CHS1的生物信息学分析

利用在线软件ORF finder分析获得的Rt-CHS1基因的全长cDNA序列，找出编码框，长度为1179bp；

SOPMA软件进行编码蛋白的二级结构组成进行预测，α-螺旋和随机卷曲是构成RtCHS1蛋白二级结构的主要结构元件，β-折叠和伸展链散布其中，整个蛋白由40.56％的α-螺旋、19.13％的伸展链、11.48％的β-转角和28.83％的无规则卷曲组成，具体结果如图6所示；

ProtParam工具计算编码蛋白质的理论分子量、等电点等，Rt-CHS1蛋白的分子量推测是42.9835kDa，等电点为5.90，总平均疏水指数为﹣0.134；

利用Singal P4.0在线分析软件分析编码蛋白无信号肽；

利用TMHMM服务器分析编码蛋白无跨膜结构。

查尔酮合酶(CHS)是黄酮类代谢途径中黄酮类物质合成的关键酶，能够催化1分子香豆酰-CoA和3分子的丙二酸单酰-CoA生成异黄酮、黄酮醇、黄烷酮和花青素等物质的共同前体查尔酮。查尔酮合酶基因在植物黄酮代谢途径中具有重要功能，其涉及植物的花色、育性和逆境反应等诸多植物生理生化过程，对植物与环境的相互作用中起着非常重要的作用，因此，对唐古特大黄中CHS1的研究具有很大的理论意义与实践价值。

由以上实施例可知，本发明涉及一种唐古特大黄查尔酮合酶基因Rt-CHS1与编码的蛋白质及其克隆方法，采用RT-PCR与RACE技术相结合的方法，对唐古特大黄Rt-CHS1基因进行了研究，首次从唐古特大黄根中克隆得到Rt-CHS1基因cDNA全长序列，并对其所编码的氨基酸序列进行了分析。本发明为进一步研究唐古特大黄Rt-CHS1基因的表达、调控奠定了基础，为Rt-CHS1基因参与唐古特大黄蒽醌类合成及调控机制研究提供参考，同时也为蓼科植物Rt-CHS1基因功能和进化研究提供了新的背景资料。另外，唐古特大黄Rt-CHS1基因的克隆，对提高唐古特大黄中蒽醌类化合物含量和药材质量具有重要意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院西北高原生物研究所

<120> 一种唐古特大黄查尔酮合酶Rt-CHS1基因、蛋白质及克隆方法

<141> 2017-12-15

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1179

<212> DNA

<213> Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.

<400> 1

atggcgccaa ccgtgcagga gatccggaag gcgcagaggg cggagggtcc cgccaccatc 60

ctggccattg gcacggccac cccgcccaac tgcgtctacc aggccgacta ccccgactac 120

tacttcaggg tcaccaacag cgaccacatg accgacttga aggagaagtt caggcgcatg 180

tgtgataagt cgatgattga gaagcgttac atgcatctga cggaggatct tctgaagcaa 240

aacccaggca tgtgcgagta catggcgtca tcgctggacg cccgtcagga catggtggtg 300

agcgaggtgc cgaggctcgg caaagaggcg gcgcaaaggg ccatcaaaga gtggggccag 360

gccaagtcca agatcaccca cgtcatcatg tgcaccacct ccggcgtcga catgcccggc 420

gccgactacc agctcaccaa gctcctcggc ctccgcccct ccgtcaagcg cttcatgatg 480

taccaacaag gttgcttcgc cggcgggacc gtcctccgta tggccaagga cctggcggag 540

aacaacaagg gcgcacgtgt cctcgtggtg tgctcggaga tcaccgccat ttgcttccgc 600

gggcccaccg acactcactt ggactcgatg gtgggccagg ccctattcgg tgacggagcc 660

ggggccctcg tagtgggagc ggaccctgac ctctccatcg aaaagcccat cttcgagctc 720

gtctggacgg cccaaaccat cctaccggac tcggaggggg cgatcgacgg ccacttgcgt 780

gaggtggggc tcaccttcca cctcctcaag gacgtgcccg ggttgatctc caagaacatc 840

gagaagagtc tggcggaggc gttctcgcct ctcgacatca gcgactggaa ctccctcttc 900

tgggtggccc acccgggtgg ccccgccatc ctcgaccagg tcgaggccaa gctcgggctc 960

aaggaggaga agctcaaggc caccaggcag gtgttgaacg actacgggaa catgtcgagc 1020

gcgtgcgtgc tcttcatcct ggatgagatg aggaagaagt cgatcaagaa tggacacgcc 1080

accaccggag aaggcttgga ttggggcgtg ttgttcgggt tcgggccggg tcttaccgtc 1140

gagaccgtgg tgctccacag tgttcccacc gccaattga 1179

<210> 2

<211> 392

<212> PRT

<213> Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.

<400> 2

Met Ala Pro Thr Val Gly Gly Ile Ala Leu Ala Gly Ala Ala Gly Gly

1 5 10 15

Pro Ala Thr Ile Leu Ala Ile Gly Thr Ala Thr Pro Pro Ala Cys Val

20 25 30

Thr Gly Ala Ala Thr Pro Ala Thr Thr Pro Ala Val Thr Ala Ser Ala

35 40 45

His Met Thr Ala Leu Leu Gly Leu Pro Ala Ala Met Cys Ala Leu Ser

50 55 60

Met Ile Gly Leu Ala Thr Met His Leu Thr Gly Ala Leu Leu Leu Gly

65 70 75 80

Ala Pro Gly Met Cys Gly Thr Met Ala Ser Ser Leu Ala Ala Ala Gly

85 90 95

Ala Met Val Val Ser Gly Val Pro Ala Leu Gly Leu Gly Ala Ala Gly

100 105 110

Ala Ala Ile Leu Gly Thr Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ile Thr His Val

115 120 125

Ile Met Cys Thr Thr Ser Gly Val Ala Met Pro Gly Ala Ala Thr Gly

130 135 140

Leu Thr Leu Leu Leu Gly Leu Ala Pro Ser Val Leu Ala Pro Met Met

145 150 155 160

Thr Gly Gly Gly Cys Pro Ala Gly Gly Thr Val Leu Ala Met Ala Leu

165 170 175

Ala Leu Ala Gly Ala Ala Leu Gly Ala Ala Val Leu Val Val Cys Ser

180 185 190

Gly Ile Thr Ala Ile Cys Pro Ala Gly Pro Thr Ala Thr His Leu Ala

195 200 205

Ser Met Val Gly Gly Ala Leu Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ala Leu Val

210 215 220

Val Gly Ala Ala Pro Ala Leu Ser Ile Gly Leu Pro Ile Pro Gly Leu

225 230 235 240

Val Thr Thr Ala Gly Thr Ile Leu Pro Ala Ser Gly Gly Ala Ile Ala

245 250 255

Gly His Leu Ala Gly Val Gly Leu Thr Pro His Leu Leu Leu Ala Val

260 265 270

Pro Gly Leu Ile Ser Leu Ala Ile Gly Leu Ser Leu Ala Gly Ala Pro

275 280 285

Ser Pro Leu Ala Ile Ser Ala Thr Ala Ser Leu Pro Thr Val Ala His

290 295 300

Pro Gly Gly Pro Ala Ile Leu Ala Gly Val Gly Ala Leu Leu Gly Leu

305 310 315 320

Leu Gly Gly Leu Leu Leu Ala Thr Ala Gly Val Leu Ala Ala Thr Gly

325 330 335

Ala Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Pro Ile Leu Ala Gly Met Ala Leu

340 345 350

Leu Ser Ile Leu Ala Gly His Ala Thr Thr Gly Gly Gly Leu Ala Thr

355 360 365

Gly Val Leu Pro Gly Pro Gly Pro Gly Leu Thr Val Gly Thr Val Val

370 375 380

Leu His Ser Val Pro Thr Ala Ala

385 390

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.

<400> 3

atggcgccaa ccgtgcagga g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.

<400> 4

gatctccgag cacaccacga g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.

<400> 5

gaggctcggc aaagaggcgg 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.

<400> 6

ccacccagaa gagggagttc cagtc 25

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.

<400> 7

ctcgtagtgg gagcggac 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.

<400> 8

gtgggaacac tgtggagc 18

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.

<400> 9

gattacgcca agcttaggca ggtgttgaac gactacgg 38

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.

<400> 10

gattacgcca agctttgtac tcgcacatgc ctgggttttg 40

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.

<400> 11

atggcgccaa ccgtgcag 18

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.

<400> 12

tcaattggcg gtgggaacac 20

<210> 13

<211> 584

<212> DNA

<213> Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.

<400> 13

ttatggcgcc aaccgtgcag gagatccgga aggcgcagag ggcggagggt cccgccacca 60

tcctggccat tggcacggcc accccgccca actgcgtcta ccaggccgac taccccgact 120

actacttcag ggtcaccaac agcgaccaca tgaccgactt gaaggagaag ttcaggcgca 180

tgtgtgataa gtcgatgatt gagaagcgtt acatgcatct gacggaggat cttctgaagc 240

aaaacccagg catgtgcgag tacatggcgt catcgctgga cgcccgtcag gacatggtgg 300

tgagcgaggt gccgaggctc ggcaaagagg cggcgcaaag ggccatcaaa gagtggggcc 360

aggccaagtc caagatcacc cacgtcatca tgtgcaccac ctccggcgtc gacatgcccg 420

gcgccgacta ccagctcacc aagctcctcg gcctccgccc ctccgtcaag cgcttcatga 480

tgtaccaaca aggttgcttc gccggcggga ccgtcctccg tatggccaag gacctggcgg 540

agaacaacaa gggcgcacgt gtcctcgtgg tgtgctcgga gatc 584

<210> 14

<211> 589

<212> DNA

<213> Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.

<400> 14

tgaggctcgg caaagaggcg gcgcaaaggg ccatcaaaga gtggggccag gccaagtcca 60

agatcaccca cgtcatcatg tgcaccacct ccggcgtcga catgcccggc gccgactacc 120

agctcaccaa gctcctcggc ctccgcccct ccgtcaagcg cttcatgatg taccaacaag 180

gttgcttcgc cggcgggacc gtcctccgta tggccaagga cctggcggag aacaacaagg 240

gcgcacgtgt cctcgtggtg tgctcggaga tcaccgccat ttgcttccgc gggcccaccg 300

acactcactt ggactcgatg gtgggccagg ccctattcgg tgacggagcc ggggccctcg 360

tagtgggagc ggaccctgac ctctccatcg aaaagcccat cttcgagctc gtctggacgg 420

cccaaaccat cctaccggac tcggaggggg cgatcgacgg ccacttgcgt gaggtggggc 480

tcaccttcca cctcctcaag gacgtgcccg ggttgatctc caagaacatc gagaagagtc 540

tggcggaggc gttctcgcct ctcgacatca gcgactggaa ctccctctt 589

<210> 15

<211> 503

<212> DNA

<213> Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.

<400> 15

ctcgtagtgg gagcggaccc tgacctctcc atcgaaaagc ccatcttcga gctcgtctgg 60

acggcccaaa ccatcctacc ggactcggag ggggcgatcg acggccactt gcgtgaggtg 120

gggctcacct tccacctcct caaggacgtg cccgggttga tctccaagaa catcgagaag 180

agtctggcgg aggcgttctc gcctctcgac atcagcgact ggaactccct cttctgggtg 240

gcccacccgg gtggccccgc catcctcgac caggtcgagg ccaagctcgg gctcaaggag 300

gagaagctca aggccaccag gcaggtgttg aacgactacg ggaacatgtc gagcgcgtgc 360

gtgctcttca tcctggatga gatgaggaag aagtcgatca agaatggaca cgccaccacc 420

ggagaaggct tggattgggg cgtgttgttc gggttcgggc cgggtcttac cgtcgagacc 480

gtggtgctcc acagtgttcc cac 503

<210> 16

<211> 1171

<212> DNA

<213> Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.

<400> 16

ttatggcgcc aaccgtgcag gagatccgga aggcgcagag ggcggagggt cccgccacca 60

tcctggccat tggcacggcc accccgccca actgcgtcta ccaggccgac taccccgact 120

actacttcag ggtcaccaac agcgaccaca tgaccgactt gaaggagaag ttcaggcgca 180

tgtgtgataa gtcgatgatt gagaagcgtt acatgcatct gacggaggat cttctgaagc 240

aaaacccagg catgtgcgag tacatggcgt catcgctgga cgcccgtcag gacatggtgg 300

tgagcgaggt gccgaggctc ggcaaagagg cggcgcaaag ggccatcaaa gagtggggcc 360

aggccaagtc caagatcacc cacgtcatca tgtgcaccac ctccggcgtc gacatgcccg 420

gcgccgacta ccagctcacc aagctcctcg gcctccgccc ctccgtcaag cgcttcatga 480

tgtaccaaca aggttgcttc gccggcggga ccgtcctccg tatggccaag gacctggcgg 540

agaacaacaa gggcgcacgt gtcctcgtgg tgtgctcgga gatcaccgcc atttgcttcc 600

gcgggcccac cgacactcac ttggactcga tggtgggcca ggccctattc ggtgacggag 660

ccggggccct cgtagtggga gcggaccctg acctctccat cgaaaagccc atcttcgagc 720

tcgtctggac ggcccaaacc atcctaccgg actcggaggg ggcgatcgac ggccacttgc 780

gtgaggtggg gctcaccttc cacctcctca aggacgtgcc cgggttgatc tccaagaaca 840

tcgagaagag tctggcggag gcgttctcgc ctctcgacat cagcgactgg aactccctct 900

tctgggtggc ccacccgggt ggccccgcca tcctcgacca ggtcgaggcc aagctcgggc 960

tcaaggagga gaagctcaag gccaccaggc aggtgttgaa cgactacggg aacatgtcga 1020

gcgcgtgcgt gctcttcatc ctggatgaga tgaggaagaa gtcgatcaag aatggacacg 1080

ccaccaccgg agaaggcttg gattggggcg tgttgttcgg gttcgggccg ggtcttaccg 1140

tcgagaccgt ggtgctccac agtgttccca c 1171

Claims

1.一种唐古特大黄查尔酮合酶Rt-CHS1基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述基因的开放阅读框的长度为1179bp。

3.表达权利要求1所述基因的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

4.权利要求1所述基因的克隆方法，包括以下步骤：

1)从唐古特大黄中提取总RNA；

2)以步骤1)得到的总RNA为模板进行反转录获得cDNA；

4)将步骤3)得到的PCR产物测序，获得Rt-CHS1基因片段；

5)根据步骤4)获得的Rt-CHS1基因片段设计快速扩增引物，以根据步骤1)中总RNA合成的RACE第一链cDNA为模板，进行快速PCR扩增，回收快速扩增PCR产物；

6)将步骤5)得到的快速扩增PCR产物经过检测、回收、亚克隆和测序，获得Rt-CHS1基因的3’和5’末端，并将得到的序列进行拼接，得到拼接序列；

7)根据步骤6)所述拼接序列，设计全长cDNA扩增引物，进行全长序列的克隆，得到Rt-CHS1基因。

5.根据权利要求4所述的克隆方法，其特征在于，步骤3)所述同源引物包括3对，其序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

6.根据权利要求4所述的克隆方法，其特征在于，步骤5)所述快速扩增引物的序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

7.根据权利要求4所述的克隆方法，其特征在于，步骤7)所述全长cDNA扩增引物的序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。