CN105543218A - 与控制黄瓜果刺有无基因Tril共分离的显性分子标记 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一个与控制黄瓜果刺有无基因Tril共分离的显性分子标记，命名为CoT-01，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，所述CoT-01与有果刺基因Tril连锁，无果刺基因tril不能扩增出特异性片段。本发明的分子标记和Tril基因位点共分离，对黄瓜微毛和无毛品系的区分有很大帮助；且具有高稳定性，可以在黄瓜苗期便可简便、快速地区分有无果刺表型，可应用于相关的分子标记辅助育种中。

Description

与控制黄瓜果刺有无基因Tril共分离的显性分子标记
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域的分子标记，特别涉及一个与控制黄瓜果刺有无基因Tril共分离的显性分子标记。
背景技术
黄瓜(CucumissativusL.)是葫芦科(Cucurbitaceae)黄瓜属(Cucumis)一年蔓生的草本植物，黄瓜作为世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我国主栽蔬菜作物之一。果实是黄瓜经济性状最重要的部分，黄瓜果实属于瓠果，由子房和花托共同发育而成。果刺是表皮毛在果实上的形态高度特化，也是重要的果实性状。果刺的有无性状是由Trichome-less(Tril)基因调控，有果刺的野生性状(Tril)为显性，无果刺的突变体性状(tril)为隐性。关于黄瓜果刺的研究报道，最早可追述到1997年，华北类型黄瓜地方品种“大青把”自交后代的微毛自然突变体被发现，其表现为茎、叶、萼片、果实表面均覆盖肉眼难察觉的微毛，并被命名为“glabrous(gl)”。通过遗传分析发现，该微毛基因为隐性突变，基因被进一步克隆和分子验证。随后发现欧洲温室黄瓜类型的自然突变体，该突变体表现为茎、枝、叶、卷须、花瓣、萼片及子房表面均无表皮毛，果实无刺无瘤，被命名为“Trichome-less(Tril)”。通过遗传分析发现，该突变同样为隐性突变，并将其等位显性基因命名为Tril。无果刺tril突变成株和微毛gl突变体成株均表现为表皮无可见毛无可见果刺，用肉眼难以区分，前人也没有对Tril候选基因进行进一步的定位和分析。
图位克隆(Map-basedcloning)，可在基因产物未知的情况下，利用分离群体的遗传连锁分析或染色体的异常，将目的基因定位到染色体的一个具体位置，找到与其紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆基因。最常用的标记筛选方法是分离体分组混合分析法(Bulkedsegregantanalysis，BSA)，该方法在一对具有目的基因表型差异的亲本所构建的分离群体中，根据目的基因的表型，分别选取相同数量的个体，构成两个亚群，将每个亚群中个体的DNA等量混合，形成两个相对性状的“基因池”(Genepool)，然后用合适的分子标记对两个基因池进行分析，在两池间表现出多态性的分子标记与目的基因座位相连锁，再利用分离群体进一步检测所得分子标记与目的基因的连锁程度，从而确定其在已知分子图谱或染色体上的位置。由于构建基因池使用了特定的分离群体，且在分组时仅对目的基因表型进行选择，这样保证了其他性状的遗传背景基本相同，两个基因池之间理论上应主要在目的基因区段存在差异，排除了环境及人为因素的影响，使研究结果更为准确可靠。和目的基因有紧密连锁的分子标记具有高效、快速、不受环境条件限制等优点，可在苗期进行选择，加快育种的进程。
随着人们生活水平的提高，黄瓜品质育种已提上日程。黄瓜果刺性状属于果实感观品质范畴。欧美温室类型的黄瓜为无果刺的果皮，称其为水果黄瓜，其市场价格为普通黄瓜的2-3倍。外观光滑黄瓜污染少，清洗方便，食用卫生，是无公害蔬菜的理想品种。经检测表明：无刺黄瓜果肉农药残留量比有刺黄瓜低27％，果皮农药残留量低18％。黄瓜果刺基因Tril控制果刺的发育和形成，它的研究将会推动黄瓜品质育种进程。用与目的性状共分离连锁的分子标记进行标记辅助选择在黄瓜遗传育种中是十分有效的方法。稳定遗传的无刺突变体为黄瓜果刺形成机理研究提供了理想的材料，其和有刺亲本的F1群体表现为少刺，为黄瓜培育少刺新品种提供了稳定无刺亲本。
发明内容
本发明的目的，在于提供一个与控制黄瓜果刺有无基因Tril共分离的显性分子标记。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一个与控制黄瓜果刺有无基因Tril共分离的显性分子标记，命名为CoT-01，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述CoT-01与有果刺基因Tril连锁，无果刺基因tril不能扩增出特异性片段。
所述CoT-01由SEQIDNO.2所示的上游引物和SEQIDNO.3所示的下游引物扩增得到，扩增程序为：94℃5分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃5分钟。
引物由上海生工科技有限公司合成。
本发明利用微毛突变体gl和无果刺突变体tril杂交的1058株F2分离群体，通过表型分析确定了黄瓜果刺有无性状和微毛性状非等位基因，且果刺性状属于单基因显性性状。后分别取每株嫩叶提取基因组DNA，结合BSA法筛选与Tril基因紧密连锁的分子标记。利用高密度图谱分子标记，最终提供一个与黄瓜果刺基因Tril共分离连锁的标记，经鉴定座落在Tril基因内，该分子标记的产物用琼脂糖凝胶即可简单区分果刺的有无，便于区分肉眼难以辨别的微毛和无果刺突变体黄瓜品系，和无果刺分子标记辅助育种体系的建立。本发明的分子标记可简便、快捷、高通量的应用与育种实践。
附图说明
图1为分子标记CoT-01对F2群体的筛选效果。
具体实施方式
一、F2代分离群体的构建
构建F2群体所用到的无刺突变体为欧洲温室突变体tril。微毛品种。本实施例利用这两个亲本配制F1代，F1代自交产生F2代群体。在多种F2群体鉴定有/无果刺表型，最后分析F1表型和F2分离比，卡方分析法进行验证，得出黄瓜果刺性状属于单基因控制的显性性状。
二、黄瓜基因组DNA的提取
用CTAB法提取亲本及F2分离群体叶片的基因组总DNA。取刚刚展开的一片真叶至2mL离心管中并加入液氮，研磨组织成粉末状，加入700μLCTAB裂解缓冲液，剧烈振荡30秒，60℃水浴1小时，期间上下颠倒5次充分混匀。向上述匀浆裂解液中加入700μL氯仿异戊醇(24:1，v/v)，上下颠倒充分混匀，13200rpm4℃离心15分钟。吸取上清液500μL至新的离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，于－20℃静置30分钟，12000rpm4℃离心15分钟。弃上清，沿离心管壁加入75％乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁，12000rpm4℃离心5分钟后弃去乙醇。室温干燥沉淀，加入100μLRNA酶TE缓冲液(7:993，v/v)溶解，37℃水浴30分钟，核酸仪测定DNA浓度后用TE缓冲液稀释终浓度为30ng/μL，于－20℃备用。
三、SSR标记扫描F2分离群体
利用本发明开发的分子标记扫描上述F2分离群体，寻找标记型与性状表现型的差别单株，获得标记与Tril基因的交换单株。PCR体系50μL：1×TaqBuffer，1.5mmol/LMgCl2，200μmol/LdNTPs，引物各0.2μmol/L，30ng模板DNA，0.5UTaqDNAPolymerase，总反应体系为10μL。PCR程序：94℃5分钟；35个循环，94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒；72℃5分钟。在PCR产物中加入BioTekeSYBRGreenI核酸染料7μL，4℃静置15分钟使染料与DNA结合，用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切下目的片段，使用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit回收纯化DNA片段，具体步骤参照试剂盒说明书，产品编号9762。将纯化片段送由上海生工科技有限公司测序，测序结果通过Chromas2.3软件分析。
CoT-1分子标记经过F2分离群体验证，均与Tril基因位点共分离，无交换株出现，且特异性PCR具有高稳定特征。利用CoT-1分子标记将有助于黄瓜微毛和无果刺品系的区分，以及黄瓜有无果刺植株的筛选。
图1为分子标记CoT-01对F2群体的筛选效果。图中所示，M：marker1，tril：无果刺突变体，WT：野生型9930，F2无果刺群体和F2有果刺群体分别表示在gl×trilF2群体中随机挑选的10株无果刺和10株有果刺植株。

Claims (2)

1.一个与控制黄瓜果刺有无基因Tril共分离的显性分子标记，命名为CoT-01，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述CoT-01与有果刺基因Tril连锁，无果刺基因tril不能扩增出特异性片段。
2.根据权利要求1所述的与控制黄瓜果刺有无基因Tril共分离的显性分子标记，其特征在于：所述CoT-01由SEQIDNO.2所示的上游引物和SEQIDNO.3所示的下游引物扩增得到，扩增程序为：94℃5分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃5分钟。
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