CN103146694B - 在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸c4生物合成途径的基因及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因及其构建方法，通过分析5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的限速步骤、中间体供给及产物分泌等问题，克隆<i>Rhodobacter？sphaeroides</i>来源的ALA合成酶基因（<i>hemA</i>）、<i>Propionibacterium？shermanil</i>来源的辅酶A转移酶基因（<i>Cat</i>）以及<i>Escherichia？coli</i>来源的ALA分泌基因（<i>YBi</i>），借助pETDuet-1共表达载体，共表达了合成5-氨基乙酰丙酸的<i>hemA</i>、生成5-氨基乙酰丙酸合成的中间体琥珀酸COA的<i>Cat</i>和促进5-氨基乙酰丙酸的分泌的<i>Ybi</i>，三个基因的共表达加强了5-氨基乙酰丙酸的生物合成，通过本发明所制备的具有C4生物途径的基因，提高了<i>Escherichia？coli</i>的5-氨基乙酰丙酸产量，分泌到细胞外的ALA达到1124？mg/L。

Description

在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因及其构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物发酵领域，具体涉及一种在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因及其构建方法。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸（ALA）是一种含氧元素和氮元素的碳氢化合物，是生物体合成四氢吡咯的前体，还是卟啉、（亚铁）血红素、叶绿素以及维生素B₁₂的结构类似物。ALA是一种生理活性非常活跃的非蛋白类氨基酸，其应用范围非常广阔。在农业上，作为一种光活化绿色无公害的除草剂、杀虫剂、抗微生物药剂和植物生长促进剂而得到广泛应用。在医学上，ALA被应用到癌症的光动力学治疗和诊断上；还具有促进血红素生成的作用。另外，5-氨基乙酰丙酸作为外用药可用于痤疮的治疗和作为生发剂使用。

ALA在生物体内存在着两条合成途经（如图1所示），一种途径称为碳四途径（C4pathway），存在于动物、真菌和α家族细菌中，由5-氨基乙酰丙酸合酶（ALAsynthase，ALAS）催化琥珀酰COA和甘氨酸缩合成ALA。另一条途径被称为碳五途径（C5pathway），存在于植物、藻类以及大部分细菌中，ALA来源于谷氨酸的碳骨架，由3个酶催化。由碳四途径和碳五途径获得的ALA均被共同的下游代谢酶ALA脱水酶催化形成胆色素原，然后进一步向下游转化。

大肠杆菌本身通过C5途径合成ALA，但是，由于大肠杆菌不需要合成叶绿素，仅需要以ALA为前体合成少量的维生素B12等四吡咯类化合物，因此其天然的ALA合成能力很弱。

目前，ALA的合成方法分为化学法和生物法两种。化学合成法合成步骤复杂，原料来途径窄，合成造价较高，致使目前ALA产品市场价格昂贵(约326美元/克)，制约了它的推广应用。生物合成ALA因工艺简单、产率高，具有工业化生产前景。近年来，国内外研究者利用基因工程菌生产ALA已经取得了一些进展。Kiatpapan和Murooka将类球红细菌(R.sphaeroides)的ALA合成酶的hemA基因在费氏丙酸菌中实现表达，ALA积累量达到1.1g/L。Mariet和Zeikus通过过表达获得Escherichiacoli重组菌，ALA发酵产量达到了3.79g/L。XieL.等利用含有hemA基因的重组大肠杆菌，经过发酵优化，ALA产量达到5.2g/L。浙江大学LinJ.等通过优化hemA基因的表达和发酵条件，ALA产量达到7.3g/L。但是上述有关ALA的合成方法中，只是针对hemA基因进行分子操作，所构建的基因工程菌都仅限于过表达ALA合成酶一个基因，没有强化C4生物合成途径中的中间物的合成和强化ALA的分泌途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题，是提供一种在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因及其构建方法，对ALA合成酶基因（hemA）、辅酶A转移酶基因（cat）以及ALA分泌基因（YBi）进行基因操作，借助pETDuet-1共表达载体，构建了一株具有较高表达水平的基因，通过共表达hemA、Cat和YBi使细胞外ALA的产量达到1124mg/L。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种基因，其序列如SEQIDNO:1所示。

本发明还提供了在一种构建该基因的方法，其按照以下步骤顺序进行：

（1）以Rhodobactersphaeroides基因组为模板，利用引物hemA-F和hemA-R扩增hemA基因；

引物hemA-F的序列为CGGAATTCGATGGACTACAATCTGGCACTCGATACCGCT；

hemA-R的序列为ATAAGAATGCGGCCGCTCAGGCAACGACCTCGGCG；

相应的酶切位点分别为EcoRI和NotI；

（2）通过以Propionibacteriumshermanil基因组为模板，利用Cat-F和Cat-R扩增Cat基因；

引物Cat-F的序列为GGAATTCCATATGAACGAACGCATCTCCA；

Cat-R的序列为GGAATTCCATATGTCAACGGTAGTGCGAAAGC；

相应的酶切位点分别为NdeI；

（3）ALA分泌基因YBi借助启动子表达：以Escherichiacoli基因组为模板，通过重叠PCR，利用引物Prom-F、Prom-R、Ybi-F、Ybi-R得到含有完整表达盒的YBi基因；

引物Prom-F的序列为AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCCGCATAATCGAAATTAATAC；

Prom-R的序列为ACGTAATGAACCAGGCATTATATCTCCTTCTTATACTT；

Ybi-F的序列为AGAAGGAGATATAATGCCTGGTTCATTACGT；

Ybi-R的序列为AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAATTAATGTCTAATTCTTTTAT；

Prom-F和Ybi-R的酶切位点为NotI；

（4）各基因片段经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收，并与pMD18-Tsimple载体连接，转化E.coliDH5α；

（5）涂布在含100μg/LAmp的LB固体培养基上，蓝白斑筛选的阳性克隆经质粒PCR及酶切鉴定后进行测序；

（6）共同表达载体pETA、pETAC、pETACY的构建；

质粒pETDuet-1和质粒pMD18-T-hemA分别用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切，回收目的片段，用T4DNA连接酶将两片段连接得到质粒pETA；将质粒pETA和质粒pMD18-T-Cat分别用限制性内切酶NdeI进行单酶切，回收两目的片段，将Cat基因片段作为插入片段连接到pETA单酶切得到的较大片段上，得到重组质粒pETAC；

质粒pETAC和质粒pMD18-T-YBi分别用限制性内切酶NotI进行单酶切，回收两目的酶切片段，将ALA分泌基因YBi连接到pETAC单酶切得到的较大片段上，得到重组质粒pETACY；将以上构建得到的质粒载体转化E.coliDH5α，提取质粒，采用酶切和PCR方法鉴定阳性克隆；

（7）重组质粒的诱导表达；

将重组质粒pETA、pETAC、pETACY分别转化到E.coliBL21(DE3)中，菌株分别命名为E.coliA、E.coliAC、E.coliACY，挑取含重组质粒的BL21(DE3)单菌落，接种至含50μg/LAmp的液体LB培养基中，37℃培养过夜，加入的甘氨酸终浓度为100mM；

然后以1:100的比例接种至20mL的液体LB培养基中，37℃放大培养至OD600为0.6～0.8，然后降温至28℃，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为1mM，继续培养12小时；

（8）PT-PCR验证基因的转录；

采用多糖多酚植物总RNA快速提取离心柱型试剂盒提取菌株E.coliACY中的RNA，将提取的RNA作为第一链cDNA合成的模板，采用20μl的反应体系，加入各种反应试剂，轻轻混匀，42℃孵育30min，85℃加热5min使EasyScript失活；

取2μl的反转录产物作为PCR模板，分别扩增hemA、Cat及YBi基因，阳性对照组分别以pETA、pETAC、pETACY质粒为模板扩增hemA、Cat及YBi。

由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

本发明公开了一种在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因及其构建方法，通过分析5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的限速步骤、中间体供给及产物分泌等问题，克隆Rhodobactersphaeroides来源的ALA合成酶基因（hemA）、Propionibacteriumshermanil来源的辅酶A转移酶基因（Cat）以及Escherichiacoli来源的ALA分泌基因（YBi），借助pETDuet-1共表达载体，共表达了合成5-氨基乙酰丙酸的hemA基因、生成5-氨基乙酰丙酸合成的中间体琥珀酸COA的Cat基因和促进5-氨基乙酰丙酸的分泌的Ybi基因，三个基因的共表达加强了5-氨基乙酰丙酸的生物合成，通过本发明所制备的具有C4生物途径的工程菌，提高了Escherichiacoli的5-氨基乙酰丙酸产量，分泌到细胞外的ALA达到1124mg/L。

附图说明

本发明下面将结合说明书附图与具体实施例作进一步详细说明：

图1为生物体内的ALA合成途经示意图；

图2为本发明实施例1的重组质粒的构建示意图；

图3为本发明实施例１ALAC4生物合成途径的构建示意图；

图4为PetA酶切鉴定图谱；

图5为PetAC酶切鉴定图谱；

图6为PetACY酶切鉴定图谱；

图7为RNA提取验证图谱；

图8为RT-PCR结果验证图谱；

图9为SDS-PAGE分析目的蛋白表达图谱。

具体实施方式

实施例１

一种在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因及其构建方法。

一、一种在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因；

5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径大肠杆菌工程菌，借助pETDuet-1载体，共表达三个基因：ALA合成酶基因hemA、辅酶A转移酶基因cat和ALA分泌基因YBi，所述工程菌序列如SEQIDNO:1所示；

二、在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因的构建方法；

1、原料；

本实施例中所涉及的实验相关菌株与质粒如表1所示；

表1实验所用菌株及质粒

本实施例中所涉及的培养基如下所示：

大肠杆菌的培养，除特别注明外均采用LB培养基；

本实施例中所涉及的酶及主要试剂如下所示：

限制性内切酶、T4DNA连接酶等工具酶购自NEB公司；Taq酶、dNTPs、蛋白分子量标准购自大连宝生物工程公司（TaRaKa）；基因组DNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、PCR产物纯化回收试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；cDNA合成试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司（TransGen）；IPTG购自华美公司；氨基乙酰丙酸盐标准品购自Sigma公司；常用生化试剂为国产分析纯试剂；

2、试验方法；

如图3所示，为本实施例中ALAC4生物合成途径的构建示意图，由图可以看出：cat基因的表达催化乙酰COA和琥珀酸生成琥珀酸COA，hemA基因的表达催化琥珀酸COA与外源甘氨酸合成5-氨基乙酰丙酸，Ybi基因的表达强化5-氨基乙酰丙酸的分泌；

（1）以Rhodobactersphaeroides基因组为模板，利用引物hemA-F和hemA-R扩增hemA基因；

（2）通过以Propionibacteriumshermanil基因组为模板，利用Cat-F和Cat-R扩增Cat基因；

（3）ALA分泌基因YBi借助启动子表达：以Escherichiacoli基因组为模板，通过重叠PCR，利用引物Prom-F、Prom-R、Ybi-F、Ybi-R得到含有完整表达盒的YBi基因；

各基因片段与载体pMD18-Tsimple连接后的产物分别命名为pMD18-T-hemA、pMD18-T-Cat、pMD18-T-YBi；

表2实验所用引物

引物	序列	酶切位点
			hemA-F	CGGAATTCGATGGACTACAATCTGGCACTCGATACCGCT	EcoR I
hemA-R	ATAAGAATGCGGCCGCTCAGGCAACGACCTCGGCG	Not I
			Cat-F	GGAATTCCATATGAACGAACGCATCTCCA	Nde I
Cat-R	GGAATTCCATATGTCAACGGTAGTGCGAAAGC	Nde I
			Prom-F	AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCCGCATAATCGAAATTAATAC	Not I
Prom-R	ACGTAATGAACCAGGCATTATATCTCCTTCTTATACTT
			Ybi-F	AGAAGGAGATATAATGCCTGGTTCATTACGT
Ybi-R	AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAATTAATGTCTAATTCTTTTAT	Not I

（4）各基因片段经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收，并与pMD18-Tsimple载体连接，转化E.coliDH5α；

（5）涂布在含100μg/LAmp的LB固体培养基上，蓝白斑筛选的阳性克隆经质粒PCR及酶切鉴定后送上海生工生物工程有限公司测序；

各基因片段与载体pMD18-Tsimple连接后的产物分别命名为pMD18-T-hemA、pMD18-T-Cat、pMD18-T-YBi；

（6）共同表达载体pETA、pETAC、pETACY的构建，质粒pETDuet-1和质粒pMD18-T-hemA分别用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切，回收目的片段，用T4DNA连接酶将两片段连接得到质粒pETA。将质粒pETA和质粒pMD18-T-Cat分别用限制性内切酶NdeI进行单酶切，回收两目的片段，将Cat基因片段作为插入片段连接到pETA单酶切得到的较大片段上，得到重组质粒pETAC。质粒pETAC和质粒pMD18-T-YBi分别用限制性内切酶NotI进行单酶切，回收两目的酶切片段，将ALA分泌基因YBi连接到pETAC单酶切得到的较大片段上，得到重组质粒pETACY；将以上构建得到的质粒载体转化E.coliDH5α，提取质粒，采用酶切和PCR方法鉴定阳性克隆；

（7）重组质粒的诱导表达，将重组质粒pETA、pETAC、pETACY分别转化到E.coliBL21(DE3)中，菌株分别命名为E.coliA、E.coliAC、E.coliACY，挑取含重组质粒的BL21(DE3)单菌落，接种至含50μg/LAmp的液体LB培养基中，37℃培养过夜，加入的甘氨酸终浓度为100mM。然后以1:100的比例接种至20mL含相应抗生素的液体LB培养基中，37℃放大培养至OD600为0.6～0.8，然后降温至28℃，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1mM，继续培养12小时，每隔3小时取1.5mL菌液，4℃10000r/min离心10min，分别收集上清液和菌体；

（8）PT-PCR验证基因的转录：

a．RNA的提取，采用多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒（离心柱型）提取菌株E.coliACY中的RNA，具体操作方法按照试剂盒说明书进行操作；

b．RT-PCR，将提取的RNA作为第一链cDNA合成的模板，依照试剂盒说明书，采用20μl的反应体系，加入各种反应试剂，轻轻混匀，42℃孵育30min，85℃加热5min使EasyScript失活；

取2μl的反转录产物作为PCR模板，分别扩增hemA、Cat及YBi基因，方法同1.3。阳性对照组分别以pETA、pETAC、pETACY质粒为模板扩增hemA、Cat及YBi；

（9）5-氨基乙酰丙酸的测定，ALA分析采用Mauzerall和Granick的分光光度法，无菌操作下，吸取1.5mL的发酵液4℃10000r/min离心10min，取稀释一定倍数的上清液0.4mL加0.4mL2mol/L的乙酸钠(pH=4.6)的缓冲液，0.1mL乙酰丙酮溶液，在沸水中加热15min，取出冷却至室温。取0.3mL反应液与0.3mLEhrlich’s试剂混合，稳定15min后各取0.3mL反应液用酶标仪在570nm下来进行测量其吸光光度值。

实施例2

一、ALAC4相关基因的克隆及共表达载体的构建结果；

将连接在克隆质粒上的hemA、Cat、YBi三个基因片段进行测序，长度分别为1224bp、1524bp、987bp；

所述的hemA基因长度为1224bp，其碱基序列如SEQIDNO:2所示；

所述的cat基因长度为1524bp，其碱基序列如SEQIDNO:3所示；

所述的YBi基因长度为987bp，其碱基序列如SEQIDNO:4所示；

其中，Cat与NC_014215Propionibacteriumshermanii进行比对，结果完全一致。hemA、YBi分别与NC_007493USARhodobactersphaeroides和NC_012892Escherichiacoli进行比对，发现均有一个碱基的差异，一致性均为99.92%。将基因序列翻译为氨基酸序列进行比对，前者有一个氨基酸的差异，一致性为99％，后者一致性为100%；

按照共同表达载体构建的方法，构建重组质粒pETA、pETAC、pETACY，整个构建过程如图2所示。PCR验证结果和酶切验证结果都与理论片段相符，酶切验证结果如图4-6所示。其中，图4为PetA酶切鉴定图谱，如图中所示泳道1：DNAmarkerDL15000(从上至下依次为5.0、3.0、2.0、1.5、1.0、0.75、0.5、0.2kb)；泳道2：限制性内切酶EcoRI和NotI消化的PetA；图5为PetAC酶切鉴定图谱，如图中所示泳道1：DNAmarkerDL5000(从上至下依次为5.0、3.0、2.0、1.5、1.0、0.75、0.5、0.2kb)；泳道2：限制性内切酶NdeⅠ消化的PetAC；图6为PetACY酶切鉴定图谱，如图中所示泳道1：DNAmarkerDL15000(从上至下依次为1.5、1.0、7.5、5.0、2.5、1.0、0.25kb)；泳道泳道2：PetACY质粒；3：限制性内切酶NotI消化的PetACY；

二、hemA、Cat、YBi的转录结果；

将E.coliACY用终浓度为1mmol/L的IPTG诱导12h后，提取其RNA，并进行RT-PCR验证，结果如图7、8所示。结果显示cDNA扩增片段与阳性对照扩增片段大小一致，说明表达载体共表达的三个基因均被转录。其中，图8为RNA提取验证图谱，如图中所示，泳道1为DNAmarkerDL15000(从上至下依次为1.5、1.0、7.5、5.0、2.5、1.0、0.25kb)；泳道2为RNA；图9为RT-PCR结果验证图谱，如图中所示，泳道1为DNAmarkerDL2000(从上至下依次为2.0、1.0、0.75、0.5、0.25、0.1kb)；泳道2、4、6为实验组扩增hemA、Cat、YBi；泳道3、5、7为对照组扩增hemA、Cat、Ybi；

三、共表达hemA和Cat以及hemA、Cat和YBi对ALA产量的影响；

IPTG诱导后，分别对重组菌、对照菌发酵液上清中的ALA含量进行了测定，如表3所示；

在诱导12h后，对照菌中ALA含量为24.5mg/L，重组菌E.coliA和E.coliAC中ALA含量可以达到621mg/L和942mg/L，这是由于在ALA的C4合成途径中，主要利用一种磷酸吡哆醛依赖性的ALA合成酶催化琥珀酰COA和甘氨酸缩合形成ALA，所以5-氨基乙酰丙酸合成酶（hemA）是一个关键限速酶，过表达hemA能提高ALA产量。而在生物合成ALA的代谢途径中，琥珀酰COA是前体物质之一，但是野生型E.coli在有氧环境中，琥珀酰COA仅作为TCA循环中的中间产物，积累量很少，不足以提供ALA的大量合成。以内源乙酰COA和琥珀酸为前体，过表达Cat，ALA产量可以进一步提高；

同样条件下E.coliACY中ALA含量为1124mg/L，是对照菌株积累ALA的6倍。结果表明在重组菌株E.coliACY中，HemA、Cat和YBi共表达催化相关反应，增强了ALA生物合成代谢流，具有协同效应；

表3基因hemA、Cat以及YBi的过量表达对ALA产量的影响

SEQUENCELISTING

<110>河北科技大学

<120>在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因和构建方法

<130>4

<160>4

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>9138

<212>DNA

<213>大肠杆菌种（Escherichiacoli）

<400>1

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<213>大肠杆菌种（Escherichiacoli）

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<210>3

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<213>大肠杆菌种（Escherichiacoli）

<400>3

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<210>4

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<213>大肠杆菌种（Escherichiacoli）

<400>4

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Claims (2)

1.一种基因，其序列如SEQIDNO:1所示。

2.一种如权利要求1所述的基因的构建方法，其特征在于按照以下步骤顺序进行：

（1）以Rhodobactersphaeroides基因组为模板，利用引物hemA-F和hemA-R扩增hemA基因；

引物hemA-F的序列为CGGAATTCGATGGACTACAATCTGGCACTCGATACCGCT；

hemA-R的序列为ATAAGAATGCGGCCGCTCAGGCAACGACCTCGGCG；

相应的酶切位点分别为EcoRI和NotI；

（2）通过以Propionibacteriumshermanil基因组为模板，利用Cat-F和Cat-R扩增Cat基因；

引物Cat-F的序列为GGAATTCCATATGAACGAACGCATCTCCA；

Cat-R的序列为GGAATTCCATATGTCAACGGTAGTGCGAAAGC；

相应的酶切位点分别为NdeI；

（3）ALA分泌基因YBi借助启动子表达：以Escherichiacoli基因组为模板，通过重叠PCR，利用引物Prom-F、Prom-R、Ybi-F、Ybi-R得到含有完整表达盒的YBi基因；

引物Prom-F的序列为AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCCGCATAATCGAAATTAATAC；

Prom-R的序列为ACGTAATGAACCAGGCATTATATCTCCTTCTTATACTT；

Ybi-F的序列为AGAAGGAGATATAATGCCTGGTTCATTACGT；

Ybi-R的序列为AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAATTAATGTCTAATTCTTTTAT；

Prom-F和Ybi-R的酶切位点为NotI；

（4）各基因片段经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收，并与pMD18-Tsimple载体连接，转化E.coliDH5α；

（5）涂布在含100μg/LAmp的LB固体培养基上，蓝白斑筛选的阳性克隆经质粒PCR及酶切鉴定后进行测序；

（6）共同表达载体pETA、pETAC、pETACY的构建

质粒pETDuet-1和质粒pMD18-T-hemA分别用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切，回收目的片段，用T4DNA连接酶将两片段连接得到质粒pETA；将质粒pETA和质粒pMD18-T-Cat分别用限制性内切酶NdeI进行单酶切，回收两目的片段，将Cat基因片段作为插入片段连接到pETA单酶切得到的较大片段上，得到重组质粒pETAC；

质粒pETAC和质粒pMD18-T-YBi分别用限制性内切酶NotI进行单酶切，回收两目的酶切片段，将ALA分泌基因YBi连接到pETAC单酶切得到的较大片段上，得到重组质粒pETACY；将以上构建得到的质粒载体转化E.coliDH5α，提取质粒，采用酶切和PCR方法鉴定阳性克隆；

（7）重组质粒的诱导表达

将重组质粒pETA、pETAC、pETACY分别转化到E.coliBL21(DE3)中，菌株分别命名为E.coliA、E.coliAC、E.coliACY，挑取含重组质粒的BL21(DE3)单菌落，接种至含50μg/LAmp的液体LB培养基中，37℃培养过夜，加入的甘氨酸终浓度为100mM；

然后以1:100的比例接种至20mL的液体LB培养基中，37℃放大培养至OD600为0.6～0.8，然后降温至28℃，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为1mM，继续培养12小时；

（8）PT-PCR验证基因的转录

采用多糖多酚植物总RNA快速提取离心柱型试剂盒提取菌株E.coliACY中的RNA，将提取的RNA作为第一链cDNA合成的模板，采用20μl的反应体系，加入各种反应试剂，轻轻混匀，42℃孵育30min，85℃加热5min使EasyScript失活；

取2μl的反转录产物作为PCR模板，分别扩增hemA、Cat及YBi基因，阳性对照组分别以pETA、pETAC、pETACY质粒为模板扩增hemA、Cat及YBi。