CN102212550A - 转录因子orca3和关键酶g10h双基因共转化提高喜树碱含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种生物技术领域的提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法。从长春花中克隆出CrORCA3和CrG10H基因的编码框序列，构建含上述基因的植物双价高效表达载体，以发根农杆菌介导法遗传转化喜树获得转CrORCA3和CrG10H基因的喜树毛状根。本发明获得的转基因喜树毛状根中喜树碱含量显著提高，喜树碱含量为对照的5.4倍，羟基喜树碱含量为对照的2.3倍。单独转CrORCA3基因的毛状根喜树碱含量比对照提高了1.5倍，单独转CrG10H基因的毛状根喜树碱含量并无明显提高。本发明提供了一种提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法，也为生产具重要临床需求的抗癌药物喜树碱和羟基喜树碱提供了一种新方法。

Description

转录因子ORCA3和关键酶G10H双基因共转化提高喜树碱含量的方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域，特别是一种转录因子ORCA3和关键酶G10H双基因共转化代谢工程策略提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法。

背景技术

喜树碱(Camptothecin，CPT)是最早从中国特有的喜树(Camptotheca acuminata)中提取出来的一种具有显著抗肿瘤活性的生物碱。现有多种喜树碱类药物如依立替康(Irinotecan)和拓扑替康(Topotecan)获得美国FDA(1992)认证，在临床上被广泛用于治疗卵巢癌、直肠癌及白血病等多种恶性肿瘤，全球市场需求十分巨大。目前世界上喜树碱类药物的生产主要是从喜树等植株中提取，然而由于喜树天然资源数量有限，生长十分缓慢，喜树碱及其类似物在植物体内含量又非常低，且提取环节多、费时费力，所以从天然喜树中提取喜树碱的方法已远远不能满足人们对喜树碱日益增长的需求。

多年来，国内外学者围绕着扩大喜树碱药源问题进行了诸多领域的研究如化学全合成，半合成及细胞培养等，并取得了一定的进展。喜树碱的化学全合成虽然已经成功，但因成本太高、产量太低、周期 太长且易造成环境污染等因素而限制了其商业化生产；半合成方法虽然是目前最有效的途径之一，但其前体的提取分离仍然依赖于天然资源的供应；细胞悬浮培养则存在喜树碱含量低微及稳定性较差等问题同样难以实现工业化生产(Hengel et al 1992)。相比之下，利用基因工程技术将喜树碱生物合成途径中的关键酶基因导入产喜树碱的资源植物中，继而获得转基因的发根系或再生植株等，并进行大规模的培养是实现从根本上提高喜树碱含量的最佳途径之一(Lorence and Nessler2004，Lu et al 2008)。

大量研究表明，异胡豆苷合成酶(STR)，色氨酸脱羧酶(Tryptophan decarboxylase，TDC)，香叶醇-10-脱氢酶即牻牛儿醇-10-羟化酶(Geraniol 10-hydroxylase，G10H)及1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(1-Deoxy-D-Xylulose 5-Phosphate Synthase，DXS)等关键酶在包括喜树碱在内的TIAs的生物合成中具有重要作用(Canel et al 1998；De Luca et al 1989； 

-Meyer 1997；Yamazaki et al 2003；McKnight et al 1990；Kutchan 1989；Yamazaki et al 2003；Lu et al 2008)。另外，近年来转录因子正逐渐被认为是一种能有效地调控植物次生代谢途径的新手段。通过超量表达转录因子，能够有效地克服多基因共转化存在的弊端，全面上调能被其调控的相关基因的表达水平，对整个次生代谢途径的调控效果要比单纯依赖单个(或多个)结构基因的增强表达好得多。例如van der Fits和Memelink(2000)在SCIENCE上报道发现一个受茉莉酸甲酯诱导并能够调控植物初级和次生代谢的中央转录调控因子ORCA3(Octadecanoie-responsive Cantharanthus AP2-domain  protein 3)，能增强TIAs生物合成代谢途径中绝大多数催化酶基因的协同表达，从而有效地调控长春花(Catharanthus roseus)中TIAs的生物合成，充分展示了用转录调节因子来调控TIAs生物合成的巨大潜力。ORCA3的发现为调控喜树碱的代谢合成提供了一种新的研究切入点。必须指出的是转录因子并非万能的，单转化一个ORCA3基因，虽然可以调控诸如AS，TDC，DXS，CPR和STR等多个关键酶基因的协同表达，但是有些基因如关键酶基因G10H并不受ORCA3的调控。在ORCA3基因过量表达的细胞中由于关键酶基因G10H的表达不足，从而限制了TIA代谢终产物如长春碱的产量没有得到显著提高。

发明内容

本发明的目的在于克服常规技术中的不足，提供一种有效提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法。

本发明还提供了实现上述方法的重组载体。

本发明利用已克隆的长春花CrORCA3和CrG10H基因，构建含上述基因的植物双价高效表达载体，以发根农杆菌(如C58C1等)为介导，将CrORCA3和CrG10H基因同时导入喜树下胚轴中并再生出毛状根；PCR和荧光定量PCR检测目的基因CrORCA3和CrG10H的整合和表达情况，高效液相色谱测定喜树转基因毛状根中喜树碱含量。

技术方案为：一种用于提高喜树碱含量的重组载体，含有转录因子基因CrORCA3和香叶醇-10-脱氢酶基因CrG10H。

转录因子ORCA3和关键酶G10H双基因共转化提高喜树碱含量的方法，包括如下具体步骤：

(1)将转录因子基因(CrORCA3基因，SEQ ID NO.1，GenBank：EU072424.1)和香叶醇-10-脱氢酶基因(CrG10H基因，SEQ ID NO.2，GenBank：AJ251269.1)插入植物表达载体，构建重组载体；

以长春花幼苗RNA为模板PCR获得CrORCA3和CrG10H基因片段；

植物表达载体可选用pCAMBIA质粒或pBI质粒，尤其是pCAMBIAl304质粒；

(2)将步骤(1)所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；

发根农杆菌可选用发根农杆菌菌株C58C1、发根农杆菌菌株A4或发根农杆菌菌株L BA9402；

(3)利用所构建的含有重组载体的发根农杆菌菌株遗传转化喜树，优选为喜树下胚轴，获得毛状根；

(4)检测步骤(3)毛状根中的CrORCA3和CrG10H基因，取筛选结果为阳性的转基因毛状根克隆；

检测方法为PCR及Southern blotting检测。

PCR阳性的转基因毛状根克隆进行Southern blot检测，证明目的基因CrORCA3和CrG10H已整合到喜树毛状根基因组中；

荧光定量PCR测定CrORCA3和CrG10H在喜树转基因毛状根中的表达情况；高效液相色谱法测定喜树转基因毛状根中喜树碱含量， 进一步筛选喜树碱和羟基喜树碱含量显著提高的喜树转基因毛状根株系。

所述的PCR检测中，分别在植物表达载体上启动插入基因(CrORCA3，CrG10H)表达的组成型表达启动子CaMV35S的内部及插入基因的内部设计上游及下游特异性引物进行DNA的PCR扩增，紫外线下观察到目的条带的株系即为阳性转基因毛状根株系。

所述的荧光定量PCR检测CrORCA3和CrG10H基因的表达情况，具体方法为：对经PCR鉴定为阳性的毛状根克隆进行总RNA的提取并反转成cDNA第一条链，分别设计插入目的基因及看家基因18SrRNA的引物，进行荧光定量PCR扩增，用相对定量法分析CrORCA3和CrG10H基因的相对表达量。

本发明的双关键酶基因共转化策略提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法，采用基因工程方法，将双关键酶基因(CrORCA3，CrG10H)导入喜树下胚轴中，获得了高产喜树碱的喜树毛状根株系。共转CrORCA3及CrG10H基因的毛状根中所检测的喜树碱和羟基喜树碱含量相比于对照组显著提高，是对照组毛状根(非转基因型)的5.4倍和2.3倍。

将一些常规生物学实验方法如载体构建、遗传转化、分子检测、荧光定量PCR分析、喜树碱提取及含量测定等应用于本发明，建立了一种有效提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法，筛选出喜树碱和羟基喜树碱含量大幅度提高的转基因喜树发根系，为生产具重要临床需求 的喜树碱和羟基喜树碱提供了一种新型优质药源，为今后应用生物技术大量生产喜树碱及最终解决喜树碱的药源短缺问题提供一条新途径，也为喜树毛状根商业化生产奠定基础。

将上游转录调控基因ORCA3和关键酶基因G10H构建成双价植物表达载体，通过农杆菌介导法将这两个基因共同转入喜树中，并考察了其对喜树碱合成代谢途径的调控效应及对代谢物产量的影响，最终筛选出喜树碱和羟基喜树碱含量大幅度提高的转基因喜树发根系，为今后应用生物技术大量生产喜树碱及最终解决喜树碱的药源短缺问题提供一条新途径。

附图说明

图1为实施例4荧光定量PCR检测转基因喜树毛状根中CrORCA3和CrG10H基因的表达

具体实施方式

下面结合具体实施例详细阐述本发明。应理解为：这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆(Sambrook等)，或按照制造厂商所提供的试剂或试剂盒所附带的说明书建议的条件。

实施例1长春花CrORCA3及CrG10H基因编码序列的获得

1.1.长春花总RNA的提取及cDNA第一链的合成

使用TIANGEN公司提供的RNA prep pure plant kit从长春花幼苗 中提取总RNA(提取步骤参照试剂盒内的说明书)。用于提取总RNA的长春花幼苗的鲜重量为0.1g左右，在提取过程中样品中的DNA已用DNase工作液清除。将提取的RNA在分光光度计上测定相关的吸光值，计算所提取RNA的纯度及浓度。根据不同RNA样品的浓度通过计算后，分别以0.5μg RNA为起始量，用反转录酶XL(AMV)进行第一链cDNA的合成(操作步骤参照Promega公司提供的相关说明书)。

1.2.CrORCA3和CrG10H编码序列特异引物的设计及目的基因片段的获得

根据从NCBI获得的所述CrORCA3基因的编码序列(SEQ IDNO.1)和CrG10H基因的编码序列(SEQ ID NO.2)，分别设计扩增出完整编码框的上下游特异引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建植物表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank上登录的长春花CrORCA3基因(SEQ ID NO.1)和CrG10H基因(SEQ ID NO.2)的编码序列完全一致。

实施例2含长春花CrORCA3及CrG10H基因的植物表达载体的构建

2.1.中间载体pCAMBIAl304⁺的构建

以pBIl21和pCAMBIAl304为材料，构建植物表达载体 pCAMBIAl304⁺。具体地，HindIII/EcoRI双酶切pBIl21和pCAMBIAl304；回收pBIl21-GUS表达盒及pCAMBIAl304大片段；连接转化，挑取单克隆菌落抽提质粒酶切验证。结果表明，植物表达载体pCAMBIAl304⁺构建成功。

2.2.植物表达载体pCAMBIAl304⁺-CrG10H的构建

在上述构建成功的pCAMBIAl304⁺基础上，用从长春花中克隆到的CrG10H基因替换其上的GUS基因。具体地，BamHI/SacI双酶切pMD18T-CrG10H和pCAMBIAl304⁺；回收CrG10H基因和pCAMBIAl304⁺大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，CrG10H基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIAl304⁺中，从而获得含CrG10H基因的植物表达载体pCAMBIAl304⁺-CrG10H。

2.3.植物表达载体pCAMBIAl304⁺-CrORCA3-CrG10H的构建

以上述的pCAMBIAl304⁺-CrG10H为基础，用从长春花中克隆的CrORCA3基因替换pCAMBIAl304⁺-CrG10H上的GFP+GUS基因。具体地，BglII/BstEII双酶切pMD18T-CrORCA3和pCAMBIAl304⁺-CrG10H；回收CrORCA3基因及pCAMBIAl304⁺-CrG10H大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，CrORCA3基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIAl304⁺-CrG10H中，从而获得含CrORCA3和 CrG10H的植物表达载体pCAMBIAl304⁺-CrORCA3-CrG10H。

本实施例将喜树碱合成途径关键酶基因CrORCA3和CrG10H可操作性地连于表达调控序列，形成含CrORCA3和CrG10H基因的植物表达载体pCAMBIAl304⁺-CrORCA3-CrG10H，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高喜树中喜树碱含量。

实施例3发根农杆菌介导CrORCA3和CrG10H基因遗传转化喜树获得转基因毛状根

3.1.含植物表达载体pCAMBIAl304⁺-CrORCA3-CrG10H发根农杆菌工程菌的获得

将实施例2中含CrORCA3和CrG10H基因的植物双价表达载体pCAMBIAl304⁺-CrORCA3-CrG10H转入发根农杆菌C58C1中，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含CrORCA3和CrG10H基因的植物表达载体已成功构建到发根农杆菌菌株C58C1中。

3.2.发根农杆菌介导CrORCA3，CrG10H基因遗传转化喜树

3.2.1.外植体的预培养

剪取喜树无菌下胚轴(1-3cm)，接种到预培养培养基(B₅)上，25℃暗培养2d。

3.2.2.农杆菌与外植体的共培养

将上述经预培养的喜树下胚轴外植体，放入含活化好的上述发根农杆菌工程菌的1/2MS悬液中浸泡10分钟(轻轻摇晃使外植体与菌 液充分接触)后，取出浸染后的喜树下胚轴用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基B₅中，暗培养2d。

3.2.3.毛状根的诱导和继代培养

将上述的共培养2d的喜树外植体转接到除菌固体培养基(B₅+Cef500mg/L)中，25℃16h/8h光照培养2-3周左右，可从外植体伤口处长出毛状根。剪下(大约1-3cm)的毛状根，接种于B5+Cef500mg/L培养基中暗培养3周。转入B5+Cef 250mg/L培养基中继代筛选，每2周继代培养一次。经过数次继代后即可完全脱菌。再将良好的喜树毛状根转入无抗生素的B5培养基上继续暗培养20d左右。

3.3.转基因喜树毛状根的PCR检测

3.3.1.转基因毛状根基因组DNA的提取

本发明采用CTAB法提取转基因毛状根基因组DNA。剪取3.2.3中除菌完毕的转基因毛状根5cm左右放入1.5ml离心管中，加入适量的石英砂及600μl CTAB裂解液(65℃预热，含1％β巯基乙醇)，用研磨棒将材料充分磨碎。置于65℃水浴锅中40-50分钟，其间多次混匀样品(次/10min)，冷却至室温后加入等入体积的苯酚，轻轻颠倒混匀乳化10min，12000rpm离心20min，小心吸取上清于新EP管中，加入等体积苯酚/氯仿(1∶1)，轻轻混匀，12000rpm离心20min，缓慢吸取上清于新EP管中，加等体积的氯仿混匀，12000rpm离心20min，缓慢吸取上清于新EP管中，加2倍体积预冷的无水乙醇，析出沉淀。用枪头将沉淀挑到新EP管中，加入75％乙醇4℃洗涤过夜。 次日用75％乙醇再洗涤两次，吸出上清，室温晾干，加入30-50μl水溶解沉淀，用RNA酶处理后于-80℃超低温冰箱冻存，备用。

3.3.2.引物设计及PCR检测

在pCAMBIAl304⁺-CrORCA3-CrG10H上启动插入目的基因表达的组成型表达启动子CaMV35S及插入基因上分别设计特异性上游及下游引物，用PCR方法对上述毛状根的总DNA进行分子检测，紫外线下观察到目的条带的株系即为阳性转基因喜树毛状根株系。引物序列为：

结果表明，利用上述特异引物，在一部分转基因毛状根中能检测到和阳性对照(pCAMBIAl304⁺-CrORCA3-CrG10H质粒为模板)大小相当的PCR产物。而以pCAMBIAl304⁺空载体遗传转化喜树所发出的毛状根及野生型喜树植株根的基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。结果说明CrORCA3，CrG10H基因已经整合到喜树基因组中。

本实施例将所述的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化喜树的含CrORCA3和CrG10H基因植物表达载体的发根农杆菌菌株C58C1，利用所构建的发根农杆菌菌株遗传转化喜树细胞，获得经PCR检测为阳性克隆的转基因毛状根。转基因喜树毛状根的获得为筛选获得高产喜树碱的毛状根提供了直接素材。

3.4.转基因喜树毛状根的Southern blot检测

首先分别提取PCR阳性的转基因喜树毛状根和携带pCAMBIAl304⁺质粒的农杆菌诱导出的喜树毛状根(阴性对照)的基因组DNA，分别取30μg DNA用BamHI内切酶过夜酶切，酶切产物和未酶切的pCAMBIAl304⁺-CrORCA3-CrG10H质粒(阳性对照)上样于0.8％琼脂糖凝胶，电泳分离后转移到尼龙膜上。然后将膜与地高辛标记的CrORCA3和CrG10H基因探针分别在杂交炉内42℃杂交过夜，之后先用2×SSC，0.1％SDS溶液在15-25℃洗膜2×5min，再用0.5×SSC，0.1％SDS溶液在65℃洗膜2×15min。最后，将膜与胶片共同曝光6h(详细操作参照分子克隆手册)。

利用Southern blot分析了PCR阳性的7个独立的转基因喜树毛状根克隆，结果显示，7个毛状根克隆中有6个克隆有一个或多个杂交信号。而携带1304+质粒的农杆菌诱导出的对照组喜树毛状根则没有显示出杂交信号。表明CrORCA3和CrG10H已经整合到喜树毛状根的基因组中。

实施例4荧光定量PCR检测转基因喜树毛状根中CrORCA3和CrG10H基因的表达

4.1.毛状根液体培养

选择实施例3中生长快且分子检测为阳性的毛状根，在超净工作台上剪取2-3cm用无菌水蒸馏水冲洗掉其表面上的琼脂后接入装有 200ml B₅液体培养基的培养瓶中100rpm，25℃黑暗下培养，每20天更换新鲜B₅液体培养基继代一次，80天后收获，取适量新鲜毛状根用吸水纸吸干表面水分后，用锡箔纸包好浸入液氮中冷冻后保存于-80℃用于RNA提取，其余毛状根烘干后用于喜树碱含量提取。

4.2.引物的设计和合成

根据关键酶基因CrORCA3和CrG10H的编码序列分别设计引物用于检测喜树毛状根中的CrORCA3和CrG10H基因的表达情况，看家基因18SrRNA用来作为内参。所用引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列为：

4.3.RNA的提取、标准品的制备和标准工作曲线

参照实施例1中所述方法，从喜树毛状根中提取RNA，用DNaseI除去RNA中基因组DNA，用反转录酶进行第一链cDNA的合成，再以第一链cDNA为模版，分别用2对引物进行PCR扩增获得相应的2条基因的扩增条带。

PCR产物电泳回收，用紫外分光光度计测定所有目的基因原液的 纯度和浓度。标准品用10倍梯度稀释法得到系列浓度的目的基因标准品。每个标准品用荧光定量PCR方法测定，得到Ct值。以每个标准浓度的对数对它们的Ct值作图，得到满意的2个基因标准工作曲线。得到的2个基因相关系数(斜率-3.3左右，相关系数＞0.95)表明初始模板浓度的对数与循环阈值Ct之间存在着极强的线性关系，这为定量的准确性提供了基础。标准曲线同时显示，荧光定量PCR(FQ-PCR)反映线形范围极宽，可达5个log值的范围(10-9-10-5μg/μL)，敏感度高，起始浓度在10-9μg/μL也可获得良好的定量效果。参照标准品工作曲线，可以准确地得到样品中起始模板的浓度

4.4.荧光定量PCR检测看家基因18SrRNA基因的表达

为调整各样品间在RNA抽提和逆转录过程中反应效率的差异，检测目的基因表达量的同时需检测看家基因18SrRNA基因的表达。检测18SrRNA和目的基因的荧光定量PCR的反应体系如下：

PCR反应条件：热启动和变性94℃15min，40个循环(94℃变性15sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec并检测荧光，80℃20sec 并检测荧光)。

4.5.融解曲线分析和荧光定量PCR产物的检测

所有PCR产物经40个循环完成以后，以0.2℃/sec的速度使温度从72℃缓慢上升到95℃。扩增产物双链DNA随温度的升高逐渐变性解链为单链，SYBR Green I染料逐渐释放出来，荧光信号逐渐减弱，仪器每升高0.2℃检测一次反应管内荧光强度的变化，最后得到扩增产物荧光信号强度对温度变化的融解曲线，定量PCR仪自动以dF/dT对温度T作图。根据融解曲线的形状和峰值对反应管中的扩增产物进行鉴定。对消除引物二聚体对Ct值的影响，将每个循环中的读板温度调高到80℃，在这一温度下双链的引物二聚体变性，释放出结合的SYBR-Green染料，从而消除了引物二聚体产生的荧光信号。

根据标准曲线，求出各待测样品cDNA中各目的基因的原始浓度，然后以每份cDNA中目的基因浓度除以每份cDNA中的看家基因18SrRNA的浓度对每个样品中目的基因的浓度进行校正。每份样品目的基因的校正浓度除以非转化对照根中该目的基因的校正浓度，则表示样品对非转化对照根的相对表达量，非转化对照根的表达量即为1，见图1。

实施例5利用HPLC测定转基因喜树毛状根中喜树碱含量

5.1.色谱条件及标准品贮备液的配制

高效液相色谱测定喜树碱含量的条件：色谱柱AlltechEconosi C18 不锈钢柱，流动相为乙腈∶水(35∶65)，检测波长254nm，柱温30℃，流速1ml/min，进样量20μl。

精密称取2.00mg喜树碱和羟基喜树碱标准品，置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得质量浓度为40.00μg/mL的标准品贮备液，保存于-20℃备用。

本发明中流动相乙腈∶水在35∶65时，喜树碱和的羟基喜树碱保留时间分别为5.208min和8.675min，峰型良好，且可保证良好分离。

5.2.标准曲线的制作

将上述标准品贮备液品分别取5ul，10ul，15ul，20ul，30ul在相应色谱条件下进样，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品浓度(X，μg/ml)进行回归分析。结果表明，本发明中喜树碱在2.5-25mg/L范围内呈现良好的线性关系。喜树碱和羟基喜树碱标准品的峰面积(Y)对浓度(X)的线性回归方程为：Y＝1556.26X-1107.64，r＝0.9997。

5.3.转基因毛状根喜树碱含量的提取及测定

将实例4中收获并烘干的转基因喜树毛状根放入研钵中充分研磨，取100mg毛状根干粉加入甲醇10ml，超声提取30min，50℃放置过夜，次日拿出离心(12000rpm，10min)，吸取上清萃取液后，再加入甲醇10ml，超声30min，离心(12000rpm，10min)，收集两次的上请萃取液减压蒸发，残余物重新用1ml的色谱甲醇溶解，样品用0.22μM 的有机相滤膜过滤后各取20μl，注入高效液相色谱仪，记录各组分峰面积，代入线性回归方程，计算即得样品喜树碱和羟基喜树碱含量。

在本发明中共转CrORCA3及CrG10H基因显著提高喜树状根中喜树碱含量。共转CrORCA3及CrG10H基因的毛状根中所检测的喜树碱和羟基喜树碱含量相比于对照组显著提高，平均含量为5.29mg/gDW和0.44mg/g DW，是非转基因型对照组毛状根(0.98mg/g和0.19mg/g)的5.4倍和2.3倍。单独转CrORCA3基因的毛状根喜树碱含量比对照提高了1.5倍，单独转CrG10H基因的毛状根喜树碱含量并无明显提高。

本实施例采用HPLC法测定了转基因喜树毛状根中喜树碱含量。结果表明共转CrORCA3和CrG10H基因的喜树毛状根中喜树碱含量比对照组显著提高，为规模化生产喜树碱并解决喜树碱匮乏提供了一种可能的解决方法。

上述各实施例中的植物表达载体pCAMBIAl304还可以用pCAMBIA系列其他种类及pBI系列替代，或者发根农杆菌菌株C58C1用A4或LBA9402菌株代替，效果相同。

Claims (7)

1.转录因子ORCA3和关键酶G10H双基因共转化提高喜树碱含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将转录因子基因CrORCA3和香叶醇-10-脱氢酶基因CrG10H插入植物表达载体，构建重组载体；

(2)将步骤(1)所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；

(3)利用所构建的含有重组载体的发根农杆菌菌株遗传转化喜树，获得毛状根；

(4)检测步骤(3)毛状根中的CrORCA3和CrG10H基因，取筛选结果为阳性的转基因毛状根克隆。

2.权利要求1所述转录因子ORCA3和关键酶G10H双基因共转化提高喜树碱含量的方法，其特征在于，步骤(1)中的CrORCA3和CrG10H基因片段以长春花幼苗RNA为模板PCR获得。

3.权利要求1所述转录因子ORCA3和关键酶G10H双基因共转化提高喜树碱含量的方法，其特征在于，步骤(1)中的植物表达载体为pCAMBIA质粒或pBI质粒。

4.权利要求1所述转录因子ORCA3和关键酶G10H双基因共转化提高喜树碱含量的方法，其特征在于，步骤(2)所述的发根农杆菌为发根农杆菌菌株C58C1、发根农杆菌菌株A4或发根农杆菌菌株LBA9402。

5.权利要求1所述转录因子ORCA3和关键酶G10H双基因共转化提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法，其特征在于，步骤(3)中用含有重组载体的发根农杆菌菌株遗传转化喜树下胚轴，获得毛状根。

6.权利要求1所述转录因子ORCA3和关键酶G10H双基因共转化提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法，其特征在于，步骤(4)所述的检测方法为PCR及Southern blotting检测。

7.一种用于提高喜树碱含量的重组载体，其特征在于，含有转录因子基因CrORCA3和香叶醇-10-脱氢酶基因CrG10H。