CN101962650B - 转SmGGPPS基因提高丹参毛状根丹参酮含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术，一种转SmGGPPS基因提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。现有技术丹参生长周期长；丹参酮产量低，无法满足人类医疗对丹参酮的需求。本发明从丹参中克隆SmGGPPS基因的编码序列，并构建其植物高效表达载体，遗传转化丹参叶片获得转SmGGPPS基因的丹参毛状根，半定量RT-PCR分析SmGGPPS基因在丹参转基因毛状根中的表达情况，高效液相色谱法测定丹参转基因毛状根中包括隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA的总丹参酮含量，DPPH清除自由基法测定丹参转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性。本发明的优点是：显著提高丹参毛状根中总丹参酮含量；发明效果可靠；丹参酮成本低；生产过程无环境污染。

Description

转SmGGPPS基因提高丹参毛状根丹参酮含量的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术，具体地说是一种转SmGGPPS基因提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。

背景技术

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge），又名紫丹参、红根、赤参、活血参，唇形科鼠尾草属，多年生草本植物。丹参是祖国医学中的重要传统中药，临床用于心血管疾病的治疗。丹参药用成分包括：丹参酮类脂溶性二萜醌类化合物和水溶性酚酸类化合物。现代技术表明丹参所含的丹参酮类物质：如隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA，具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗菌消炎的多种药理活性，具有巨大的市场需求。现有技术丹参酮是从天然丹参植株的根茎中提取获得。由于丹参长期栽培品质退化；活性成分含量降低；同时丹参生长周期长；使得丹参酮产量低，无法满足人类医疗对丹参酮的需求。丹参酮结构复杂、化学合成过程繁琐、人工合成丹参酮成本高；而且生产过程易造成环境污染；离体条件下的细胞培养方法获得的细胞活性成分积累量低，稳定性差。因此为了满足人类心血管疾病的治疗需要，发明一种提高丹参酮产量的新方法是治疗心血管疾病和中医药事业发展的迫切重要任务。

已有技术表明，牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶GGPPS催化15碳的法呢基焦磷酸FPP与5碳分子异戊烯基焦磷酸IPP合成20碳的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸GGPP，为丹参酮二萜类物质提供生物合成的关键前体物质GGPP。牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因SmGGPPS是丹参酮合成中的限速酶基因，是丹参酮代谢工程的重要靶点。

本发明采用基因工程技术，将关键酶基因SmGGPPS遗传转化丹参，打破丹参酮生物合成的瓶颈，获得高产丹参酮的丹参毛状根或植株，为提高丹参酮产量开辟了新的途径，对解决丹参酮药源紧缺具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是利用基因工程技术，发明一种提高丹参毛状根丹参酮含量，提高丹参酮产量的方法。

本发明的目的是这样实现的：

一种转SmGGPPS基因提高丹参毛状根丹参酮含量的方法，步骤如下：

(1)从丹参中克隆牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因SmGGPPS；将SmGGPPS基因连于表达调控序列，形成含SmGGPPS基因的植物表达载体；

(2)将含SmGGPPS基因的植物表达载体转化发根农杆菌，获得含SmGGPPS基因的发根农杆菌菌株；

(3)将步骤（3）所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得PCR检测为阳性的转基因毛状根克隆；

(4)半定量RT-PCR测定丹参转基因毛状根中SmGGPPS基因的表达；

(5)高效液相色谱法测定丹参转基因毛状根中丹参酮含量，筛选丹参酮含量显著提高的转基因丹参毛状根株系；

(6)DPPH清除自由基法测定丹参转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性。

步骤（3）所述的PCR检测方法如下：

分别设计发根位点基因rolB、潮霉素磷酸转移酶基因hpt的特异PCR引物；

启动插入基因SmGGPPS表达的组成型启动子CaMV35S；

启动子内部、插入基因的内部设计上游及下游特异性引物，进行DNA扩增；

紫外线下观察目的条带株系，为阳性转基因丹参毛状根株系。

步骤（4）所述半定量RT-PCR检测方法如下： 

对PCR鉴定为阳性的毛状根克隆进行总RNA的提取，统一定量到0.5μgRNA反转录成30 μl体系的cDNA；

分别设计插入目的基因及看家基因18S rRNA的引物，以相同量的cDNA为模板进行半定量RT-PCR扩增；

分析外源SmGGPPS基因的相对表达量情况。

步骤（5）所述的高效液相色谱法如下：

色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为体积比65：35的乙腈和水；检测波长270 nm，柱温30 ℃，流速1ml／min，进样量20μl。

步骤（6）丹参酮的抗氧化活性的测定方法为：

从丹参转基因毛状根中提取丹参酮；

将丹参酮样品稀释为浓度梯度：0.25 μg/ml、0.5 μg/ml、1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml的甲醇溶液各1ml；

向上述溶液分别加入0.2 mM的甲醇溶液1ml；

所得产物25℃下保温30 min；

在分光光度计下517 nm测吸收值。

本发明将载体构建、遗传转化、分子检测、半定量RT-PCR分析、丹参酮提取及含量测定、DPPH清除自由基法测定丹参转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性等生物学和基因技术综合应用，发明了一种有效提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。

本发明包括如下具体步骤：

从丹参中克隆牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因SmGGPPS；

把SmGGPPS基因可操作性地连于表达调控序列，构成含SmGGPPS基因的植物表达载体；

将上述含SmGGPPS基因的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的含SmGGPPS基因植物表达载体的发根农杆菌工程菌株；

利用上述构建成功的发根农杆菌工程菌株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性的转基因毛状根株系；

半定量RT-PCR测定丹参转基因毛状根中SmGGPPS基因的表达；

高效液相色谱法测定丹参转基因毛状根中丹参酮含量，筛选丹参酮含量显著提高的转基因丹参毛状根株系；

利用DPPH清除自由基法测定丹参转基因毛状根中总丹参酮的抗氧化活性。

所述的PCR检测中，分别设计发根位点基因rolB, 潮霉素磷酸转移酶基因hpt的特异PCR引物，并在启动插入基因SmGGPPS表达的组成型表达启动子CaMV35S的内部及插入基因的内部分别设计上游及下游特异性引物进行DNA的PCR扩增，紫外线下观察到目的条带的株系即为阳性转基因毛状根株系。

本发明所述的半定量RT-PCR测定丹参转基因毛状根中丹参酮生物合成关键酶基因SmGGPPS的表达的方法为：对经PCR鉴定为阳性的毛状根株系进行总RNA的提取，并定到同一量的总RNA反转成cDNA第一条链体系作为模板，分别设计插入目的基因及看家基因18SrRNA的引物，取相同量的上述cDNA第一链体系为模板进行半定量RT-PCR扩增,分析SmGGPPS的相对表达量情况。

所述的高效液相色谱测定丹参酮含量的条件如下：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为65：35的乙腈和水，检测波长270 nm，柱温30 ℃，流速1ml／min，进样量20μl。

所述的DPPH清除自由基法测定丹参转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性的方法为：将从丹参转基因毛状根中提取收集的丹参酮样品稀释成浓度梯度0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml的甲醇溶液各1 ml，然后加入0.2 mM的DPPH甲醇溶液1ml，做为自由基来源，在25℃下保温30 min，样品在分光光度计517nm下测吸收值。

本发明转SmGGPPS基因的丹参毛状根中所检测的总丹参酮，包括隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量与对照组相比显著提高，其中丹参酮Ⅰ的含量提高最为明显。转SmGGPPS基因的丹参毛状根总丹参酮的平均含量为1.897 mg／g DW；对照毛状根总丹参酮的平均含量0.475 mg／g DW，相比为3.99倍。在测试的转SmGGPPS基因丹参毛状根株系中，50号克隆G50总丹参酮含量最高，为2.477mg／g DW，是对照组的5.21倍；其中丹参酮Ⅰ的含量为1.504 mg／g DW，对照0.149 mg／g DW，相比为10.09倍，提高最为明显。

本发明为提高丹参酮产量、缓解丹参酮药源紧缺、满足人类治疗心血管疾病的需要起到重要作用。

本发明的优点是：

1、显著提高丹参毛状根中总丹参酮含量；

2、发明方法效果可靠；

3、丹参酮成本低；

4、生产过程无环境污染。

附图说明

图1为除菌培养4-5周的丹参毛状根。

图2为转基因毛状根SmGGPPS基因的PCR检测：

其中M,DL-2000 Marker(100—2,000bp)；

PC,pCAMBIAl304⁺-SmGGPPS质粒阳性对照；

NC,阴野生型丹参性对照；

BC,pCAMBIAl304⁺质粒遗传转化丹参获得的毛状根空白对照；

G28-G56为SmGGPPS基因遗传转化丹参获得的不同转基因株系。

图3为液体培养的丹参转基因毛状根。

图4为转基因丹参毛状根RT-PCR；

图中SmGGPPS A,SmGGPPS B 分别代表总SmGGPPS 及内源SmGGPPS 基因的表达,18S rRNA 基因作为内参；

BC,pCAMBIAl304⁺质粒遗传转化获得的丹参毛状根空白对照；

G28—G56为SmGGPPS基因遗传转化丹参获得的不同转基因株系。

图5为丹参转SmGGPPS基因株系平均丹参酮含量图；

CT，隐丹参酮；T1，丹参酮Ⅰ；T2A，丹参酮ⅡA；TT，总丹参酮；

G，转SmGGPPS基因丹参毛状根株系；

BC,pCAMBIAl304⁺质粒遗传转化丹参获得的毛状根空白对照。

图6为DPPH自由基清除活性随丹参酮浓度变化趋势图；

G50,SmGGPPS基因遗传转化丹参获得的第50号毛状根克隆;

BC，pCAMBIAl304⁺质粒遗传转化丹参获得的毛状根空白对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法操作，或者按照制造商提供的试剂、试剂盒说明书规定的条件操作。

实施例1。

（1）丹参总RNA的提取及cDNA第一链的合成：

使用TIANGEN公司提供的RNA prep pure plant kit，按照试剂盒内说明书规定的步骤，从丹参转基因毛状根中提取总RNA。用于提取总RNA的丹参转基因毛状根的鲜重量为0.1g，提取过程样品中的DNA用DNase工作液清除。将提取的RNA在分光光度计上测定吸光值，计算提取RNA的纯度及浓度。不同RNA样品的浓度通过计算后，分别以0.5μg RNA为起始量，用反转录酶XL(AMV)进行第一链cDNA的合成，操作步骤按照Promega公司提供的说明书。

（2）SmGGPPS编码序列特异引物的设计及目的基因片段的获得：

根据所述SmGGPPS基因的编码序列（SEQ ID NO.1）,设计扩增出完整编码框的上下游特异引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，构建植物表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。测序结果表明，所克隆的序列与实验室在GENBANK上登录的丹参SmGGPPS (GenBank Accession No.FJ643617)的编码序列完全一致。

实施例2

含SmGGPPS基因的植物表达载体的构建。

（1）中间载体pCAMBIAl304⁺的构建：

以pBIl21和pCAMBIAl304为材料，构建植物表达载体pCAMBIAl304⁺。具体地为HindIII／EcoRI双酶切pBI121和pCAMBIAl304；回收pBIl21-GUS表达盒及pCAMBIAl304大片段；连接转化，挑取单克隆菌落抽提质粒酶切验证。结果表明，植物表达载体pCAMBIAl304⁺构建成功。

（2）植物表达载体pCAMBIAl304⁺-SmGGPPS的构建：

在上述构建成功的pCAMBIAl304⁺基础上，使用从丹参克隆的SmGGPPS基因替换上述GUS基因。具体方法为BamHI／SacI双酶切pMD18T-SmGGPPS和pCAMBIAl304⁺；回收SmGGPPS基因和pCAMBIAl304⁺大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，SmGGPPS基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIAl304⁺中，从而获得含SmGGPPS基因的植物表达载体pCAMBIAl304⁺-SmGGPPS。

本实施例将丹参酮生物合成途径关键酶基因SmGGPPS可操作性地连于表达调控序列，形成含SmGGPPS基因的植物表达载体pCAMBIAl304⁺-SmGGPPS，该表达载体可用于通过代谢工程策略提高丹参中丹参酮含量。

实施例3

发根农杆菌介导SmGGPPS基因遗传转化丹参获得转基因毛状根。

（1）含植物表达载体pCAMBIAl304⁺-SmGGPPS发根农杆菌工程菌的获得：

将实施例2中含SmGGPPS基因的植物表达载体pCAMBIAl304⁺-SmGGPPS转入发根农杆菌C58C1中，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含SmGGPPS基因的植物表达载体已成功构建到发根农杆菌菌株C58C1中。

（2）发根农杆菌介导SmGGPPS基因遗传转化丹参。

（3）外植体的预培养：

剪取丹参健壮无菌苗叶片0.5 cm²，接种到预培养培养基MS上，25 ℃暗培养2d。

（4）农杆菌与外植体的共培养：

将上述经预培养的丹参叶片外植体，放入含活化好的上述发根农杆菌工程菌的1／2MS悬液中浸泡10分钟，轻轻摇晃，使外植体与菌液充分接触后，取出浸染后的丹参叶片用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养基1／2 MS中，暗培养3-4d。

（5）毛状根的诱导和继代培养：

将上述共培养3-4d的丹参外植体转接到除菌固体培养基1／2 MS+Cef 500 mg／L中，25℃暗培养2周，从外植体伤口处长出毛状根。将已发根的丹参外植体转接到除菌固体培养基1／2 MS+Cef 300 mg／L上，25℃暗培养2周毛状根长至3 cm以上，如图1。剪取单一毛状根作为无性系，继续接种于除菌培养基1／2 MS+Cef 100 mg／L中暗培养两周，直至无农杆菌溢出。

（6）转基因丹参毛状根的PCR检测：

采用CTAB法提取转基因毛状根基因组DNA。剪取除菌完毕的转基因毛状根5 cm左右放入1.5 ml离心管中，加入适量的石英砂及经65℃预热，含1% β巯基乙醇的CTAB裂解液600μl，用研磨棒将材料充分磨碎。置于65℃水浴锅中40-50分钟，搅拌混匀样品，每次/10 min，重复3次；冷却至室温后加入等体积的苯酚，轻轻颠倒混匀乳化10 min，12000rpm离心20 min；吸取上清于新EP管中，加入体积比1:1的苯酚/氯仿，轻轻混匀，12000 rpm离心20 min，缓慢吸取上清于新EP管中，再加氯仿混匀；12000rpm离心20 min；缓慢吸取上清于新EP管中，加2倍体积预冷的无水乙醇，析出沉淀。用枪头将沉淀挑到新EP管中，加入75%乙醇4 ℃洗涤过夜。次日用75%乙醇再洗涤两次，吸出上清，室温晾干，加入30-50μl水溶解沉淀，用RNA酶处理后于-80 ℃超低温冰箱冻存，备用。

（7）引物设计及PCR检测：

分别设计发根位点基因rolB, 潮霉素磷酸转移酶基因hpt的特异PCR引物，并在pCAMBIAl304⁺-SmGGPPS上，启动插入目的基因表达的组成型表达启动子CaMV35S的内部及插入基因SmGGPPS上，分别设计特异性上游及下游引物，用PCR方法对上述毛状根的总DNA进行分子检测。结果表明，利用上述特异引物，在一部分转基因毛状根中检测到和阳性对照大小相当的PCR产物。而pCAMBIAl304⁺空载体遗传转化丹参所获得的毛状根及野生型丹参植株根的基因组DNA为模板时，则检测不到插入基因SmGGPPS的存在，如图2所示；说明SmGGPPS基因已经整合到丹参基因组中。

本实施例将所述的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的含SmGGPPS基因植物表达载体的发根农杆菌菌株C58C1，利用构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参细胞，获得经PCR检测为阳性克隆的转基因毛状根。转基因丹参毛状根的获得为筛选获得高产丹参酮的毛状根提供了直接素材。

实施例4

半定量RT-PCR检测丹参转基因丹参毛状根中SmGGPPS基因的表达。

（1）毛状根液体培养：见图3

选择实施例3中生长快、分枝好的毛状根，在超净工作台上剪取2-3 cm，用无菌蒸馏水冲洗掉表面上的琼脂，接入装有200ml 1／2 MS液体培养基的培养瓶中100 rpm，25℃黑暗下培养，每20天更换新鲜1／2 MS液体培养基继代一次，80天后收获；取部分新鲜毛状根用吸水纸吸干表面水分；并用锡箔包好浸入液氮中-80 ℃冷冻，用于提取RNA；其余毛状根烘干后用于提取丹参酮。

（2）引物的设计和合成：

根据丹参酮生物合成代谢途径关键酶基因SmGGPPS的编码序列设计引物，用于检测丹参毛状根中总的SmGGPPS表达情况。SmGGPPS为丹参来源基因，通过在SmGGPPS的3’编码序列上设计一个下游引物和该基因上的上游引物配对，检测内源基因的表达情况，转入的外源目的基因仅是基因的编码框序列，不带有5’及3’非编码序列，看家基因18S rRNA用来作为内参；所用引物由上海生工生物工程公司合成。

（3）RNA的提取及cDNA第一链的合成：方法同实施例1中的步骤（1）。

（4）半定量RT-PCR检测SmGGPPS及看家基因18S rRNA基因的表达，以相同量的上述cDNA第一链为模板，分别用上述设计的引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下：

MilliQ                   15.75 μl

dNTP（2mM）                2.5 μl

10×Buffer（Mg²⁺-）         2.5 μl

Mg²⁺                        1.5 μl

F(上游引物)                  1 μl

R(下游引物)                  1 μl

模板                        0.5μl

Taq酶                      0.25μl

总体积                      25 μl

PCR反应条件：94℃10 min，30个循环，94℃变性45 sec，55 ℃退火60 sec，72 ℃延伸100 sec，72 ℃ 10 min。看家基因18S rRNA基因检测的PCR反应条件中将循环数改为20；结果显示，SmGGPPS基因在丹参转基因毛状根克隆中都过量表达且表达量都强于对照组，但不同克隆之间的表达量有一定的差异，见图4。

本实施例采用半定量RT-PCR技术测定丹参转基因毛状根中SmGGPPS基因的表达情况，为分析SmGGPPS基因在丹参酮合成过程中所起的作用提供一定的依据。

实施例5

利用HPLC测定转基因丹参毛状根中丹参酮含量。

（1）色谱条件及标准品贮备液的配制：

色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相为体积比65 ：35的乙腈、水混合溶液。检测波长270 nm，柱温30 ℃，流速1 ml／min，进样量20μl；

    精密称取隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA标准品分别配置成浓度为36 μg/ml，36 μg/ml，22 μg/ml标准品贮备液，保存于-20 ℃备用。

    （2）标准曲线的制作：

本发明中流动相乙腈：水在体积比65：35时，隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA的保留时间分别为18.90 min, 20.53 min和34.00 min，三种丹参酮成分完全分离，且峰型良好。将上述标准品贮备液品分别取5 ul，10 ul，20 ul，30 ul，40 ul在相应色谱条件下进样，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积 (Y) 对标准品浓度 (X，μg/ml) 进行回归分析。结果表明，本发明中隐丹参酮在9-72 ug／ml、丹参酮Ⅰ在9-72 μg／ml、丹参酮ⅡA在5.5-44 μg／ml范围内呈现良好的线性关系。

（3）转基因毛状根丹参酮含量的提取及测定：

将实例4中收获并烘干的转基因丹参毛状根放入研钵中充分研磨，取200 mg毛状根干粉加入体积比3 ：1的甲醇、二氯甲烷溶液16ml，超声处理60 min。室温放置过夜，次日取出12000rpm，离心10 min，吸取上清萃取液真空干燥；残余物重新用1ml的色谱甲醇：二氯甲烷体积比3 ：1的混合液体溶解；样品用0.22 μM的滤膜过滤后各取20 μl，注入高效液相色谱仪，记录各组分峰面积，代入线性回归方程，计算即得样品丹参酮含量。

本发明转SmGGPPS基因毛状根中检测的包括隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA的总丹参酮含量，与对照组相比显著提高，其中丹参酮Ⅰ的含量提高最为明显。转SmGGPPS基因的丹参毛状根总丹参酮的平均含量为1.897 mg／g DW，是对照组毛状根0.475 mg／g DW的3.99倍；在测试的转SmGGPPS基因丹参毛状根株系中，50号克隆（G50）总丹参酮含量最高2.477 mg／g DW，是对照组的5.21倍，如图5所示。其中丹参酮Ⅰ的含量为1.504 mg／g DW，提高最为明显，是对照组0.149 mg／g DW的10.09倍。

本实施例采用HPLC法测定了丹参转基因毛状根丹参酮含量。结果表明转SmGGPPS基因的丹参毛状根总丹参酮含量比对照组显著提高，其中丹参酮Ⅰ的含量提高最为明显。

实施例6

DPPH清除自由基法测定转基因毛状根中丹参酮抗氧化活性，见图6。

（1）样品溶液制备：

将样品稀释成下列梯度浓度：

0.25μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml的甲醇溶液各1ml，然后加入1，1-二苯基苦基苯肼溶液DPPH 1ml，以0.2 mM的甲醇溶液为自由基来源，并在25℃下保温30min。

（2）样品的吸光度测定及DPPH自由基清除活性的换算：

将步骤（1）中的样品分别在分光光度计下517 nm测定并记录其吸收值。根据下面的公式将吸光度值转换成DPPH自由基清除活性：

DPPH自由基清除活性（%）== [(A₀-A₁)/A₀×100]

A₀是对照样品吸光度值，

A₁是样品或标准品吸光度值。

（3）DPPH自由基清除活性能力的比较：

IC50为50%抑制浓度即清除该样品中一半的DPPH自由基所需该样品中活性成分的浓度，半数抑制用来衡量样品中活性成分灵敏度，半数抑制越低,说明其灵敏度越高，清除DPPH自由基能力越强，抗氧化能力亦越强。

结果表明：根据所得DPPH自由基清除活性计算出样品G50及对照组的IC50分别为0.2990，0.3049 μg/ml，差异不明显。而样品G50的总丹参酮含量比对照组高5.21倍，说明样品G50丹参酮的总抗氧化活性显著高于对照组。

本实施例证明了转基因方法获得的丹参毛状根中的单位丹参酮的抗氧化能力和对照相当，因此通过本发明获得高产丹参酮的丹参毛状根的方法是高效可行的。

本发明采用转SmGGPPS基因的代谢工程策略获得了高产丹参酮的丹参转基因毛状根株系，为大量生产丹参酮，缓解丹参酮的药源紧缺问题提供了一种有效方法。

以上所述本发明的实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有更改和变化。凡在本发明的原则之内，所作的任何修改、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

本发明涉及的序列及记号如下：

SEQ ID NO.1的信息

<110>  上海师范大学

<120>  转SmGGPPS基因提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1095

<212>  DNA

<213>  丹参(Salvia miltiorrhiza) 

<400>  1

atgagatcta tgaatctggt ggatgcgtgg gtccaaaacc tctcaatctt caagcagcca    

60

tgcccctcca aatccctggt cggattcatc caccacccga gattcgaacc cgttttcctg   

120

aaatcacgga agcgcatttc ctcccacggc gtctccgccg tgctcaccgg cgaggaggcc   

180

agagtgtcga cgcagagaga cgatgcgccc ttcaatttca acgcctacgt cgtcgagaag   

240

gcgaatcacg tgaacaaggc gcttgacgac gccgtggcgg tcaggaatcc accgatgatc  

300 

cacgacgcga tgcgctactc cctcctcgcc ggaggcaagc gcgtccgccc catgctctgt   

360 

atcgccgcct gcgagatcgt cggcggcccc cagtcggcgg cgatccccgc cgcctgcgcc   

420

gtcgagatga tccacaccat gtctctcatc cacgacgatc taccctgtat ggacaatgat   

480

gacctccgcc gcggcaagcc caccaatcac aaggtcttcg gcgaagacgt tgctgtgctc   

540

gcaggggatg ctctgttggc tttcgcgttc gaattcatgg ccacggcaac gacgggggtg   

600

gcgccggaaa ggatactggc ggcggtgggg gagctggcga aggcgatcgg gacagagggg   

660

ctggtggcgg ggcaagtggt ggacctgaac tgcaccggcg atgcaaacgt agggttagac   

720

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1095

Claims (4)

1.一种转牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因提高丹参毛状根丹参酮含量的方法，步骤如下：

(1)从丹参中克隆牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因；将牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因连于表达调控序列，形成含牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的植物表达载体；

(2)将含牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的植物表达载体转化发根农杆菌，获得含牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的发根农杆菌菌株；

(3)将步骤（2）所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得PCR检测为阳性的转基因毛状根克隆；

(4)半定量RT-PCR测定丹参转基因毛状根中牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的表达；

(5)高效液相色谱法测定丹参转基因毛状根中丹参酮含量，筛选丹参酮含量显著提高的转基因丹参毛状根株系；

(6)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼清除自由基法测定丹参转基因毛状根中丹参酮的抗氧化活性。

2.根据权利要求1所述的转牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因提高丹参毛状根丹参酮含量的方法，其特征在于：步骤（4）所述半定量RT-PCR检测方法如下：

（1）对PCR鉴定为阳性的毛状根克隆进行总RNA的提取，统一定量到0.5μgRNA反转录成30μl体系的cDNA；

（2）分别设计插入目的基因及看家基因18S rRNA的引物，以相同量的cDNA为模板进行半定量RT-PCR扩增；

（3）分析外源牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的相对表达量情况。

3.根据权利要求1所述的转牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因提高丹参毛状根丹参酮含量的方法，其特征在于：步骤（5）所述的高效液相色谱法如下：

色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为体积比65：35的乙腈和水；检测波长270nm，柱温30℃，流速1ml/min，进样量20μl。

4.根据权利要求1所述的转牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因提高丹参毛状根丹参酮含量的方法，其特征在于：步骤（6）丹参酮的抗氧化活性的测定方法为：

（1）从丹参转基因毛状根中提取丹参酮；

（2）将步骤（1）所得样品稀释为浓度梯度：0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml的甲醇溶液各1ml；

（3）向步骤（2）所得溶液分别加入0.2mM的甲醇溶液1ml；

（4）步骤（3）所得产物25℃下保温30min；

（5）将步骤（4）产物在分光光度计下517nm测吸收值。

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