CN109136235A - 一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法 - Google Patents

一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法。本发明从药用植物丹参中克隆得到一条SmMYB2转录因子，通过构建植物过表达及抑制表达载体，遗传转化丹参叶片外植体，获得转基因毛状根；利用QRT‑PCR分析转基因株系中丹酚酸、丹参酮及花青素合成途径中关键酶基因的表达；运用高效液相色谱法分析转基因株系中丹酚酸及丹参酮的含量；利用分光光度计测定转基因植株中花青素的含量。与现有技术相比，本发明解析了SmMYB2调控丹酚酸及花青素生物合成的机制，提供了一种提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，为生产具有重要临床需求的丹酚酸提供了一种新型优质原料，也为提高花青素等其他物质提供了一种新的思路。

Description

一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的 方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种转SmMYB2基因提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法。
背景技术
MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，在其N端都含有保守的MYB结构域。 MYB结构域是由1-4个大约52个氨基酸(amino acid，X)的不完全重复序列(MYBrepeats，R) 构成，每个重复序列包含3个α-螺旋(helix，H)，其中第2个和第3个螺旋形成1个螺旋-转角- 螺旋(helix-turn-helix，HTH)的结构，含有3个保守的色氨酸(tryptophan，W)残基。根据MYB 结构域R个数的不同，MYB可以分为四类：(1)只含有一个R(R1/2)蛋白；(2)含有2个重复R 的R2R3-MYB蛋白；(3)含有3个R的R1R2R3-MYB蛋白；(4)含有4个R的MYB蛋白。
植物中最多的MYB转录因子为R2R3-MYB转录因子，可调控初级和次级代谢、参与环境胁迫反应、调控植物的生长和发育。在拟南芥中，bHLH转录因子GLABRA3(GL3)，WD40蛋白TRANSPARENT TESTA8(TT8)和R2R3-MYB转录因子PAP1能够形成MBW复合物参与JA信号通路调控来花青素的生物合成过程。当外界环境中没有JA或其浓度很低时，JAZ与MBW复合物结合，从而抑制激活下游花青素合成相关基因的表达。当外界JA的浓度升高时，JA-Ile促进了SCFCOI1与JAZ的结合，26S蛋白水解酶将JAZ降解掉，释放出MBW复合物，从而激活下游花青素合成相关基因的表达。
丹参(Salvia miltiorrhiza)为唇形科(Lamiaceae)鼠尾草属多年生草本植物，其根色红形状似参而得名“丹参”，以干燥根或根茎入药，被广泛地应用于治疗心、脑血管疾病。丹参中有效活性成分主要分为两大类，一类为水溶性的酚酸类化合物，具有抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化、改善记忆功能障碍等药理作用，主要包括丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、咖啡酸、迷迭香素、丹参素等；另一类为脂溶性的丹参酮类化合物，主要包括丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮等，在抗氧化、消炎抑菌及抗肿瘤等方面具有显著疗效。
已有研究报道R2R3-MYB转录因子在植物次生代谢调控过程中发挥重要作用。例如过表达拟南芥的AtMYB75能够明显提高丹参转基因植株中丹酚酸B的含量。因此挖掘丹参自身的 R2R3-MYB转录因子来提高丹酚酸或黄酮类物质的含量并解析其作用机制具有重大的意义。利用基因工程手段深入研究SmMYB2对丹酚酸、花青素生物合成的调控机理，为深入了解丹参中次级代谢产物的生物合成机制奠定了基础，也为提高次级代谢产物的含量提供一种新功能基因和调控策略。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的不足而提供一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，并解析了其生物调控机制。
本发明可以通过以下技术方案来实现：
本发明从丹参中克隆得到SmMYB2转录因子，其基因编码框序列为795bp；QRT-PCR分析其组织表达谱及诱导表达谱；构建亚细胞定位载体，瞬时转化烟草叶片，激光共聚焦显微镜观察 SmMYB2基因在细胞中的定位；构建过表达及抑制载体，遗传转化丹参叶片获得转基因毛状根； QRT-PCR分析SmMYB2及丹酚酸、花青素生物合成相关基因在毛状根中的表达；高效液相色谱测定转基因毛状根中丹酚酸及丹参酮的含量；利用分光光度计检测转基因植株中花青素的含量；利用双荧光素报告基因检测实验(Dual-LUC)及凝胶迁移实验(EMSA)验证其调控丹酚酸合成的关键靶基因；利用双分子荧光互补实验(BiFC)确定与SmMYB2发生相互作用的蛋白。
具体而言，本发明的内容包括：
一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，包括以下步骤：
(1)采用基因克隆的方法从丹参中克隆获得SmMYB2基因，所述SmMYB2基因序列为SEQ ID NO.1所示的DNA序列；其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.52所示。
(2)根据丹参SmMYB2基因序列，设计定量PCR引物，QRT-PCR分析SmMYB2在丹参的不同组织中的表达模式；
(3)根据丹参SmMYB2基因序列，设计定量PCR引物，QRT-PCR分析SmMYB2对不同诱导子调控的响应模式；
(4)构建SmMYB2的亚细胞定位载体，瞬时转化烟草叶片，对SmMYB2进行亚细胞定位分析；
(5)把SmMYB2基因可操作性地构建于表达调控序列，形成含SmMYB2基因的植物过表达与抑制表达载体，即构建植物过表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2及抑制表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2-SRDX；
(6)将步骤(5)所得的植物表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2及 pCAMBIA2300+-SmMYB2-SRDX转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的发根农杆菌菌株；
(7)利用步骤(6)所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参外植体，获得经PCR检测为阳性的转基因毛状根克隆；
(8)QRT-PCR检测步骤(7)获得的丹参转基因毛状根中SmMYB2基因及丹酚酸、丹参酮、花青素生物合成途径中关键酶基因的表达；
(9)高效液相色谱法测定步骤(7)中转基因毛状根中丹酚酸及丹参酮的含量；
(10)分光光度计测定步骤(7)中转基因毛状根中花青素的含量；
(11)双荧光素报告实验(Dual-LUC)检测SmMYB2对丹酚酸生物合成关键酶基因启动子的激活；
(12)凝胶迁移实验(EMSA)证明SmMYB2与SmCYP98A14的作用；
(13)双分子荧光互补实验(BiFC)体内验证SmMYB2与SmbHLH1的相互作用。
本发明一个实施方式中，步骤(3)所述不同诱导子包括酵母提取物(YE)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、甲基茉莉酸(MeJA)、赤霉素(GA3)、乙烯(ethylene)等。
本发明一个实施方式中，步骤(4)构建SmMYB2的亚细胞定位载体，瞬时转化烟草叶片，对SmMYB2进行亚细胞定位分析的具体方法为：
4.1.将含有SmMYB2基因的亚细胞定位载体转化根瘤农杆菌；
4.2.用无菌注射器吸取农杆菌菌液注射生长良好的烟草叶片；
4.3.光照培养40-48小时，取叶片于载玻片上，背面朝上，用双蒸水浸润，用盖玻片固定叶片，避免产生气泡，于激光共聚焦显微镜下观察。
本发明一个实施方式中，所述载体为pMON530，根瘤农杆菌为菌株ASE。
本发明一个实施方式中，步骤(5)构建植物过表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2所使用的植物表达载体为经过改造获得的pCAMBIA2300+载体，包含CaMV35S启动子和NOS终止子、多克隆位点、复制起始点及卡那霉素抗性位点。
本发明一个实施方式中，步骤(6)所述发根农杆菌为C58C1菌株。
本发明一个实施方式中，步骤(7)所述PCR检测方法如下：
7.1.设计发根位点基因rolB的特异引物，进行PCR扩增；
7.2.设计插入基因SmMYB2及NOS终止子上、下游特异性引物，进行DNA扩增；
7.3.琼脂糖凝胶电泳检测，出现目的条带则为阳性克隆。
本发明一个实施方式中，步骤(8)所述QRT-PCR检测方法如下：
8.1.对PCR鉴定为阳性的克隆进行总RNA的提取，统一定量到0.5μg，反转录成cDNA；
8.2.设计SmMYB2及丹酚酸合成途径、花青素合成途径中关键酶基因、看家基因SmActin的定量引物，以相同量的cDNA为模板进行定量PCR分析；
8.3.利用2-△△Ct方法分析相关基因的表达情况。
本发明一个实施方式中，步骤(9)所述的高效液相色谱法如下：
9.1.丹酚酸的测定
色谱条件为：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为体积比30:70的乙腈和水，并用磷酸调节 pH至2.03；检测波长281nm，柱温35℃，流速1ml/min，进样量20μL；
9.2.丹参酮的测定
色谱条件为：C-18反相硅胶柱；流动相为乙腈：水(65：35)；柱温30℃；流速为1mL/min；波长为220nm。
本发明一个实施方式中，步骤(10)所述分光光度计测定花青素含量方法如下：
10.1.精确称取约0.1g(鲜重，M)材料，剪成约5mm的小块，在21℃或者室温条件下，2mL酸化甲醇(含1％HCl(w/v))中提取18h；
10.2.常温下12000rpm离心10min；
10.3.紫外分光光度计测定530nm与657nm处的吸光值(A530和A657)，
10.4.得到的吸光值A530大于2.5时，取0.4mL上清液加入到0.6mL的酸化甲醇中混合，再次测定吸光值；
10.5.总花青素苷含量(Q)计算：Q＝V×(A530-0.25×A657)/M，其中V为溶液体积(mL)， M为样品体积(g)。
本发明一个实施方式中，步骤(11)所述双荧光素报告实验(Dual-LUC)实验方法如下：
11.1.将SmPAL1、SmHPPR1、SmC4H、Sm4CL11、SmTAT、SmRAS1与SmCYP98A14等基因的启动子序列构建于pGreen-LUC上；
11.2.将构建好的载体转化含有pSoup-P19质粒的农杆菌GV3101；
11.3.将含有35S::SmMYB2与pGreen-LUC-Promotor载体的农杆菌按照等比例混合，瞬时注射烟草叶片(约1cm*1cm)；
11.4.3天后，收集叶片，利用发光检测仪检测LUC与REN值，根据LUC/REN比值检测SmMYB2对基因启动子的激活情况。
本发明一个实施方式中，步骤(12)所述凝胶迁移实验(EMSA)方法如下：
12.1.设计SmMYB2基因原核表达的引物，连接原核表达载体pETMALC-H，并转化大肠杆菌(BL21)；
12.2.加入0.5mM IPTG在37℃诱导构建成功的重组大肠杆菌，使其表达蛋白；
12.3.将生物素标记的探针与纯化的融合蛋白MAP-SmMYB2在25℃反应15分钟后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
本发明一个实施方式中，步骤(13)所述双分子荧光互补实验(BiFC)方法如下：
13.1.将SmMYB2序列与cYFP融合，构建pXY106-SmMYB2-nYFP载体；
13.2.将SmbHLH1序列与nYFP，构建pXY104-SmbHLH1-nYFP载体；
13.3.将载体分别转入农杆菌，农杆菌悬浮液等体积混匀，注射烟草，按需浇水，培养2天后取被侵染的叶片于激光共聚焦显微镜下观察。
本发明综合应用生物学和基因技术方法，如载体构建、遗传转化、分子检测、定量PCR分析、丹酚酸及丹参酮的提取及含量测定、花青素的提取及含量测定、凝胶迁移、双分子荧光互补实验等，发明了一种利用丹参R2R3-MYB转录因子SmMYB2提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，并解析其调控机制。
本发明公开了SmMYB2转录因子提高丹参中丹酚酸及花青素含量的代谢工程方法。本发明从药用植物丹参中克隆得到一条SmMYB2转录因子，构建其亚细胞定位载体；通过构建植物过表达及抑制表达载体，遗传转化丹参叶片外植体，获得转基因毛状根；利用QRT-PCR分析转基因株系中丹酚酸、丹参酮及花青素合成途径中关键酶基因的表达；运用高效液相色谱法分析转基因株系中丹酚酸及丹参酮的含量；利用分光光度计测定转基因植株中花青素的含量。
本发明中SmMYB2可促进丹酚酸生物合成途径中的关键酶基因SmPAL1,SmC4H,Sm4CL1, SmTAT,SmHPPR1,SmRAS,SmCYP98A14的表达，其中SmRAS和SmCYP98A14提高最为显著， HPLC结果分析丹酚酸含量最高的株系为165.49mg/g DW，比对照组高1.72倍；相反，在SmMYB2-SRDX株系中，SmPAL1,SmC4H,Sm4CL1,SmTAT,SmHPPR1,SmRAS,SmCYP98A14等基因的表达受到抑制，且酚酸含量与对照相比呈现不同程度的下降。同时，在过表达SmMYB2的转基因毛状根株系中，花青素代谢途径中的关键基因SmCHS,SmCHI,SmDFR和SmANS的表达上调，花青素含量积累增加；在SmMYB2-SRDX株系中，结果相反。双荧光素报告基因实验(Dual-LUC) 和凝胶迁移实验(EMSA)结果表明SmMYB2可激活SmCYP98A14的启动子，双分子荧光互补 (BiFC)实验证明SmMYB2可与上游蛋白SmbHLH1发生互作，推测其可通过形成复合物，在JA 信号途径中发挥作用，调控丹参次级产物的积累。
本发明获得的SmMYB2转基因丹参毛状根中的总丹酚酸含量最高为165.49mg/gDW，是对照组(60.84mg/g DW)的2.72倍。利用代谢工程手段深入研究转录因子SmMYB2对丹酚酸及花青素生物合成的调控作用，可为开展丹酚酸及花青素代谢工程提供重要的功能转录因子基因，并为深入了解丹酚酸及花青素生物合成调控机理及今后提高丹酚酸含量以缓解临床亟需等奠定基础和提供科学依据，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。
附图说明
图1为丹参SmMYB2的组织表达分析；
图2为丹参SmMYB2的诱导响应分析；
图3为SmMYB2的亚细胞定位的分析结果图；
GFP，绿色荧光蛋白；Bright，明场；Merged，绿色荧光蛋白与明场的合并图；pMON530-GFP，空载体荧光表达；pMON530-SmMYB2-GFP，SmMYB2的瞬时荧光表达；
图4为pCAMBIA2300+-SmMYB2及pCAMBIA2300+-SmMYB2-SRDX载体构建示意图；
图5为SmMYB2在转基因丹参毛状根中的表达分析；
图6为丹酚酸、丹参酮及花青素生物合成途径中关键酶基因的表达分析，图6包含图6A、图6B、图6C；
图7为SmMYB2转基因株系中丹酚酸含量分析；
图8为SmMYB2转基因株系中丹参酮含量分析；
图9为SmMYB2转基因株系中花青素的含量分析；
图10为SmMYB2与丹酚酸生物合成途径中关键酶的Dual-LUC实验结果；
图11为SmMYB2与SmCYP98A14的EMSA实验结果；
图12为SmMYB2与SmbHLH1的双分子荧光互补实验图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆(Sambrook 等)中所述的条件，或按照制造厂商所提供的试剂或试剂盒所附带的说明书建议的条件。
实施例1：丹参SmMYB2基因的克隆
1.1丹参总RNA的提取
取少量丹参幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，然后按照TIANGEN公司提供的 RNAprep Pure Plant Kit使用说明书提取总RNA。用普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，电泳条件：胶浓度1.2％；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min。用Nano Drop 2000c超微量分光光度计检测其纯度和浓度。
1.2丹参SmMYB2基因的克隆
以所获的0.5μg丹参总RNA为起始量，用反转录酶XL(AMV)进行第一链cDNA的合成(操作步骤参照Promega公司提供的相关说明书)。根据所述SmMYB2基因的编码序列(如SEQID NO.1所示)，设计扩增出完整编码框的上下游引物，并在上游引物和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定，本领域技术人员能够根据本领域常规技术手段实现)，以便构建载体。以所述第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。测序结果见SEQ ID NO.1所示。
实施例2:丹参SmMYB2的组织表达谱分析
为了研究SmMYB2的组织表达模式，分别提取两年生丹参的根、茎、叶、叶柄、花瓣、花萼等六个组织的总RNA，分别进行纯度和浓度检测。然后反转录成cDNA，用于定量PCR分析SmMYB2的组织表达谱，反应体系用TIANGEN公司提供的SuperReal PreMix(SYBR Green)试剂盒，用SmActin作为内参基因。定量PCR引物为：
上述四个引物的序列分别如SEQ ID NO.2-5所示。
结果显示，SmMYB2在根、叶和叶柄中表达最强，在茎、花瓣、花萼中表达较弱，见图1。
实施例3：丹参SmMYB2对不同诱导子处理的响应分析
为了验证SmMYB2对不同诱导子的响应情况，对在摇瓶中培养了60天左右的丹参毛状根分别用酵母提取物(YE)，脱落酸(ABA)，水杨酸(SA)，甲基茉莉酸(MeJA)，赤霉素(GA3)，乙烯(ethylene)进行诱导处理。提取经处理不同时间后(0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、9h、12h)的丹参毛状根的总RNA，并分别进行纯度和浓度检测，然后反转录成cDNA，用于定量PCR分析，定量引物同实施例2。QRT-PCR结果显示，SmMYB2响应甲基茉莉酸的诱导，对其他诱导子的响应不明显。且在4h时对MeJA的响应最高，见图2，图2中，每个横坐标对应的时间点上柱状线从左到右代表的分别是MOCK、YE、ABA、SA、MeJA、GA3、Eth。
实施例4：丹参SmMYB2基因的亚细胞定位分析
4.1pMON530-SmMYB2载体的构建
根据克隆获得的丹参SmMYB2ORF序列，设计亚细胞定位载体构建的引物，构建pMON530-SmMYB2，并将pMON530-SmMYB2质粒转化农杆菌ASE，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含有SmMYB2的亚细胞定位载体pMON530-SmMYB2成功转化到农杆菌ASE中，可以用于后续的烟草瞬时表达实验。
4.2烟草瞬时表达
将分别含有pMON530-SmMYB2和pMON530的工程菌菌液用无菌注射器注射生长良好的烟草叶片，光照培养40-48小时后取叶片于载玻片上，背面朝上，用双蒸水浸润，用盖玻片固定叶片，避免产生气泡，于激光共聚焦显微镜下观察。结果显示，SmMYB2在细胞核中表达，与它作为转录因子的功能是一致的，见图3。
实施例5：
植物表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2及pCAMBIA2300+-SmMYB2-SRDX的构建
载体构建模式图见图4。以pCAMBIA2300+为表达载体，将克隆得到的SmMYB2基因替换 pCAMBIA2300+上的gusA+GFP基因。基因的抑制表达采用融合抑制子基因沉默技术，即CRES-T 基因沉默技术，具体构建步骤为：设计上下游引物，其上游引物与上述表达载体的上游引物相同，下游引物在基因的C端添加一个12个氨基酸的SRDX转录抑制域序列(LDLDLELRLGFA)。具体地，用限制性内切酶SpeI/BstEII酶切pMD18T-SmMYB2及pMD18T-SmMYB2-SRDX和 pCAMBIA2300+；回收SmMYB2基因、SmMYB2-SRDX和pCAMBIA2300+大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。
结果表明，SmMYB2基因及SmMYB2-SRDX已被成功构建到植物表达载体pCAMBIA2300+中，从而获得植物表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2及pCAMBIA2300+-SmMYB2-SRDX。
本实施例将转录因子SmMYB2可操作性地连接于表达调控序列，形成植物过表达载体 pCAMBIA2300+-SmMYB2及抑制表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2-SRDX，该表达载体可用于通过代谢工程策略来调控丹参中丹酚酸、丹参酮及花青素的合成。
实施例6：发根农杆菌介导的SmMYB2遗传转化丹参获得转基因毛状根
6.1含植物表达载体的发根农杆菌工程菌的获得
将实施例5中含SmMYB2基因的植物过表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2及抑制表达载体 pCAMBIA2300+-SmMYB2-SRDX转入发根农杆菌C58C1中，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，植物过表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2及抑制表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2-SRDX 已经成功转化到发根农杆菌C58C1中。
6.2发根农杆菌介导SmMYB2基因遗传转化丹参
6.2.1外植体的预培养
剪取丹参健壮无菌苗叶片(0.5cm2)，接种到预培养的培养基(1/2MS)上，25℃暗培养2天。
6.2.2农杆菌与外植体的共培养
将上述预培养的丹参叶片外植体，放入活化好的含上述发根农杆菌工程菌的1/2MS悬液中浸泡10min，轻轻摇晃使外植体与菌液充分接触后，取出浸染后的丹参叶片用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基1/2MS中，暗培养2-3天。
6.2.3毛状根的诱导和继代培养
将上述的共培养2-3天的丹参外植体转接到除菌固体培养基(1/2MS+Cb300mg/L)中，25℃暗培养2-3周左右，可从外植体伤口处长出毛状根。将已经发根的丹参外植体转接到除菌固体培养基(1/2MS+Cb200mg/L)上，25℃暗培养2周待毛状根长至3cm以上时剪取单克隆毛状根作为一个无性系，继续接种于除菌培养基(1/2MS+Cb100mg/L)中暗培养两周，直至无溢菌现象。将单克隆毛状根转接到无抗生素的1/2MS培养基上继续暗培养。
6.3转基因丹参毛状根的PCR检测
6.3.1转基因毛状根基因组DNA的提取
采用CTAB法提取转基因毛状根基因组DNA。剪取除菌完毕的转基因毛状根5cm左右放入 1.5mL离心管中，加入600μL CTAB裂解液(65℃预热，含1％β-巯基乙醇)，用组织研磨仪充分研磨。置于65℃水浴锅中40-50min，其间多次混匀样品(次/15min)，冷却至室温后加入等体积的苯酚/氯仿(1:1)，轻轻颠倒混匀乳化10min，12000rpm离心15min，小心吸取上清于新EP管中，加入等体积的氯仿混匀，12000rpm离心15min，缓慢吸取上清于新EP管中，加2倍体积预冷的无水乙醇(于-20℃放置30min)，析出沉淀，12000rpm离心15min，弃上清，加入75％乙醇洗涤两次，吸出上清，室温晾干，加入30-50μL水溶解沉淀，用RNA酶处理后于-80℃超低温冰箱冻存，备用。
6.3.2引物设计及PCR检测
在pCAMBIA2300+-SmMYB2及pCAMBIA2300+-SmMYB2-SRDX载体的插入基因(SmMYB2)及NOS终止子上分别设计特异性上游及下游引物，在发根位点基因rolB上设计特异性上、下游引物,用PCR方法对上述毛状根的总DNA进行分子检测。结果表明，转基因毛状根根系中检测到和阳性对照(pCAMBIA2300+-SmMYB2及pCAMBIA2300+-SmMYB2-SRDX质粒为模板)大小相当的PCR产物；而以农杆菌C58C1空菌侵染丹参所得的毛状根的基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段，结果说明SmMYB2基因已经整合到丹参基因组中。
本实施例将所述的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的植物表达载体的发根农杆菌菌株C58C1，利用所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性克隆的转基因毛状根。转基因丹参毛状根的获得为筛选高产丹酚酸的毛状根提供了直接素材。
本实施例中选择发根农杆菌C58C1是一种优选实施方式，在实际选择上，发根农杆菌的菌株不限于C58C1，可以根据具体情况选择其他菌株。
实施例7：QRT-PCR检测转基因丹参毛状根中相关基因的表达
7.1毛状根液体培养
选择实施例6中生长快、分枝好的毛状根，在超净工作台上剪取2-3cm用无菌蒸馏水冲洗掉其表面上的琼脂后接入装有100mL的1/2MS液体培养基继代一次，60天后收获，取适量新鲜毛状根用吸水纸吸干表面水分后，用锡箔纸包装好进入液氮中冷冻后保存于-80℃用于RNA提取，其余毛状根烘干后用于提取代谢产物。
7.2RNA的提取及cDNA第一链的合成
方法同实施例1中的步骤1.1
7.3引物的设计和合成
根据丹参基因SmMYB2及丹酚酸、丹参酮、花青素生物合成相关基因序列设计定量引物，以看家基因Actin作为内参。所用引物由上海生工生物工程公司合成。
定量PCR的引物如下：
定量PCR的引物序列依次为SEQ ID NO6-51所示。
7.4转基因丹参毛状根的QRT-PCR检测
以相同量的上述cDNA(稀释10倍)第一链为模板，分别用上述设计的引物进行QRT-PCR 扩增。参照美国Applied Biosystem公司生产的Biosystem StepOne仪器的说明书进行QRT-PCR操作，采用全式金公司的QRT-PCR试剂盒。反应体系如下：
PCR反应条件：94℃变性5分钟，40个循环(94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒),72℃延伸10分钟。
QRT-PCR结果显示：相比空载株系，SmMYB2基因在过表达根系中的表达量明显提高，但不同克隆之间的表达量有一定的差异，其中表达量较高的为克隆9、10、24号，见图5。与此同时，SmMYB2在丹参毛状根中过表达后，丹酚酸代谢途径中的关键酶基因如SmRAS,SmCYP98A14的表达量明显提高，说明SmMYB2能促进丹酚酸生物合成途径中相关基因的表达，见图6A，图6A 中，每个横坐标点上柱状线从左到右代表的分别是PAL1、C4H、4CL1、TAT、HPPR1、RAS、 CYP98A14。相反，在SmMYB2过表达株系中，丹参酮生物合成途径中的关键酶基因表达有不同程度的下调，见图6B，图6B中，每个横坐标点上柱状线从左到右代表的分别是AACT、HMGS、 HMGR、DXS2、DXR、GGPPS、GPS1、KSL、CYP76AH1。与此同时，花青素合成途径中的相关基因如SmCHS,SmCHI,SmF3H,SmDFR,SmANS均有不同程度的上调，见图6C，图6C中，每个横坐标点上柱状线从左到右代表的分别是CHS、CHI、F3H、DFR、ANS。
据文献报道，MYB转录因子可通过结合下游靶基因启动子上的顺式作用元件来调控下游靶基因的表达。对丹酚酸合成途径中的关键酶基因启动子进行分析，发现受SmMYB2响应的基因启动子上含有MYB的顺式作用元件，因此推测SmMYB2通过结合启动子上的顺式作用元件来调控关键酶基因的表达，从而调控丹酚酸的合成。
实施例8：利用HPLC测定转基因丹参毛状根中丹酚酸含量
8.1毛状根中丹酚酸的提取
将实施例7收获的毛状根烘干至恒重，研磨成粉末，准确称取0.1g粉末于50mL离心管中，加入10mL乙醇：水(4:1，v/v)，超声20min，8000rpm，离心10min，吸取上清萃取液于旋转蒸发仪中70℃真空干燥，残余物重新用2mL的双蒸水溶解，将样品用0.22μm的滤膜过滤后待测。
8.2HPLC测定毛状根中丹酚酸含量
精密称取丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸和咖啡酸标准品用甲醇分别配置成浓度为1mM的标准品贮备液，保存于-20℃备用。
色谱条件：色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相为乙腈：水(30:70)，水用磷酸调节PH为2.03，检测波长281nm，柱温35℃，流速1mL/min。
将上述标准品贮备液分别取5μL，10μL，20μL，30μL，40μL在相应色谱条件下进样，四种水溶性成分完全分离且峰型良好，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品浓度(X， mg/mL)进行回归分析。
上述0.22μm滤膜过滤后的丹酚酸粗提物各取10μL，用高效液相色谱仪检测，记录各组分峰面积，代入线性回归方程，计算即得样品水溶性成分的含量。
在本发明中，除咖啡酸的含量无明显的上下调关系外，相对于对照组，迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B三种丹酚酸的含量明显上调，总丹酚酸的含量也明显提高。其中，表达量最高的10号转基因毛状根中丹酚酸的含量(165.49mg/g DW)为对照组(60.84mg/g DW)的2.72倍。在SmMYB2-SRDX株系中，酚酸含量与对照相比，有不同程度的减少，见图7，图7中，每个横坐标点上柱状线从左到右代表的分别是Sal A、Sal B、RA、CA、TPA。
实施例9：利用HPLC测定转基因丹参毛状根中丹参酮含量
9.1毛状根中丹参酮的提取
将实施例7收获的毛状根烘干至恒重，研磨成粉末，准确称取0.1g丹参毛状根粉末置于50mL 离心管中，加入16mL的体积比为3:1的甲醇：二氯甲烷，超声1h后放置于暗处过夜，7500rpm 离心15min，小心地将全部上清倒于旋转蒸发仪中，60℃真空蒸干，残余物用2mL甲醇溶解，全部转移到2mL的离心管中，12000rpm离心10min，吸取上清用0.22μm有机滤膜过滤到新的2mL 离心管中，样品保存于4℃待测。
9.2HPLC测定毛状根中丹参酮含量
将隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA、二氢丹参酮标准品用分析纯甲醇分别配制成1mM的浓度，于-20℃避光保存，备用。
色谱条件为：C-18反相硅胶柱(SymmetryShieldTM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)；流动相乙腈：超纯水的比例为65：35；柱温30℃；流速为1mL/min；波长为220nm。
将配制好的丹参酮标准品按等体积混合，用不同体积的甲醇配制成6个浓度梯度的混样，以峰面积对标准品浓度做标准曲线，R2值须大于0.999。各取200μL的丹参酮样品加入到样品瓶中， 10μL的样品注入高效液相色谱仪。记录各丹参酮组分的峰面积，代入线性回归方程后，计算即得所测样品中丹参酮的含量。
在本发明中，相对于对照组，SmMYB2过表达株系中总丹参酮含量降低，但抑制表达株系中总丹参酮含量升高，见图8，图8中，每个横坐标点上柱状线从左到右代表的分别是HT、CT、 T1、T2A、TT。
实施例10：分光光度计测定转基因毛状根中花青素的含量
10.1实验材料的选择
剪取生长状态良好的阳性转基因株系进行花青素含量测定。
10.2花青素含量的测定
精确称取约0.1g(鲜重，M)材料，剪成约5mm的小块，在21℃或者室温条件下，2mL酸化甲醇(含1％HCl(w/v))中提取18h；常温下12000rpm离心10min；用紫外分光光度计测定530nm与657nm处的吸光值(A530和A657)；得到的吸光值A530大于2.5时，取0.4mL上清液加入到0.6mL的酸化甲醇中混合，再次测定吸光值；总花青素苷含量(Q)用公式：Q＝V× (A530-0.25×A657)/M，V为溶液体积(mL)，M为样品体积(g)。
在本发明中，与对照相比，过表达SmMYB2的转基因株系的花青素含量明显上调，抑制表达的毛状根中花青素含量明显降低，见图9。
实施例11：Dual-LUC检测SmMYB2对丹酚酸生物合成关键酶基因启动子的激活
11.1载体构建
将丹参SmC4H,Sm4CL11,SmTAT,SmHPPR1,SmRAS,SmCYP98A14基因启动子构建到pGREEN-0800-LUC载体上。将构建好的质粒转到带有pSoup19辅助质粒的农杆菌GV3101菌株中。菌液PCR检测得到阳性克隆。将pCAMBIA2300+-SmMYB2质粒转到农杆菌GV3101菌株中。菌液PCR检测得到阳性克隆。
11.2Dual-LUC实验
将含有目的载体的阳性菌株28℃扩大培养，离心去上清，用MS液体培养基重悬菌体至OD600为0.6，按照每毫升2μL及20μL分别加入0.1M乙酰丁香酮和0.5M MES溶液(PH:5.7)，混匀并室温静置3h。将含pCAMBIA2300+-SmMYB2质粒的GV3101菌株(含pSoup19)与含pGREEN-0800-基因启动子-LUC载体的GV3101菌株等比例混合，用针管注射烟草，且烟草叶片位置需要做好标记。两天后用打孔器在烟草叶片标记的位置打孔取样(约直径1cm)，之后迅速置于液氮中冻存，用组织研磨仪在冷冻条件下55Hz，研磨120s，加入400μL PassiveLysis Reagent用振荡器振荡混匀，12000rpm离心1min；取8μL上清于1.5mL Exygen RNA-free离心管中，加入40μL LAR II Reagent用移液器轻轻吸打混合均匀，用GloMax 20/20Luminometer 测定REN值，再加入40μL Stop&Glo Reagent并用移液器轻轻吸打混合均匀，用GloMax 20/20Luminometer测定LUC值，即可得出样品的LUC/REN比值。
结果表明，SmMYB2可激活SmCYP98A14基因的表达，见图10。
实验例12：凝胶迁移实验
12.1pETMALC-H-SmMYB2载体的构建
根据已经克隆获得的丹参SmMYB2完整的开放读码框序列，设计原核表达载体构建的引物，构建pETMALC-H-SmMYB2，并将pETMALC-H-SmMYB2质粒转化大肠杆菌(BL21)，挑取单克隆菌落进行PCR验证。
12.2SmMYB2重组蛋白表达与纯化
将构建成功的含有pETMALC-H-SmMYB2的大肠杆菌(BL21)接种于含有卡那霉素(75mg/mL) 的LB培养基中，培养2-3小时(OD600＝0.4-0.5)。加入0.5mM的IPTG进行诱导表达，并纯化蛋白。
12.3EMSA实验
分析SmCYP98A14的启动子序列，设计探针。将生物素标记的探针与纯化的融合蛋白 MAP-SmMYB2在25℃反应15分钟后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
实验结果表明，SmMYB2可与SmCYP98A14启动子作用(见图11)。
实验例13：
SmMYB2与SmbHLH1蛋白互作双分子荧光互补(BiFC)实验
13.1载体构建
将SmMYB2序列与cYFP融合，构建pXY104-SmMYB2-cYFP载体；将SmbHLH1 序列与nYFP融合，构建pXY106-SmbHLH1-nYFP载体。
13.2农杆菌转化
将得到的pXY104-SmMYB2-cYFP载体、pXY106-SmbHLH1-nYFP分别转化农杆菌菌株GV3101。
13.3烟草瞬时转化及显微镜观察
将含有目的载体的农杆菌悬浮液等体积混匀，烟草瞬时转化实验同11.2。将注射后的烟草放置于25℃16h light/8h dark的培养架上，按需浇水，培养2天后取被侵染的叶片于激光共聚焦显微镜蓝光下观察。
BiFC结果表明SmMYB2蛋白与SmbHLH1蛋白在体内存在相互作用，见图12。
上述实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江中医药大学；上海师范大学
<120> 一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法
<160> 52
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 795
<212> DNA
<213> 丹参(Salvia miltiorrhiza)
<400> 1
atgggaagat caccttgctg ctccaaggtt ggcctccgga gagggccttg gtccactaaa 60
gaagactctc ttctcgccaa ttacatccag caaaacggcg aaggccaatg gcgatctctc 120
cccaagaaag ctggactact gaggtgcgga aagagctgca ggctgaggtg gatgaactac 180
ctgcggccgg ggataaagcg aggcaacatc agcgaagatg aggaagattt gatcgtgcgg 240
ctgcacggcc tcctcggcaa ccgctggtcg ctcatcgccg gtagattgcc aggtcgaact 300
gacaatgaga tcaagaacta ctggaacaca cacctcctca agaagctcaa gaccgccgcc 360
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ctccagcttc tgtag 795
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 11
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<212> DNA
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<210> 15
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gcgagccaaa acggaca 17
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ccaggagtcc aaataacaga gc 22
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gccaccaagc gttcaccaag at 22
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cgagatcgcc tactccaagt tcaag 25
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
agatggcgtt accgaagtat ccctg 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ggtctgtacc gtcgtcctct tctcc 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
acaaggctgg tatttgggaa aaggt 25
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
atgtcgcgcc acgtgttga 19
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ttagacttca atgggcacgc tg 22
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gctcactcac gattgccttc tc 22
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tcattgtgcc tcagcagcga 20
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cctgatgcca aagtttaccc g 21
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tggttggcga gcttcttgag 20
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gaaatgttta gaggagccat tgac 24
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tcaatcacat ttgccattct cg 22
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ggattcaacg gcgacaaagg 20
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ccacaggcct tcacccacc 19
<210> 52
<211> 264
<212> PRT
<213> 丹参(Salvia miltiorrhiza)
<400> 52
Met Gly Arg Ser Pro Cys Cys Ser Lys Val Gly Leu Arg Arg Gly Pro
1 5 10 15
Trp Ser Thr Lys Glu Asp Ser Leu Leu Ala Asn Tyr Ile Gln Gln Asn
20 25 30
Gly Glu Gly Gln Trp Arg Ser Leu Pro Lys Lys Ala Gly Leu Leu Arg
35 40 45
Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Gly
50 55 60
Ile Lys Arg Gly Asn Ile Ser Glu Asp Glu Glu Asp Leu Ile Val Arg
65 70 75 80
Leu His Gly Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu
85 90 95
Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu
100 105 110
Leu Lys Lys Leu Lys Thr Ala Ala Ala Pro His Lys Asp Leu Pro Asn
115 120 125
Leu Ala Ala Lys Pro Lys Lys Lys Lys Pro Lys Gln Lys Pro Thr Pro
130 135 140
Pro Ser Pro Leu Lys Asp Glu Ser Ala Ala Asp Glu Pro Thr Pro Pro
145 150 155 160
Pro Lys Thr Lys Val Tyr Leu Pro Lys Pro Ile Arg Val Ser Ser Ala
165 170 175
Phe Ser Arg Ser Asn Ser Tyr Asp Ser Leu Ala Ser Asn Ser Asp Gly
180 185 190
Glu Lys Ala Ala Glu Glu Leu Ser Tyr Met Pro Leu Gln Trp Pro Pro
195 200 205
Ile Phe Glu Leu Glu Glu Gly Asp Tyr Gly Val Cys Ala Ala Val Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Asp Asp Phe Leu Asp Gly Gly Phe Ile Leu Pro Val Leu
225 230 235 240
Asn His Ser Asp Ser Ile Ser Ser Asp Val Asn Met Leu Glu Lys Val
245 250 255
Tyr Asp Glu Tyr Leu Gln Leu Leu
260

Claims (10)

1.一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，其特征在于，在丹参中过表达SmMYB2。
2.根据权利要求1所述一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用基因克隆的方法从丹参中克隆获得SmMYB2基因；
构建SmMYB2的亚细胞定位载体；
构建植物过表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2及抑制表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2-SRDX；
将所得的植物表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2及pCAMBIA2300+-SmMYB2-SRDX转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的发根农杆菌菌株；
利用所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参外植体，获得经PCR检测为阳性的转基因毛状根克隆；
经PCR检测为阳性的转基因毛状根克隆中，转SmMYB2基因提高丹参中丹酚酸及花青素含量。
3.根据权利要求1或2所述一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，其特征在于，所述SmMYB2基因序列为SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
4.根据权利要求2所述一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，其特征在于，构建SmMYB2的亚细胞定位载体所用载体为pMON530。
5.根据权利要求2所述一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，其特征在于，构建植物过表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2所使用的植物表达载体为经过改造获得的pCAMBIA2300+载体，包含CaMV35S启动子和NOS终止子、多克隆位点、复制起始点及卡那霉素抗性位点。
6.根据权利要求2所述一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，其特征在于，所述发根农杆菌为C58C1菌株。
7.根据权利要求2所述一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，其特征在于，所述PCR检测方法如下：
设计发根位点基因rolB的特异引物，进行PCR扩增；
设计插入基因SmMYB2及NOS终止子上、下游特异性引物，进行DNA扩增；
琼脂糖凝胶电泳下检测，出现目的条带则为阳性克隆。
8.根据权利要求1或2所述一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，所述SmMYB2促进丹酚酸生物合成途径中的关键酶基因SmPAL11,SmC4H,Sm4CL11,SmTAT,SmHPPR11,SmRAS,SmCYP98A14的表达。
9.根据权利要求1或2所述一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，其特征在于，SmMYB2激活SmCYP98A14的启动子。
10.根据权利要求1或2所述一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，其特征在于，SmMYB2与上游蛋白SmbHLH1发生互作。
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