CN109371045A - 一种来源于福建金线莲的查尔酮酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种来源于福建金线莲的查尔酮合酶基因及其应用，涉及基因工程技术领域。一种来源于福建金线莲的查尔酮合酶基因，其具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列，如SEQ ID NO：3所示编码区序列。该序列是一种新的查尔酮合酶基因序列，能够应用在水稻中，可以调控水稻中黄酮类物质的含量。其对研究次生代谢产物的合成途径具有重要的意义。

Description

一种来源于福建金线莲的查尔酮酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，且特别涉及一种来源于福建金线莲的查尔酮合酶基因及其应用。

背景技术

福建金线莲(Aoectochilus formosanus)是多年生草本植物，生长在福建地区，属兰科开唇兰属金线莲种。福建金线莲中重要药理活性的物质主要为：黄酮类化合物，甾体类化合物，三萜类化合物，糖类成分，生物碱，强心甙类，酯类，牛磺酸，多种氨基酸，微量元素及无机元素等。在民间素有“药王”、“金草”、“神草”、“鸟人参”等美称。其中，福建金线莲中的多糖、黄酮类化合物、甾体等被认为是重要的活性物质，这些物质的合成直接影响了福建金线莲的药用价值。解析次生代谢产物的合成途径是开展相关合成生物学研究的前提和基础。

查尔酮合酶(Chalcone synthase，CHS)是黄酮类物质合成代谢途径中关键的酶基因。黄酮类化合物合成代谢途径中，最先催化的酶是苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonialyase,PAL)，它可以催化L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)生产反式肉桂酸(Trans-cinnamic acid)。上步反应中产生的反式肉桂酸，在氧和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)同时存在的条件下，经过肉桂酸4-羟基酶(Cinnamic acid 4-hydroxy enzyme,C4H)催化，可以生成4-羟基香豆酸(4-hydroxycinnamate acid)。接着4-羟基香豆酸-辅酶A连接酶(4-hydroxycinnamate acid-coenzyme A ligase,4CL)催化连接，将前一步骤生成的4-羟基香豆酸转化为4-羟基香豆酰-CoA等硫酯，此步骤需要ATP提供能量。产生的4-羟基香豆酰-CoA可与丙二酰-CoA在查尔酮合酶的作用下反应，生成查尔酮(Chalcone)。查尔酮作为黄酮类化合物合成5条支路(异黄酮支路、橙酮支路、黄酮支路、花青素支路和黄酮醇支路)的共同底物，在苯丙烷代谢过程中发挥作用。因此，查尔酮合酶是植物黄酮类化合物合成代谢途径的关键限速酶，其活性与各种黄酮类化合物的合成代谢和积累密切相关。对福建金线莲中查尔酮合酶基因的研究，是研究福建金线莲中特定的目的次生代谢产物富集的基础，具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于福建金线莲的查尔酮合酶基因、此基因编码的氨基酸、含有此基因的重组质粒以及该查尔酮合酶基因的应用，为植物中黄酮类化合物的合成代谢研究提供基础。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

一种源于福建金线莲的查尔酮合酶基因，所述查尔酮合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

可选的，查尔酮合酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

可选的，查尔酮合酶基因的编码区序列如SEQ ID NO：3所示。

一种含有上述查尔酮合酶基因的重组质粒。

可选的，所述质粒为pC2300-35S-CHS-eGFP、pET28a(+)-CHS或pZZ00026-Ubi-CHS-T-nos。

一种上述的查尔酮合酶基因在调控水稻黄酮含量中的应用。

可选的，如上所述的应用，包括以下步骤：

S1，将福建金线莲的查尔酮合酶基因的ORF序列，插入到pDM19-T质粒中，得到表达载体；

S2，将所述表达载体转化至农杆菌后，用转化后的所述农杆菌对水稻进行侵染转化，得到转基因水稻。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明所提供的查合酮合酶基因是首次从福建金线莲中克隆制得得到的。黄酮类化合物是一种极具应用价值的植物次生代谢产物。查尔酮合酶基因是黄酮类化合物合成代谢途径中的关键限速酶。该基因的成功克隆，为金线莲品种选育提供重要依据，也为黄酮类化合物富集的转基因植物株系研究提供基础。本发明以转录组测序的方法获得福建金线莲的Unigene序列，在Unigene序列的两端设计引物，扩增查尔酮合酶的CDS全序列。这种通过转录组测序的方法得到目的基因的CDS序列，扩增基因序列的方法操作简单方便。利用本发明可以对水稻进行基因工程改造，通过转基因对水稻基因进行调控，以增强水稻中的黄酮类化合物含量。或者是利用该基因进行植物品种鉴定、筛选等，得到高黄酮含量的植物品种等，为金线莲中特定的目的次生代谢产物富集的提供基础。同时在福建金线莲中克隆查尔酮合酶基因，是研究福建金线莲中黄酮类物质合成代谢通路的基础，能够为金线莲品种选育提供重要的依据，也为黄酮类化合物富集的转基因株系研究提供基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明实施例4提供的金线莲CHS基因CDS序列电泳检测结果图。

图2为本发明实施例5提供的福建金线莲CHS预测的蛋白三级结构图。

图3为本发明实施例5提供的福建金线莲CHS蛋白发生关系树分析。红框为福建金线莲所处位置。

图4为本发明实施例6提供的福建金线莲CHS基因不同组织表达模式图。

图5为本发明实施例6提供的福建金线莲CHS基因在4mg/L Phe下24h内的表达模式图。

图6为本发明实施例6提供的福建金线莲CHS基因在100nM NaCl下24h内的表达模式图。

图7为本发明实施例6提供的福建金线莲CHS基因在253.7nm紫外胁迫下24h内的表达模式图。

图8为本发明实施例7提供的福建金线莲CHS基因启动子Tail-PCR结果。M为marker，AD1-AD6为六个简并引物与特异引物扩增的片段的第二轮和第三轮片段。

图9为本发明实施例7提供的福建金线莲CHS基因启动子顺式作用元件。

图10为本发明实施例8提供的瞬时表达载体pC2300-35S-CHS-eGFP。

图11为本发明实施例8提供的金线莲CHS蛋白的亚细胞定位。

图12为本发明实施例9提供的原核表达载体pET-28a(+)-CHS。

图13为本发明实施例9提供的金线莲CHS蛋白的原核诱导表达。

图14为本发明实施例9提供的金线莲CHS蛋白的纯化。

图15为本发明实施例10提供的金线莲CHS蛋白酶活力测定。

图16为本发明实施例11提供的单子叶过表达载体pZZ00026-Ubi-CHS-T-nos。

图17为本发明实施例11提供的转金线莲CHS基因水稻的PCR检测图。

图18为本发明实施例11提供的转金线莲CHS基因水稻的总黄酮富集情况。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的进行具体说明。

在下述各实施例中，将福建金线莲的查尔酮合酶基因简称为ArCHS，通过实验例，最终得到来源于福建金线莲的查尔酮序列(如SEQ ID NO.1所示)及其编码的氨基酸序列(如SEQ ID NO.2所示)。

实施例1

本实施例提供福建金线莲的总RNA提取，采用大连宝生物有线公司的Trizol提取试剂盒进行金线莲叶片总RNA的提取，包括以下步骤：

(1)取约100mg新鲜叶片，在液氮中研磨成粉末，转移至1.5mL离心管，然后立即加入1mL RNAiso Plus，颠倒混匀，得到匀浆液。

(2)将充分混匀的匀浆液在室温静置5min，然后在12000g、4℃条件下离心5min。

(3)吸取上清液800ml转入新的离心管中，切勿吸取沉淀，然后加入上清液体积200ml氯仿，并剧烈振荡混匀至匀浆液乳化呈乳白色，然后室温静置5min，得到混合液。

(4)将混合液在12000g、4℃条件下离心15min，此时离心后的匀浆液分为三层。从上至下分别是：上清液(含RNA)、中间的白色层(大部分为DNA)及下层带颜色的有机相。

(5)吸取步骤(4)中的上清液400ml转移至新的离心管中，切勿触碰中间层。然后加入400ml的异丙醇并颠倒混匀，然后室温下静置10min。

(6)将步骤(5)中静置后的溶液在12000g、4℃条件下离心10min，此时可见白色絮状的RNA。小心弃掉上清液并加入1mL 75％乙醇，上下颠倒洗涤RNA后弃去上清液。

(7)打开离心管盖室温干燥RNA几分钟后，加入30μl的RNase-free水溶解RNA。

(8)使用超微量分光光度计(Bio-Rad，美国)测定A260的值来计算总RNA的浓度，读取OD260/OD280的值来估计总RNA纯度和完整性。用1.2％浓度的琼脂糖凝胶电泳，135V快速检测RNA质量。

实施例2

本实施例提供福建金线莲的转录组测序，包括以下步骤：

根据实施例1提供的方法，提取福建金线莲叶片的总RNA。检测RNA提取质量，满足建库要求(RNA浓度>250ng/μL，总量>20μg，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8～2.2之间，完整性良好，RIN>6.5)。然后，用磁珠富集poly(A)mRNA打断成段片段，以此为模板，依次合成第1条cDNA链和第2条cDNA链，经过纯化、洗脱、末端修复、加poly(A)后连接测序接头。选择200bp～700bp大小的片段进行PCR扩增，建立cDNA测序文库，用IIIumina HiSeq 2000进行测序。该部分实验委托美因科技服务有线公司完成。

使用短reads组装软件Trinity(v2.4.0)做De novo组装，得到不含N的Contig组装片段后，使用tgicl(v2.1)进行去冗余，除去序列中质量低、不确定的序列，保留大于200bp的序列进行后续分析。利用transdecoder(v2.0.1)对上述拼接结果进行基因结构预测，得到ArCHS基因的CDS序列。

实施例3

本实施例提供福建金线莲cDNA第一链，包括以下步骤：

以实施例1提供的金线莲叶片总RNA作为模板，以oligo(dT)18为逆转录引物，采用PrimeScriptTM Reverse Transcriptase(TakaRa China)按照SMART^TMPCR cDNA SynthesisKit(Clontech USA)操作说明进行cDNA第一链的合成。反应体系总体积为20μL。

(1)按照表1中的试剂在0.2mL PE管中配制得到逆转录混合液1；

(2)按照表2中的试剂在另一0.2mL PE管中配制得到逆转录混合液2；

(3)将步骤(1)中的逆转录混合液1在65℃下保温5min后迅速在冰上急冷2min，离心数秒钟使模板RNA、引物等的混合液聚集于PE管底部；

(4)将步骤(2)中配置的逆转录混合液2加入步骤(3)中反应后的逆转录混合液1中，用移液枪轻轻混合后42℃反应90min；

(5)将步骤(4)中获得的反应液在80℃下保温5min后冰上冷却，得到cDNA溶液。

表1逆转录混合液1组成

表2逆转录混合液2组成

实施例4

本实施例提供ArCHS基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)引物设计

将实施例2中通过转录组测序拼接得到ArCHS基因的CDS序列的基础上，采用Primer Premier 5.0软件设计引物，设计好的引物在Oligo6.0中分析物引物的特异性。

上游引物CHSF:如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列

(5'-ATGCCGAGCCTCGAATCCA-3')；

下游引物CHSR:如SEQ ID NO：5所示的

(5'-TTAAAGAGGAACGCTGCGAA-3')。

(2)PCR反应

反应程序为：95℃预变性3min；之后按95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min扩增38个循环。PCR反应采用50μL体系，如表3所示。

表3 PCR反应体系

*：为实施例3提供的cDNA第一链，稀释3-10倍。

取所得扩增产物50ul经1％非变性琼脂糖凝胶180V电泳30min，GoLdenView染色后紫外线检查扩增片段，结果如图1所示。图1A为开放阅读课扩增，图1B为基因编码区扩增，其中，M表示marker，1表示台湾金线莲，2表示福建金线莲。

(3)目的片段的回收

将步骤(2)中扩增出来的特异条带用干净的刀片在紫外灯下快而准的从琼脂糖中挖出，置于1.5ml离心管中，用凝胶回收试剂盒(OMEGA公司的E.Z.N.A.TM Gel ExtractionKit)回收胶中的DNA片段。

(4)连接反应

将回收的DNA片段克隆与TaKaRa公司的Pmd19-T载体中。连接反应采用连接试剂盒(TaKaRa公司)，连接体系总体积10ul，16℃连接过夜。

(5)感受态细胞的制备：

从LB平板上挑取新活化的E.coLiDH5a单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃，225r/min振荡培养12h左右，直至对数生长后期。将该菌液悬浮液以1：:10-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h至OD600＝0.35-0.5左右。

将培养液转入离心管，冰上放置10min，然后于4℃下3000r/min离心10min.

弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30min后，4℃下3000r/min离心10min。

弃上清，加入4ml预冷含15％甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬浮液。

感受态细胞分装成100ul的小份，贮存于-70℃可保存半年。

(6)质粒DNA的转化

取一管步骤(5)中的大肠杆菌感受态细胞DH5a，置于冰上融化。然后在无菌条件下加入10ml步骤(4)中的连接反应液，轻轻震荡混匀后，在冰上放置30min。42℃水浴热击90s，不要摇动，之后迅速放入冰浴冷却2-3min。加入890ul无Amp的LB液体培养基，混匀后，37℃、150r/min摇床振摇培养，温育1h，得到已转化的菌液。

取100ul已转化的菌液涂于一个LB Amp的培养平板上，正面朝上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，用封口膜封住，然后倒转培养皿，37℃避光培养12-16h；随后筛选阳性菌落。

(7)重组菌落的鉴定和保存

从外观上看，一般白色且圆的菌落为阳性，通过菌液PCR进行进一步鉴定，步骤如下：

在过夜培养的平板上用灭菌的小枪头挑取几个白色菌落，分别点种于0.1g/L Amp的LB液体培养基的1.5ml离心管中，37℃，150r/min振摇培养4-6h。

取1uL菌悬液作为模板，用引物CHSF/CHSR进行PCR扩增，PCR反应条件中裂解时间延长至5min，用1％的非变性琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。如果产物为目的条带时，此菌落为阳性克隆，否则为阴性。同时设不加菌悬液的阴性对照。

取已经鉴定的阳性克隆的菌落悬浮液750ul，加入250ul的灭菌甘油，混匀后，用液氮速冻，置于-70℃冰箱中保存备用。

(8)测序

将步骤(7)中已经鉴定保存的阳性克隆的菌落送英俊生物技术公司测序，所得序列在NCBI的BLastn进行比对分析，验证克隆片段正确。

扩增得到的产物为ArCHS基因层cDNA中间片段，得到核苷酸序列SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基序列SEQ ID NO.2所示，编码区序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例5

本实施例提供ArCHS基因的蛋白生物信息学分析，包括以下步骤：

使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)对ArCHS基因物理和化学性质进行分析。福建金线莲CHS基因全长1173bp，编码区序列为1260bp，第180至267bp之间插入1个长87bp的内含子，编码390氨基酸。CHS蛋白特征的13个活化位点(G¹³⁸-G¹⁶³-G¹⁶⁷-L²¹⁴-D²¹⁷-G²⁵³-P³⁰⁵-G³⁰⁶-G³⁰⁷-G³³⁶-G³⁸⁵-P³⁸⁶-G³⁸⁷)、4个催化残基(Cys-His-Asp+F)和6个保守残基(G³⁷⁹-V³⁸⁰-L³⁸¹-F³⁸²-G³⁸³-F³⁸⁴)完全相同，只在丙二酰辅酶A结合基序(V³¹⁴-E³¹⁵-E³¹⁶-R³¹⁷-V³¹⁸-G³¹⁹-L³²⁰-K³²¹-P³²²-E³²³-K³²⁴-L³²⁵-T³²⁶-T³²⁷-S³²⁸-R³³⁰)的近C-端有2个残基与蝴蝶兰不同。此外，还发现1个经典的细胞核定位信号(Nuclear localization signal,NLS)R⁶⁶-K⁶⁷-R⁶⁸-H⁶⁹。利用ExPASy Proteomics Server提供的在线工具ProtParam对CHS基因编码蛋白的理化性质进行预测，推测该蛋白相对分子质量为42.9kDa，等电点pI 6.24。

使用GOR IV(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_gor4.html)对CHS基因的二级结构进行预测。二级结构在线预测的结果表明，α-螺旋(Alpha helix)，占总氨基酸的31.54％，伸展链(Extended strand)，占所有氨基酸的21.54％，无规则卷曲(Random coil)，占总氨基酸的46.92％。

通过SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)对福建金线莲的FPS基因进行蛋白三级结构的预测，通过PyMOL Viewer作图，三维模型见图2所示。

最后先找到同源性较高植物的CHS氨基酸序列，利用ClustalW方法进行氨基酸序列的比对，通过MEGA7.0构建Neighbor-joining系统进化树如图3所示。其中，图3中方框标识处为福建金线莲所处位置。

实施例6

本实施例提供ArCHS基因的内源表达检测，包括以下步骤：

(1)材料处理

1.1紫外光照射处理：

将培养4个月的福建金线莲组培苗移栽至装有营养土(营养土:蛭石＝3:1)的花盆中，在温度25℃(昼)/20℃(夜)、相对湿度60～70％和光照200μmol/m²·s(14h)/黑暗(10h)的条件下培养。适应3～5天，长势均匀一致的未处理幼苗取根、茎、叶样品，液氮速冻-70℃保存。其余长势均匀的幼苗进行紫外光照射处理。

处理条件为：将盆栽的金线莲放置于紫外培养箱中，紫外辐射波长253.7nm，分别处理0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h和24h。

每个各处理重复3次，在各处理时间点立即取样液氮速冻-70℃保存。

1.2红光照射处理：

将培养4个月的福建金线莲组培苗移栽至装有营养土(营养土:蛭石＝3:1)的花盆中，在温度25℃(昼)/20℃(夜)、相对湿度60～70％和光照200μmol/m²·s(14h)/黑暗(10h)的条件下培养。适应3～5天，长势均匀一致的未处理幼苗取根、茎、叶样品，液氮速冻-70℃保存。其余长势均匀的幼苗进行红外光照射处理。

处理条件为：将盆栽的金线莲放置于红光培养箱中，红光波长650nm，分别处理0h、0.5h、1h、2h、4h、8h和12h。

每个各处理重复3次，在各处理时间点立即取样液氮速冻-70℃保存。

1.3盐胁迫处理：

将培养4个月的福建金线莲组培苗移至带孔的塑料泡沫板上，用Hoagland营养液培养3～5d，选长势均匀一致的幼苗进行盐胁迫处理。盐胁迫处理即：将NaCl加入Hoagland营养液至终浓度100mmol/L，分别处理0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h和24h。每个各处理重复3次，在各处理时间点立即取样液氮速冻-70℃保存。

1.4苯丙氨酸处理：

将培养4个月的福建金线莲组培苗移至带孔的塑料泡沫板上，用Hoagland营养液培养3～5d，选长势均匀一致的幼苗进行苯丙氨酸处理。苯丙氨酸处理即：将苯丙氨酸加入Hoagland营养液至终浓度4mg/L，分别处理0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h和24h。每个各处理重复3次，在各处理时间点立即取样液氮速冻-70℃保存。

(2)RNA提取

取上述4种胁迫处理及对照组幼苗的叶片，分别液氮速冻研磨，使用总RNA提取试剂盒Trizol(TaKaRa，大连)并提取总RNA。步骤如实施例1。

(3)cDNA第一链合成

以提取的RNA为模板，按照表4体系加样，42℃反应2min，去除可能的基因组DNA(gDNA)，用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa，大连)，按表5体系加样，37℃温浴30min，85℃保持5s终止反应以反转录合成cDNA，并于-20℃保存备用。

表4 gDNA去除反应体系

表5 cDNA合成体系

(4)qRT-PCR引物的特异性检测

以0h对照cDNA样品3倍稀释后用作qRT-PCR反应的模板，采用50～65℃的退火温度梯度进行qRT-PCR反应来确定最佳的退火温度，采用如表6所示的20μL反应体系。qRT-PCR引物序列如表7所示。

表6 qRT-PCR反应体系

表7 qRT-PCR引物序列

反应管采用百乐硅化后的0.2mL PCR板。qRT-PCR在iQ^TM5thermal cycler(Bio-RadUSA)进行。反应程序为：95℃预变性10s；然后按95℃变性10s，50～65℃退火20s，72℃延伸20s，并在此温度收集荧光，读板(Plate read)的程序进行46个循环。之后从50℃开始，以每步0.5℃的温度梯度升高至95℃，每步温度保持5s。

(5)qRT-PCR反应

将本实施例步骤(3)中不同样品的逆转录的cDNA样品倍稀释后用作qRT-PCR扩增的模板，反应管采用硅化后的0.2mL的PCR板，采用20μL反应体系(表6)，并设立以ddH₂O为模板的阴性对照。单个逆转录的cDNA样品设三次重复。

qRT-PCR反应程序为：95℃预变性10s，然后按95℃变性10s，最适退火温度退火20s，72℃延伸20s，并在此温度收集荧光，读板(Plate read)的程序进行46个循环。之后最后从50℃开始，以每步0.5℃的速度升高至95℃，每个温度保持5s，绘制熔解曲线。

(6)qRT-PCR数据分析

本实验采用双标准曲线法对黄酮代谢合成途径中的关键酶基因的表达水平进行相对定量。采用△△CT(Normalized Gene Expression)法计算基因的相对表达量。

0h对照与处理间的表达差异以及各处理间的表达差异用SPSS(version10.0Inc.Chicago，IL)统计分析软件进行分析。设立P＝0.05和P＝0.01两个差异显著性水平。福建金线莲CHS基因不同组织表达模式图如图4所示。

图5为福建金线莲CHS基因在4mg/L苯丙氨酸下24h内的表达模式图(浅色柱子代表台湾金线莲CHS基因)，在4h和8h的表达量与0h相比，差异极显著。图6为福建金线莲CHS基因在100mmol/L NaCl下24h内的表达模式图，在8h、12h和24h的表达量与0h相比，差异极显著。图7为福建金线莲CHS基因在253.7nm紫外胁迫下24h内的表达模式图，在0.5h、1h、2h、4h、8h、12h和24h的表达量与0h相比，差异极显著。

实施例7

本实施例提供福建金线莲ArCHS基因启动子序列的扩增方法，包括以下步骤：

(1)根据ArCHS基因序列，在转录起始位点300bp以内设计合成如表8所示的巢式特异引物SP1、SP2和SP3，合成如表9所示的热不对称交错PCR(Thermal asymmetricinterlaced PCR,TAIL-PCR)简并引物。

表8 TAIL-PCR扩增的巢式特异引物

表9 TAIL-PCR扩增的简并引物

注:S＝G/C,W＝A/T,N＝A/T/C/G.

(2)以提取的福建金线莲基因组DNA稀释后做模板，以每种简并引物与特异引物SPC1、SPC2和SPC3依次配对，按表10所示的反应体系加样，按表14所示的温度循环程序，进行TAIL-PCR的3轮扩增。

表10 TAIL-PCR反应体系

表11 TAIL-PCR扩增的温度循环

(3)用2％的非变性琼脂糖凝胶电泳分离第三轮扩增产物，结果如图8所示。图8中，M为marker，AD1-AD6为六个简并引物与特异引物扩增的片段的第二轮和第三轮片段。回收纯化简并引物AD3扩增的特异片段。

(4)分析回收特异片段的碱基序列，再使用Plant CARE软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析扩增出的福建金线莲材料的启动子序列，并预测其中的顺式作用元件，结果如图9所示。

实施例8

本实施例提供福建金线莲ArCHS蛋白的亚细胞定位包括以下步骤：

(1)瞬时表达载体的构建：

1.1根据福建金线莲CHS基因ORF序列，在其5’和3’端添加瞬时表达载体构建所需的限制性酶切位点及保护碱基，如图10所示，用Premier 5.0软件设计不含有终止密码子的特异引物[5′-TCCCGGG(Sma I)ATGCCGAGCCTCGAATCCA-3′/5′-CGCGGATCC(Bam I)AAGAGGAACGCTGCGAA-3′]。

1.2以插入CHS基因ORF的pDM19-T质粒为模板，按表4反应体系加样，进行PCR扩增。PCR温度循环体系程序设置为：94℃，3min；98℃10s，62℃30s，72℃60s，扩增循环38次；最后72℃延伸5min。

1.3扩增产物用1％非变性琼脂糖凝胶电泳分离，ChemiDocTMXRS型凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)成像，用凝胶回收试剂盒(天根，北京)回收纯化目的片段。

1.4按表12反应体系加样，使用快切酶在30℃条件下酶切0.5h。酶切产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳分离，用凝胶回收试剂盒(天根，北京)回收纯化。

表12目的片段Sma I/BamHI双酶切反应体系

1.5按照表13反应系统加样，用T4DNA连接酶连接回收纯化的双酶产物，16℃连接8h。

表13连接反应体系

1.6用热激转化法将连接产物转化并对重组菌落进行PCR鉴定。

1.7提取上述步骤中的质粒DNA，经过对应快切酶Sma I和BamH I双酶切鉴定后，取少量质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，验证载体构建正确。

(2)在洋葱鳞茎表皮细胞中检测瞬时表达载体。

2.1取新鲜洋葱鳞茎第5层鳞片，切成2cm×2cm方块，取内表皮铺于1/2MS平板，25℃培养4h。

2.2称取60mg金粉(直径60μm)放置于1.5mL离心管中，向装有金粉的离心管中加1mL 70％乙醇，在涡旋振荡上剧烈震荡15min，以1300g的转速，室温下离心1min，取弃离心管中的上清液体，重复该步骤三次。最后加入无菌水，放入-20℃保存备用。

2.3取5μL金粉悬浮液于1.5mL的进口离心管中，加入1μL瞬时表达载体DNA(1.0μg/μL)、8μL高压灭菌的2.5mol/L CaCl₂、4μL抽滤灭菌的0.1mol/L亚精胺，混合后，在涡旋振荡器上剧烈震荡3min，并在冰浴静置15min。

2.4以1200g的转速，室温条件下，瞬间离心10s，取弃上清液体，加入100μL分析纯浓度的无水乙醇，在涡旋振荡器上震荡重悬金粉。

2.5以12000g的转速，室温条件下，瞬间离心10s，除弃上清液，加入15μL分析纯浓度的无水乙醇，在涡旋振荡器震荡重悬，使液体均匀。

2.6基因枪使用PDS-1000/He型基因枪(Bio-Rad，美国)，设置条件为：样品室真空度26in Hg，可裂膜压力为1100psi，在靶距6cm处。取10μL悬浮液平均点涂在转化载片的中央区域，在上述条件下，将转化载片中央区域包裹着瞬时表达载体的金粉均匀打入培养好的洋葱鳞茎内表皮细胞。

2.7用黑色塑料袋包裹放有转化后的洋葱内表皮的培养基，在25℃下培养。

2.8培养16至24h后，取培养基上的洋葱表皮制片，在BX63型荧光显微镜(Olimpas,日本)下观察拍照。结果如图11所示，亚细胞定位于细胞核中。其中，图11A为pC2300-35S–eGFP的亚细胞定位，图11B为pC2300-35S-CHS-eGFP的亚细胞定位。

实施例9

本实施例提供CHS蛋白的原核表达方法，包括以下步骤：

(1)原核表达载体构建

1.1根据CHS基因ORF序列，在其5’和3’端添加原核表达载体pET28a(+)-CHS(图12)构建所需的限制性酶切位点及保护碱基，用Premier5.0软件设计特异引物，[5’-CGGGATCC(BamHI)ATGCCGAGCCTCGAATCCA-3’/5’-CCAAGCTT(HindШ)TTAAAGAGGAACGCTGCGAA-3’]。

1.2以上述插入CHS基因ORF的pDM19-T质粒为模板，按表4反应体系加样，进行PCR扩增。温度循环程序为：94℃3min；98℃10s，62℃30s，72℃90s，循环36次；72℃5min。

1.3扩增产物用1％非变性琼脂糖凝胶分离，ChemiDocTMXRS型凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)成像，用凝胶回收试剂盒(天根，北京)回收纯化目的片段。

1.4按表12反应体系加样，使用快切酶在30℃条件下酶切0.5h。酶切产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳分离，用凝胶回收试剂盒(天根，北京)回收纯化。

1.5按表13反应系统加样，用T4DNA连接酶连接回收纯化的双酶产物，16℃条件下，至少连接8h。

1.6用热激转化法将连接产物转化并对重组菌落进行PCR鉴定。

1.7提取上述步骤中的质粒DNA，经过对应快切酶BamH I和HindШ双酶切鉴定后，取少量质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，验证载体构建正确。

(2)原核表达：

2.1用热激转化法将构建好的原核表达载体pET28a(+)-CHS转化BL21感受态细胞，并接种于LB平板(含100mg/L卡那霉素)，挑取LB固体培养基平板中的单克隆做菌液PCR检测阳性后，接种于LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)，以150g转速，在37℃条件下，振摇培养过夜。

2.2取培养液按1:100的比例稀释，接种于LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)中，以150g转速，在37℃条件下，培养至OD值约0.6。

2.3取20mL培养液，加入1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)20μL，在38℃诱导条件下，诱导表达2h。

2.4以8000g的转速，室温条件下，离心10min收集菌体，用1/25体积的结合缓冲液[25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、0.5mol/L NaCl、5mmol/L咪唑]重悬，将重悬液体的离心管平稳放入转有冰水混合物的锥形瓶中，使用超声匀浆仪破碎40min，每20min换一次冰水混合物。取部分菌液，以14000g的转速，室温条件下，离心2min，取弃上清液体，收集沉淀，以诱导前的菌体为对照，12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离，并使用考马斯亮蓝染色，结果如图13。图13中，福建金线莲和台湾金线莲CHS蛋白均能被诱导表达。M代表marker，1表示台湾金线莲CHS的pET-28a(+)-CHS未诱导，2表示福建金线莲CHS的pET-28a(+)-CHS未诱导，3表示台湾金线莲CHS的pET-28a(+)-CHS诱导，4表示福建金线莲CHS的pET-28a(+)-CHS诱导。

2.5蛋白纯化：使用结合缓冲液平衡Ni-NTA预装柱，取步骤1.4中的液体，上样后用洗涤缓冲液[(25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、0.5mol/L NaCl、20mmol/L咪唑]洗涤，再使用含有25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、0.5mol/LNaCl、600mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱收集目的蛋白，12％SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染色，结果如图14所示。图14中，M代表marker，1代表台湾金线莲CHS纯化蛋白，2代表3倍浓度台湾金线莲CHS纯化蛋白，3代表福建金线莲CHS纯化蛋白，4代表3倍浓度福建金线莲CHS纯化蛋白。福建金线莲和台湾金线莲CHS蛋白均被纯化。

2.6用置换缓冲液(含10％甘油的磷酸缓冲液)冲洗PD-10柱。

实施例10

本实施例提供超声波破碎菌液和纯化蛋白的CHS酶活性的检测方法：

使用植物CHS酶活性检测试剂盒(ABRaxis,USA)和分光光度计检测具体步骤如下：

(1)开启分光光度计(UV752)，使用100μL的比色皿，波长412nm，每隔5分钟读数，共读数7次(共30分钟)，并置零。

(2)取205μL缓冲液，25μL底物液于离心管中混合；在30℃条件下，温浴3min后加入20μL待测样品(200μg)蛋白，倾倒混匀，分光光度计检测作为空白对照(30分钟度数到0分钟)。

(3)取185μL缓冲液、20μL反应液和25μL底物液于离心管中混匀；在30℃温度条件下，温浴3min后加入20μL待测样品(200μg)蛋白，倾倒混匀，分光光度计检测为样品读数(30分钟度数到0分钟)。

(4)取20μL专性液和20μL待测样品(200μg)蛋白，30℃孵育15min。

(5)165μL缓冲液、20μL反应液和25μL底物液于离心管中混匀；在30℃温度条件下，温浴3min后加入步骤(3)中的40μL液体，倾倒混匀，分光光度计检测为样品读数(30分钟度数到0分钟)。

(6)计算样品间酶活性的相对值，如图15所示。图15A表示体内酶活力，图15B表示体外酶活力。福建金线莲和台湾金线莲CHS虽然翻译蛋白有相同的功能域，但体内酶活力和体外酶活力均不同。

实施例11

本实施例提供CHS基因在水稻中的异源表达，包括如下步骤：

(1)根据CHS基因ORF序列，用Premier 5.0软件设计特异引物，并在其5’-端添加单子叶植物过量表达载体pZZ00026-Ubi-CHS-T-nos(图16)构建所需的限制性酶切位点及保护碱基[5′-TCCCGGG(Sma I)ATGCCGAGCCTCGAATCCA-3′/5′-CGCGGATCC(Bam HI)AAGAGGAACGCTGCGAA-3′]。

(2)以上述插入CHS基因ORF的pDM19-T质粒为模板，按表4反应体系加样，进行PCR扩增。温度循环程序为：94℃预变性3min；98℃10s，62℃30s，72℃60s，此三个温度循环38次；72℃延伸5min。

(3)扩增产物用1％非变性琼脂糖凝胶电泳分离，ChemiDocTM XRS型凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)成像，用凝胶回收试剂盒(天根，北京)回收纯化目的片段。

(4)按表12反应体系加样，使用快切酶在30℃条件下酶切0.5h。酶切产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳分离，用凝胶回收试剂盒(天根，北京)回收纯化。

(5)按表13反应系统加样，用T4DNA连接酶连接回收纯化的双酶产物，16℃条件下，至少连接8h。

(6)用热激转化法将连接产物转化并对重组菌落进行PCR鉴定。

(7)提取上述步骤中的质粒DNA，经过对应快切酶BamH I和HindШ双酶切鉴定后，取少量质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，验证载体构建正确。

(8)将福建金线莲CHS基因ORF单子叶植物过量表达载体pZZ00026-Ubi-CHS-T-nos，热激法转化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株。

(9)将中花11水稻种子去颖消毒后接种到改良N6培养基，诱导愈伤组织。

(10)经继代后，挑选胚性愈伤组织，转接到预培养基暗培养3d左右。

(11)将愈伤组织转接到共培养基上，加活化后的农杆菌悬浮液100mL，19℃暗培养3d后，用无菌ddH₂O清洗3次，加入含400mg/mL噻孢霉素(Cephalothin)的灭菌蒸馏水，以200g的转速，摇晃培养30min。

(12)将共培养后的愈伤组织转接到筛选培养基，在28℃条件下，暗培养20d左右。

(13)转接筛选培养基上的愈伤组织于分化培养基，在28℃条件下，光照培养到分化出幼苗。

(14)转接生根培养基上的分化愈伤组织，在28℃光照培养条件下，到根系充分发育后，炼苗7d左右移栽温室或大田。

实施例11

本实施例提供实施例10的转CHS基因水稻的PCR验证方法，包括以下步骤：

(1)取再生苗脚叶，提取基因组DNA。

(2)用Primerblast软件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)设计特异引物(5’-GCTCACCCTGTTGTTTGGTG-3’/5’-AAGAGGAACGCTGCGAAGAA-3’)，并扩增跨启动子1205bp片段。

(3)1.2％非变性琼脂糖凝胶电泳分离，ChemiDocTM XRS型凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)成像，从再生植株中筛选阳性转基因植株。结果如图17所示。图17中，F表示转台湾金线莲CHS基因，R表示转福建金线莲CHS基因，+表示阳性质粒，-表示未转基因株系。福建金线莲和台湾金线莲CHS基因均转入水稻基因组中。

实施例12

本实施例提供转基因水稻总黄酮含量检测，具体步骤如下：

(1)称取转福建金线莲CHS基因的水稻叶片，烘干研磨粉状样品1.000g于20mL于锥形瓶中，重复3次。

(2)加入95％乙醇10mL，在KQ-100DV型超声波仪(昆山市超声仪器有限公司)内，30℃提取30min，用3μm滤纸过滤，收集滤液。

(3)残渣加同样浓度乙醇，按步骤(2)再次超声波提取，3μm滤纸过滤，收集滤液，与步骤(2)滤液合并。

(4)取上述滤液各2mL(空白对照加入2mL 95％的乙醇)，加入100g/L Al(NO3)31mL、9.8g/L醋酸钾1mL，摇匀后静置30min。

(5)用1cm比色杯，在UV-1800型紫外-可见分光光度计(岛津，日本)上，测定415nm吸光值。结果如图18所示。福建金线莲CHS基因转入水稻后，与台湾金线莲CHS基因转入水稻，对水稻黄酮含量的改变不同。图18中，F表示转台湾金线莲CHS基因，R表示转福建金线莲CHS基因(R-1和R-2分别代表转福建金线莲CHS基因得到的两个独立的转化事件)，*表示差异显著，**表示差异极显著。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 三明学院

<120> 一种来源于福建金线莲的查尔酮合成酶基因及其应用

<130> 1182626

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1173

<212> DNA

<213> 福建金线莲

<400> 1

atgccgagcc tcgaatccat ccggaaggcg cccagagccg acggcttggc ctccatattg 60

gccatcggca gggccaatcc cgacaacttc atggaacaaa gcagcttccc cgacttcttc 120

ttccgcatca ccggcagcga ccacttggtc gacctcaaga agaaattcca gcgcatatgt 180

gataggacgg caattaggaa gcgtcatttt gtctggaacg aagagttcat caaggccaac 240

ccttgcttta gcaccttcat ggacaactct ttgaacgtca ggcaagaggt agcgataagg 300

gagataccga agctgggcgc agaggcggcc accaaggcaa tcaaggagtg ggggcagccc 360

aagtcacgca tcacccacct catcttctgc accaccagcg gcatggattt gcctggcgcg 420

gactatcagc tcacccgaat ccttggcctc aacccgaacg tcgagagggt gatgctctac 480

caacaaggat gttttgctgg cggaaccacg ctccggctag ccaagtgcct tgccgagagc 540

cgcaagggcg cacgtgttct tgtcgtttgt gcagagacca ccacggtgct ctttcgcgca 600

ccttctgagg agcaccaaga ggaccttgtc actcaagctc tgtttgcgga tggcgcctcg 660

gcagttatag ttggcgccga cccggatgag gaggcacatg aaaaggccag cttcgtcatc 720

ttctccacat ctcaggtatt attgccagac tcggaaggtg caattggagg gcatgtatct 780

gagggaggcc tcttagccac gcttcacagg gacgtcccac aacttgtttc caaaaatgta 840

ggaaagtgct tagaagaggc gttcactccg ctgggcatct cggactggaa ctccatcttc 900

tgggtgccgc acccaggagg acgggccatt ctagaccaaa tcgaggagag ggtggggctg 960

aagccggaga aactaaccac ttccaggcac gtgcttgctg agtacggtaa catgtcaagc 1020

gtgtgtgtgc actttgttct ggatgagatg cgcaagaagt cttcaaaaga aggtaaagct 1080

acgacaggtg agggcctcga gtggggagtg ctcttcggat tcgggcctgg cctgactgtc 1140

gaaactgtag ttcttcgcag cgttcctctt taa 1173

<210> 2

<211> 390

<212> PRT

<213> 福建金线莲

<400> 2

Met Pro Ser Leu Glu Ser Ile Arg Lys Ala Pro Arg Ala Asp Gly Leu

1 5 10 15

Ala Ser Ile Leu Ala Ile Gly Arg Ala Asn Pro Asp Asn Phe Met Glu

20 25 30

Gln Ser Ser Phe Pro Asp Phe Phe Phe Arg Ile Thr Gly Ser Asp His

35 40 45

Leu Val Asp Leu Lys Lys Lys Phe Gln Arg Ile Cys Asp Arg Thr Ala

50 55 60

Ile Arg Lys Arg His Phe Val Trp Asn Glu Glu Phe Ile Lys Ala Asn

65 70 75 80

Pro Cys Phe Ser Thr Phe Met Asp Asn Ser Leu Asn Val Arg Gln Glu

85 90 95

Val Ala Ile Arg Glu Ile Pro Lys Leu Gly Ala Glu Ala Ala Thr Lys

100 105 110

Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln Pro Lys Ser Arg Ile Thr His Leu Ile

115 120 125

Phe Cys Thr Thr Ser Gly Met Asp Leu Pro Gly Ala Asp Tyr Gln Leu

130 135 140

Thr Arg Ile Leu Gly Leu Asn Pro Asn Val Glu Arg Val Met Leu Tyr

145 150 155 160

Gln Gln Gly Cys Phe Ala Gly Gly Thr Thr Leu Arg Leu Ala Lys Cys

165 170 175

Leu Ala Glu Ser Arg Lys Gly Ala Arg Val Leu Val Val Cys Ala Glu

180 185 190

Thr Thr Thr Val Leu Phe Arg Ala Pro Ser Glu Glu His Gln Glu Asp

195 200 205

Leu Val Thr Gln Ala Leu Phe Ala Asp Gly Ala Ser Ala Val Ile Val

210 215 220

Gly Ala Asp Pro Asp Glu Glu Ala His Glu Lys Ala Ser Phe Val Ile

225 230 235 240

Phe Ser Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Asp Ser Glu Gly Ala Ile Gly

245 250 255

Gly His Val Ser Glu Gly Gly Leu Leu Ala Thr Leu His Arg Asp Val

260 265 270

Pro Gln Leu Val Ser Lys Asn Val Gly Lys Cys Leu Glu Glu Ala Phe

275 280 285

Thr Pro Leu Gly Ile Ser Asp Trp Asn Ser Ile Phe Trp Val Pro His

290 295 300

Pro Gly Gly Arg Ala Ile Leu Asp Gln Ile Glu Glu Arg Val Gly Leu

305 310 315 320

Lys Pro Glu Lys Leu Thr Thr Ser Arg His Val Leu Ala Glu Tyr Gly

325 330 335

Asn Met Ser Ser Val Cys Val His Phe Val Leu Asp Glu Met Arg Lys

340 345 350

Lys Ser Ser Lys Glu Gly Lys Ala Thr Thr Gly Glu Gly Leu Glu Trp

355 360 365

Gly Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Val Glu Thr Val Val

370 375 380

Leu Arg Ser Val Pro Leu

385 390

<210> 3

<211> 1256

<212> DNA

<213> 福建金线莲

<400> 3

atgccgagcc tcgaatccat ccggaaggcg cccagagccg acggcttggc ctccatattg 60

gccatcggca gggccaatcc cgacaacttc atggaacaaa gcagcttccc cgacttcttc 120

ttccgcatca ccggcagcga ccacttggtc gacctcaaga agaaattcca gcgcatatgt 180

aagccgccct cgctctctcc ctgtactctc tcccttttag caaagctatg aacaaagatt 240

ggaattgata tataatcatc tgcgatagga cggcaattag gaagcgtcat tttgtctgga 300

acgaagagtt catcaaggcc aacccttgct ttagcacctt catggacaac tctttgaacg 360

tcaggcaaga ggtagcgata agggagatac cgaagctggg cgcagaggcg gccaccaagg 420

caatcaagga gtgggggcag cccaagtcac gcatcaccca cctcatcttc tgcaccacca 480

gcggcatgga tttgcctggc gcggactatc agctcacccg aatccttggc ctcaacccga 540

acgtcgagag ggtgatgctc taccaacaag gatgttttgc tggcggaacc acgctccggc 600

tagccaagtg ccttgccgag agccgcaagg gcgcacgtgt tcttgtcgtt tgtgcagaga 660

ccaccacggt gctctttcgc gcaccttctg aggagcacca agaggacctt gtcactcaag 720

ctctgtttgc ggatggcgcc tcggcagtta tagttggcgc cgacccggat gaggaggcac 780

atgaaaaggc cagcttcgtc atcttctcca catctcaggt attattgcca gactcggaag 840

gtgcaattgg agggcatgta tctgagggag gcctcttagc cacgcttcac agggacgtcc 900

cacaacttgt ttccaaaaat gtaggaaagt gcttagaaga ggcgttcact ccgctgggca 960

tctcggactg gaactccatc ttctgggtgc cgcacccagg aggacgggcc attctagacc 1020

aaatcgagga gagggtgggg ctgaagccgg agaaactaac cacttccagg cacgtgcttg 1080

ctgagtacgg taacatgtca agcgtgtgtg tgcactttgt tctggatgag atgcgcaaga 1140

agtcttcaaa agaaggtaaa gctacgacag gtgagggcct cgagtgggga gtgctcttcg 1200

gattcgggcc tggcctgact gtcgaaactg tagttcttcg cagcgttcct ctttaa 1256

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgccgagcc tcgaatcca 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttaaaagggaacgctgcgaa 19

Claims (7)

1.一种来源于福建金线莲的查尔酮合酶基因，其特征在于，所述查尔酮合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的查尔酮合酶基因，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求1所述的查尔酮合酶基因，其特征在于，其编码区序列如SEQ ID NO：3所示。

4.含有权利要求1所述的查尔酮合酶基因的重组质粒。

5.如权利要求4所述的重组质粒体，其特征在于，所述质粒为pC2300-35S-CHS-eGFP、pET28a(+)-CHS或pZZ00026-Ubi-CHS-T-nos。

6.一种如权利要求1所述的查尔酮合酶基因在调控水稻黄酮含量中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

S1，将福建金线莲的查尔酮合酶基因的ORF序列，插入到pZZ00026-Ubi-CHS-T-nos质粒中，得到表达载体；

S2，将所述表达载体转化至农杆菌后，用转化后的所述农杆菌对水稻进行侵染转化，得到转基因水稻。