CN110484536A - 启动子GmLCLa1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及启动子GmLCLa1及其应用。本发明提供启动子GmLCLa1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该启动子可驱动目标基因在持续光照条件下近24小时节律性表达，且表达峰值在清晨。启动子GmLCLa1可用于在作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物中驱动目标基因进行近24小时节律性表达，并使目标基因表达峰值出现在清晨。

Description

启动子GmLCLa1及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及启动子GmLCLa1及其应用。

背景技术

生物钟是生物适应外界环境节律性变化的重要调控机制。植物生物钟分为输入途径、核心振荡器和输出途径三个部分。输入途径主要包括光、温度和营养等环境信号；生物钟核心振荡器是多重“转录-翻译反馈调控环路”构成的精细调控机制；输出途径包括基因的节律性表达、蛋白的修饰、下胚轴节律性伸长和胁迫响应等过程，涉及植物生长发育和代谢等众多生物学进程。生物钟在杂种优势、引种驯化等发面也发挥重要作用。

植物生物钟核心组分可以直接或以复合体形式结合靶基因启动子区DNA序列，调控基因的转录。已有报道拟南芥CCA1可以结合EE和CBS顺式作用元件，其主要发挥转录抑制的活性；ChIP-seq实验结果表明，在持续光照条件下CCA1可以结合在超过1000个基因的启动子区。CCA1的靶基因参与众多生长发育生物过程和胁迫响应，表明CCA1在调控基因转录和植物生长发育及抗逆方面发挥重要功能。清晨表达的RVE8同样可以结合EE顺式作用元件，其可以激活靶基因的表达。

拟南芥生物钟核心振荡器中的PRR9、PRR7、PRR5和TOC1所调控的基因启动子区均富含G-box顺式作用元件，PRR9、PRR7、PRR5和TOC1从清晨至夜间依次出现表达峰值，共同调控靶基因的表达。在夜间出现表达高峰的LUX结合的DNA序列(LBS)为GATWCG，LUX与ELF3、ELF4形成复合体的形式调控基因的转录。开发植物节律性表达启动子对于调控植物基因的表达、植物的节律性调控以及具有优良性状植物的育种具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供大豆启动子GmLCLa1，该启动子可驱动目标基因进行近24小时节律性表达，并使目标基因表达峰值出现在清晨。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供大豆近日节律性表达启动子GmLCLa1，其具有如下任一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所获得的具有同等功能的由(1)衍生的核苷酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少70％同源性，且具有同等功能的由(1)衍生的核苷酸序列；优选地，所述同源性为至少80％；更优选为至少90％；

(4)在严格条件下能够与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

大豆GmLCLa1基因(基因号：Glyma16g01980)的功能和表达调控机制目前尚不明确，本发明发现大豆GmLCLa1基因的上游序列可调控基因呈现近日节律性表达趋势，但是，选取GmLCLa1基因上游不同长度的序列片段，其驱动基因节律性表达的相位和表达强度明显不同。本发明通过大量筛选和验证实验发现序列如SEQ ID NO.1所示的启动子可高效驱动基因呈现明显的近日节律性表达，且表达峰值在清晨。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开序列如SEQ ID NO.1所示的启动子GmLCLa1，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到启动子GmLCLa1的突变序列。具体地，这种突变方式可为如下突变方式中的至少一种：将第61位的A取代为T,将第180位的G取代为A,将第321位的T取代为G。

第二方面，本发明提供含有所述启动子GmLCLa1的表达盒或载体。

本发明中，所述含有启动子GmLCLa1的表达盒可以为在启动子GmLCLa1的下游可操作地连接任意目标基因序列得到的表达单元。

本发明中，所述含有启动子GmLCLa1的载体可以为克隆载体、表达载体、整合载体或转座子等任意本领域已知的载体，只要含有启动子GmLCLa1的载体均在本发明的保护范围内。

第三方面，本发明提供含有所述启动子GmLCLa1或所述表达盒或所述载体的宿主细胞、工程菌或转化植物细胞。

本发明中，所述工程菌包括但不限于大肠杆菌、农杆菌等。

上述转化植物细胞为非繁殖性植物细胞。

第四方面，本发明提供所述启动子GmLCLa1或所述表达盒或所述载体或所述宿主细胞、工程菌或转化植物细胞在调控基因近日节律性表达中的应用。

上述调控基因近日节律性表达可为使得基因的表达呈现近日节律性或提高基因的近日节律性表达水平。

第五方面，本发明提供所述启动子GmLCLa1或所述表达盒或载体或所述宿主细胞、工程菌或转化植物细胞在植物近日节律性调控中的应用。

第六方面，本发明提供所述启动子GmLCLa1或所述表达盒或载体或所述宿主细胞、工程菌或转化植物细胞在制备转基因植物或植物种质资源改良中的应用。

本发明中，所述植物包括作物、林木、蔬菜、花卉或牧草。

优选地，所述植物为作物。所述作物包括但不限于大豆、玉米、水稻、棉花等。更优选地，所述植物为大豆。

第七方面，本发明提供一种调控基因近日节律性表达的方法，其为将所述基因可操作性地连接于所述启动子GmLCLa1的下游，以启动子GmLCLa1驱动所述基因的表达。

第八方面，本发明提供一种调控植物近日节律性的方法，其为将含有启动子GmLCLa1的表达盒或载体导入植物中，驱动植物基因的近日节律性表达。

第九方面，本发明提供用于特异性扩增所述启动子GmLCLa1的引物，其具有如SEQID NO.2-3所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO.2：正向引物：5’-ATGTGTTATACAAGAGAAGTTGAACCG-3’；

SEQ ID NO.3：反向引物：5’-TACAGGACGTGAGCAGCTAG-3’。

第十方面，本发明提供含有如SEQ ID NO.2-3所示的引物的试剂盒。

本发明的有益效果至少包括：本发明首次分离了大豆基因GmLCLa1的启动子，该启动子具有驱动基因进行近24小时节律性表达的功能，且能够使得基因的表达峰值在清晨。GmLCLa1启动子可用于在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物中近日节律性表达目标基因，并使目标基因的表达峰值出现在清晨，在植物的节律性调控、具有优良性状的转基因植物构建和育种中具有较高的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例2中pH2GW7Δ-GmLCLa1:LUC在大豆发状根中表达的生物发光信号检测结果；其中，A为发状根明场成像；B为发状根的生物发光成像；C为明场和生物发光成像重叠的结果。

图2为本发明实施例2中pH2GW7Δ-GmLCLa1:LUC在大豆发状根中表达的节律性分析结果；其中，A为节律性表达的曲线图；B为节律性表达的周期分析。

图3为本发明实施例3中利用qRT-PCR检测大豆叶片和发状根中GmLCLa1的节律性表达；其中，Leaves代表叶片，Hairy roots代表发状根。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，其中，pENTR-LUC质粒可购自addgene(https://www.addgene.org/17473/)。

实施例1大豆GmLCLa1启动子的克隆

利用正向引物5’-cgggatccATGTGTTATACAAGAGAAGTTGAACCG-3’(SEQ ID NO.4)，和反向引物：5’-ggggtaccTACAGGACGTGAGCAGCTAG-3’(SEQ ID NO.4)从大豆基因组中PCR扩增获得长度为4034bp的GmLCLa1启动子，经测序验证，GmLCLa1启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。为方便后续与载体连接，PCR产物两端分别带有BamH I和Kpn I的酶切位点及保护碱基。

上述PCR扩增体系(总体积为20μl)如下：

PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃3min，共28个循环；72℃10min。

实施例2利用大豆GmLCLa1启动子驱动LUC基因的表达

将实施例1中PCR克隆得到GmLCLa1启动子的切胶回收产物用BamH I和Kpn I双酶切。将载体pENTR-1A-LUC⁺(为便于连接目的片段，pENTR-1A-LUC⁺为在质粒pENTR-LUC的基础上修改多克隆位点得到，参见Xie Q,et al.(2014)LNK1 and LNK2 are transcriptionalcoactivators in the Arabidopsis circadian oscillator.Plant Cell26(7):2843-2857.)用BamH I和Kpn I双酶切，回收后与GmLCLa1启动子的回收片段用T4 DNA连接酶(Thermo公司，货号EL0014)连接。获得中间载体pENTR-GmLCLa1:LUC，再利用LR反应试剂盒(Thermo公司，货号11791019)将其重组至植物表达载体pH2GW7Δ(Xie Q,et al.(2014)LNK1 and LNK2 are transcriptional coactivators in the Arabidopsis circadianoscillator.Plant Cell 26(7):2843-2857.)，并转化至大肠杆菌DH5α中扩繁，获得重组植物表达载体pH2GW7Δ-GmLCLa1:LUC。

大肠杆菌感受态细胞的转化和载体鉴定的具体操作如下：

(1)配置含抗生素的LB固体培养基；

(2)将超低温冰箱中保存的感受态细胞在冰浴中融化，加入5μl连接产物或LR反应产物，轻轻混匀，冰浴中静置25分钟；

(3)42℃水浴锅中热激90秒，然后立即在冰浴中静置5分钟；

(4)加入500μl LB液体培养基，37℃摇床振荡培养1小时(转速为150rpm)；

(5)取100μl细菌恢复培养液均匀涂于筛选培养基上，37℃倒置培养约15小时，挑取3个单菌落摇培；

(6)提取质粒后酶切鉴定并测序。

将鉴定正确的重组植物表达载体转化发根农杆菌K599，得到阳性转化发根农杆菌K599。

利用发根农杆菌介导的转化方法，将pH2GW7Δ-GmLCLa1:LUC转入大豆WS82，通过生物发光信号筛选获得转化pH2GW7Δ-GmLCLa1:LUC的发状根(图1)。

发根农杆菌介导大豆转化的具体方法如下：

(1)取出氯气熏蒸法灭菌12个小时的大豆种子，置于超净工作台吹净剩余氯气后，用无菌的超纯水浸泡约16小时，备用；

(2)挑取带有pH2GW7Δ-GmLCLa1:LUC的发根农杆菌K599单克隆在试管中用液体YEP培养基小摇，再转至锥形瓶中摇培至菌液OD₆₀₀约为1.0。4000rpm离心10分钟收集菌体，重悬于转化介质(1/10X Gamborg B₅盐,30g/L蔗糖,3.9g/L MES,pH 5.4.灭菌后加入40mg/L乙酰丁香酮)中；

(3)切下吸涨后大豆的胚根，以下胚轴为外植体，将外植体在重悬菌液中浸入30分钟，完成侵染后在滤纸上吸干浸染液，将侵染后的大豆外植体置于共培养培养基(1/10XGamborg B₅盐,30g/L蔗糖,3.9g/L MES,4.25g/L琼脂,pH 5.4.灭菌后加入Cysteine400mg/L,and 40mg/L乙酰丁香酮)上避光培养3天；

(4)将共培养后的大豆外植体的下胚轴插入发根诱导培养基(1X Gamborg B₅盐,30g/L蔗糖,and 0.59g/L MES,7g/L琼脂，pH 5.7.灭菌后加入Cefotaxime 100mg/L)中，长日照条件培养10-14天诱导发根。

对筛选得到的转化pH2GW7Δ-GmLCLa1:LUC的发状根在25℃、持续光照条件下连续检测LUC活性，转化株的LUC生物发光检测方法具体如下：

(1)将转化获得的pH2GW7Δ-GmLCLa1:LUC的发状根从外植体上切下，于12.5μM萤火虫荧光素中浸泡1分钟，使用生物发光成像仪检测生物发光；

(2)将筛选出的生物发光信号较强的发状根切为约1cm小段，放入含有固体培养基的96孔板中，每孔加入40μl萤火虫荧光素酶底物(1.25mM)，在25℃、持续光照条件下使用TopCount生物发光检测仪连续检测生物发光信号。

生物发光检测结果如图2所示，GmLCLa1启动子在植物的根中节律性表达(图2的A)。对生物发光检测结果数据进一步分析发现，GmLCLa1启动子节律性表达的周期约为26小时，其在清晨出现表达峰值(图2的B)。

上述结果表明，GmLCLa1启动子可用于在包括各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等在内的各种植物中驱动目标基因近24小时基因节律性表达，且使得目标基因的表达峰值出现在清晨。

实施例3大豆GmLCLa1基因的节律性表达检测

利用qRT-PCR检测大豆叶片和发状根中大豆GmLCLa1基因的表达情况，结果如图3所示，在持续光照条件下，大豆叶片和发状根中GmLCLa1基因均呈现近24小时节律性表达，且表达峰值出现在清晨，表明GmLCLa1启动子可驱动植物基因进行近24小时基因节律性表达，并使得其表达峰值出现在清晨。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 河南大学

<120> 启动子GmLCLa1及其应用

<130> KHP191114330.3

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4034

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtgttata caagagaagt tgaaccgttt ttccccattt cttaaattca tttatggtac 60

atatgcttta atttggtgtc ttttctttac tgttcgttat cttttgactt cttttaagtg 120

gaaataatat aaactttctt gaagagatat gaattttatt gaactaaaaa gaattgagag 180

aaaaataaat tggagtaaga ataaagaatt tttgaaatca taaagatttt tcataatatt 240

atttattcat aaattattat atatgataaa taattaaata tgttacttta tgatagttat 300

cttaaaagtg ataccaaaaa taatttttat atagttgata caagttatat caatatcgaa 360

agtaaaaaaa aaaaatgaag caaaaagagt tacatcaata taacttgtgg aaacatacca 420

tctttaaaaa tatttagaca tagttcaaaa aaattataaa tattagataa atgatgtaca 480

tgttttattt ttgtttttta tgggcaagta catgttggat gttataattt tatattagga 540

attgaaaaaa aaaatcaaga aagtaaaatg tcatggccag gttaaaaagg gtcatatata 600

gattcgtgca aaatctaaaa atagagaaca aacatagctc gagcaaatta acaatgaaac 660

acatacacta acacacaatt ataaagagtc acagattcac ggtaacaaag aacacgcatt 720

aacaatgaaa aatacacatt aacaaagagt aaacacactg atatatagca aacacactta 780

ctaactgact aacacacact agtaaatagc aaacataaag taacaatgac aaactaggag 840

caagaatgca tgacacgaga atgtgtcagc attttagcct gagactaatt aatggcaact 900

gattagaaag taaatttcta cactagttaa attaaaaacc aatctaaaga atttactatg 960

atttttttaa atgataagat cgacactcac atttaagatt aattggggaa ccaatttagg 1020

tataaaaaaa aaattctata tcaatttttt cattcaacta atcttttttt ttttctagac 1080

ctatttttta gtaactactt ttgtttgttt tttctgagat ttatcagcga gccaatgttc 1140

catttcaaga ctagttcctt tagccatata gagattagat tttgtcaaat ccaacaaaat 1200

tttctccata ttcatgcatt attagaaatt taatttctaa taatatgctt aaagaatcca 1260

attatttatc aacttatcaa ttgtgttaaa aatatatttt tttttaacta tcatggttag 1320

gacctttgac ttttccatga atcttaaagt attattacaa atttcagatc tttggattaa 1380

ctataaaact atctcaattt taaatttaat catatttaaa gtttattttc ctgtttaaaa 1440

gtgtattata tagagctcaa tcatccaagt cttccctggc aatcttaacg gatattatta 1500

tctgagttat gtctattaaa ttgtgttaga aaaaattgat attaactaat gtaaaatatt 1560

caatatcaat attacaaaaa tatccacaca ttacatcaat ttttagacaa ttgatataga 1620

cattgaatgt gaaaaatata ttttaaacta gtgacgtatt cgccgtgtgt gtgtttttaa 1680

ttcaaatctt taggacaagt tattattcat ttgttatttg tgattttatg ttgtgccaaa 1740

aaatattcca ctatcaggct ttattaagtt gtggaggata aaaatattct tttgtcatta 1800

aacagatgaa aaaaaaagag cgaaacaaag ttataattgt gtattcaact gaaaaaagta 1860

aaaaatataa ttatattaaa taactgttac atctttttaa tataaaataa ctgtgactaa 1920

gcggtaaaaa agataaaagg attgtttgaa agctttctcc tgtgtttcat tttctcttat 1980

tttagaagaa aaacctttta tgtaaattct actatattta tttttccttt cttttttttt 2040

ccagccaaaa taaaatgttc attttttttc tacatcagct ttaatttgct cttttaaatt 2100

tttacctgtc aaaatgatgt atgaatattc tttaggactt ttcttcctag gggatctggt 2160

taattatttt ataaaggaat ttttttccta aatttaatat ataaacacaa tacatgtata 2220

tatttaaaat ttgtttgttg taccaaaaaa aaatatttgt attattttta aaataaaata 2280

aaactacact tttaattatt ttcctaagac aaaatatata aaacagtaaa acatggcatg 2340

atgataagga taattaaccc atataagaaa aatgttcaaa gtagaaaaca aaagcactgc 2400

aagaaccgta caggttcgca cctgataaca gtgtaactca cattctcact cactaaaaac 2460

gcacacgtgt ccaccgcacg cacgaatgga acacccacca ataaaccccc aaagaattgc 2520

cacgtgtcgg tgaccggaaa gtgagtggcc acgctgggcg aatatcccac cactaagccc 2580

aaatggccca ctcgttgcgc aactgggtga ccgggtacag ccggtcgacc tcgccacgtc 2640

acctgcgggc ccccaccgtc acaagctggc gacgctttta cggacctaaa acctcagcca 2700

tgatgaagtt tgtggatgag attcgaggag gaaaaaaaaa gattaaaagc ttaaagcctc 2760

atcccaaaaa aataaataaa aaaagaaagt gataaaaaaa aaataggaaa agtgcaaagg 2820

taagcatcag caccaatagc cagtaaattt gcgccacttg tcgcgatcgt acacgccaaa 2880

gcttctccgt ctcaaaaata aaaaataacg agtcgttaat ttccgaaaca aaaaaaatat 2940

aaatccacac gaaattgtag tggctgagat tgctcctcgc gcttaaacac tttcgggcga 3000

gtgtgtgtgt agcagtttct ggttctgttt ttggtttcgt ttcagcaaaa cctctcttct 3060

tcttctgatt gattccacct cgcgattttt cgattttcgt ttgttttctt ctttttcggt 3120

ttctgatctg aactcgattc gattcgctat tgccggaaaa tgagtcctcc ggcaagtgtc 3180

cggtgatgat cgctccctcg agaggttgtt gaggttatcg ttgttgttct tcgaagtcat 3240

ggtttcgatc tgaggtattc gttttccttt ttatattttt tagtttaatt taatttgttc 3300

tgtttggttt ccgagaaaat tgaagcgaac tgcgaacgga tttacctcat ctggatttgg 3360

atgtaacagg tgctgtcagt gctcacagcg cgacgctgtt gagttgaaat ttcgctggtt 3420

ttgagttgct ttgtgactaa ttttttttct cggcaaccaa acaggaggat tcaaaatttg 3480

cactgattaa ttagtaaagt atatttgtga aagtgaagat agaaatggtt gttgttgttg 3540

aatttgtgat gtgatttttc ttgtttctgt actaattgta gtttctctct ctcttttttc 3600

gcgtttgaaa ggttttggcg ctctcgagtt cgttttggtg aggattctga ttaaggaaaa 3660

ttttctttta ttcattcgga ggagaagcgt ctcaaactct ctctctttct ccctcggttg 3720

tttatttttg aaattttatt ttcctttttc ttctatgtag tactgtttta cgtgtgacat 3780

gtgaattgga atgcttattc cagcttatac aaaacagaga cggatctctt cctattgttc 3840

tcgctttgtt tcttttgcag tagcatcatc atcatcacca taccttgttc agattctgct 3900

cactttcacc acaacggctt tactatttac cgcgtttcgt tttcgtgtca ccgcaaataa 3960

tgaaaggagg tgttccctgt atccactcct cgtcagggaa gatctgaagc agtgctagct 4020

gctcacgtcc tgta 4034

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtgttata caagagaagt tgaaccg 27

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacaggacgt gagcagctag 20

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgggatccat gtgttataca agagaagttg aaccg 35

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggtaccta caggacgtga gcagctag 28

Claims (10)

1.启动子GmLCLa1，其特征在于，其具有如下任一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所获得的具有同等功能的由(1)衍生的核苷酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少70％同源性，且具有同等功能的由(1)衍生的核苷酸序列；

(4)在严格条件下能够与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述的启动子GmLCLa1的表达盒或载体。

3.含有权利要求1所述的启动子GmLCLa1或权利要求2所述的表达盒或载体的宿主细胞、工程菌或转化植物细胞。

4.权利要求1所述的启动子GmLCLa1或权利要求2所述的表达盒或载体或权利要求3所述的宿主细胞、工程菌或转化植物细胞在调控基因近日节律性表达中的应用。

5.权利要求1所述的启动子GmLCLa1或权利要求2所述的表达盒或载体或权利要求3所述的宿主细胞、工程菌或转化植物细胞在植物近日节律性调控中的应用。

6.权利要求1所述的启动子GmLCLa1或权利要求2所述的表达盒或载体或权利要求3所述的宿主细胞、工程菌或转化植物细胞在制备转基因植物或植物种质资源改良中的应用。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述植物包括作物、林木、蔬菜、花卉或牧草。

8.一种调控基因近日节律性表达的方法，其特征在于，将所述基因可操作性地连接于权利要求1所述的启动子GmLCLa1的下游，以启动子GmLCLa1驱动所述基因的表达。

9.用于特异性扩增权利要求1所述的启动子GmLCLa1的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示。

10.含有权利要求9所述的引物的试剂盒。