CN112442502A - 启动子GmLHY在调控基因时间特异性响应光信号中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及启动子GmLHY在调控基因时间特异性响应光信号中的应用。本发明提供一种能够在特定时间响应光信号调节基因近日节律性表达相位的大豆启动子GmLHY，由该启动子驱动的基因，不仅可呈现近日节律性表达，而且，还可在特定时间的光照处理条件下改变节律性表达的相位，在植物基因表达调控以及具有优良性状的转基因植物构建和育种中具有较高的应用价值。

Description

启动子GmLHY在调控基因时间特异性响应光信号中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及启动子GmLHY在调控基因时间特异性响应光信号中的应用。

背景技术

生物钟是维持植物自身生长发育和物质代谢与环境昼夜节律同步化的内源分子机制。CCA1(CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1)是植物中第一个被克隆的生物钟基因，CCA1和其同源基因LHY(LATE ELONGATED HYPOCOTYL)在清晨表达，CCA1和LHY形成同源和异源二聚体，通过结合靶基因启动子区抑制TOC1等基因的表达。能够驱动基因节律性表达的启动子的发现对于植物的基因表达和节律性调控具有重要作用，而可在特定时间响应光信号调节节律表达方式的启动子对于改变基因的节律性表达方式提供了有力的分子工具。

发明内容

本发明的目的是提供能够调控基因时间特异性响应光信号调控近日节律性表达的大豆启动子。

为实现上述目的，本发明对大豆中参与生物钟调控并呈现节律性表达的基因上游序列(启动子区)进行了大量筛选，本发明发现，有些基因的启动子区虽然能够调控基因呈现近日节律性表达，但在持续黑暗条件下不能维持稳健的节律性；有些基因的启动子区虽然能够响应光照处理，但并不能调整节律性表达的相位。本发明发现，GmLHY基因(基因ID：Glyma07g05410)的上游序列能够在环境温度恒定、持续黑暗条件下节律性表达，且能够通过在不同的特定时间响应光照处理，实现基因近日节律性表达相位的前移和后置的双向调节。本发明还发现选取GmLHY基因上游不同长度的序列片段，其对于光信号的响应以及节律性表达的相位和表达强度明显不同，其中，如SEQ ID NO.1所示的启动子可高效驱动基因时间特异性响应光信号调节近日节律性表达的相位。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供启动子GmLHY或含有所述启动子GmLHY的表达盒、载体或微生物在调控基因在植物中近日节律性表达中的应用。

第二方面，本发明提供启动子GmLHY或含有所述启动子GmLHY的表达盒、载体或微生物在驱动目标基因在环境温度恒定、持续黑暗条件下近日节律性表达中的应用。

第三方面，本发明提供启动子GmLHY或含有所述启动子GmLHY的表达盒、载体或微生物在检测植物在环境温度恒定、持续黑暗条件下的近日节律表型中的应用。

第四方面，本发明提供启动子GmLHY或含有所述启动子GmLHY的表达盒、载体或微生物在通过环境光信号处理，时间特异性调控目标基因在植物中节律性表达相位中的应用。

优选地，所述调控近日节律性表达的相位为近日节律性表达的相位的前移或后置。

具体地，在“清晨”进行光信号处理，近日节律性表达相位前移，在“下午”进行光信号处理，近日节律性表达相位不变，在“夜间”进行光信号处理，近日节律性表达相位后置。

第五方面，本发明提供启动子GmLHY或含有所述启动子GmLHY的表达盒、载体或微生物在植物时间特异性响应光信号的近日节律性调控中的应用。

本发明所述的光信号处理具体为光照处理，所述光照处理优选为在温度恒定条件下，使用光强在≥50μmol/m²/s的白光处理，优选为在光强≥100μmol/m²/s的白光处理。

第六方面，本发明提供启动子GmLHY或含有所述启动子GmLHY的表达盒、载体或微生物在制备植物近日节律性改变的转基因植物中的应用。

本发明所述的植物优选为双子叶植物，更优选为豆科植物，最优选为大豆。

本发明所述的启动子GmLHY的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的含有启动子GmLHY的表达盒可以为在启动子GmLHY的下游可操作地连接任意目标基因序列得到的表达单元。

本发明所述的含有启动子GmLHY的载体可以为克隆载体、表达载体、整合载体或转座子等任意本领域已知的载体。

本发明所述的微生物包括但不限于大肠杆菌、农杆菌等。

本发明所述的基因可以为功能基因、功能基因的反义基因或能够干扰功能基因表达的小RNA基因。

第七方面，本发明提供一种调控基因在植物中时间特异性响应光信号调控近日节律性表达的方法，该方法具体为：将所述基因可操作性地连接于启动子GmLHY的下游，以启动子GmLHY驱动所述基因在植物中时间特异性响应光信号改变近日节律性表达的相位。

具体地，所述方法包括：将所述基因可操作性地连接于启动子GmLHY的下游，以启动子GmLHY驱动所述基因的表达；将含有启动子GmLHY的表达盒或载体导入植物中。

以上所述的方法中，所述植物优选为双子叶植物，更优选为豆科植物，最优选为大豆。

以上所述的方法中，所述启动子GmLHY的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的有益效果至少包括：本发明提供一种能够在特定时间响应光信号调节基因近日节律性表达相位的大豆启动子GmLHY，由该启动子驱动的基因，不仅可呈现近日节律性表达，而且，还可在特定时间的光照处理条件下改变节律性表达的相位，在植物基因表达调控以及具有优良性状的转基因植物构建和育种中具有较高的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例2中转化pH2GW7Δ-GmLHY:LUC的大豆中LUC基因在大豆发状根中表达的生物发光信号检测结果；其中，A为发状根明场成像；B为发状根的生物发光成像的结果，箭头所指为获得的转化阳性发状根。

图2为本发明实施例3中在不同时间点进行光照处理，转化pH2GW7Δ-GmLHY:LUC的大豆中LUC基因在大豆发状根中时间特异性响应光信号调节节律性表达相位的分析结果，其中，A为在清晨进行3小时的光照处理，GmLHY:LUC表达相位前移；B为在下午进行3小时的光照处理，GmLHY:LUC表达相位无明显变化；C为在夜间进行3小时的光照处理，GmLHY:LUC表达相位后置。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1大豆GmLHY启动子的克隆

利用正向引物5’-CGGGATCCAGACGTGAAACCTCATATTAGTTCC-3’(SEQ ID NO.2)，和反向引物：5’-GGGGTACCTAGAGGACGTGTGCTGCTAG-3’(SEQ ID NO.3)从大豆基因组中PCR扩增获得长度为3752bp的GmLHY启动子，经测序验证，GmLHY启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。为方便后续与载体连接，PCR产物两端分别带有BamH I和Kpn I的酶切位点及保护碱基。

上述PCR扩增体系(总体积为20μl)为：

PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃3min，共28个循环；72℃10min。

实施例2利用大豆GmLHY启动子驱动LUC基因的表达

将实施例1中PCR克隆得到GmLHY启动子的切胶回收产物用BamH I和Kpn I双酶切。将载体pENTR-1A-LUC⁺(Xie Q,et al.(2014)LNK1 and LNK2 are transcriptionalcoactivators in the Arabidopsis circadian oscillator.Plant Cell 26(7):2843-2857.)用BamH I和Kpn I双酶切，回收后与GmLHY启动子的回收片段用T4 DNA连接酶(Thermo公司，货号EL0014)连接。获得中间载体pENTR-GmLHY:LUC，再利用LR反应试剂盒(Thermo公司，货号11791019)将其重组至植物表达载体pH2GW7Δ(Xie Q,et al.(2014)LNK1 and LNK2 are transcriptional coactivators in the Arabidopsis circadianoscillator.Plant Cell 26(7):2843-2857.)，并转化至大肠杆菌DH5α中扩繁，获得重组植物表达载体pH2GW7Δ-GmLHY:LUC。

大肠杆菌感受态细胞的转化和载体鉴定的具体操作如下：

(1)配置含抗生素的LB固体培养基；

(2)将超低温冰箱中保存的感受态细胞在冰浴中融化，加入5μl连接产物或LR反应产物，轻轻混匀，冰浴中静置25分钟；

(3)42℃水浴锅中热激90秒，然后立即在冰浴中静置5分钟；

(4)加入500μl LB液体培养基，37℃摇床振荡培养1小时(转速为150rpm)；

(5)取100μl细菌恢复培养液均匀涂于筛选培养基上，37℃倒置培养约15小时，挑取3个单菌落摇培；

(6)提取质粒后酶切鉴定并测序。

将鉴定正确的重组植物表达载体pH2GW7Δ-GmLHY:LUC转化发根农杆菌K599，得到阳性转化发根农杆菌K599。

利用发根农杆菌介导的转化方法，将pH2GW7Δ-GmLHY:LUC转入大豆WS82，通过生物发光信号筛选获得转化pH2GW7Δ-GmLHY:LUC的发状根(图1)。

发根农杆菌介导大豆转化的具体方法如下：

(1)取出氯气熏蒸法灭菌12个小时的大豆种子，置于超净工作台吹净剩余氯气后，用无菌的超纯水浸泡约16小时，备用；

(2)挑取带有pH2GW7Δ-GmLHY:LUC的发根农杆菌K599单克隆在试管中用液体YEP培养基小摇，再转至锥形瓶中摇培至菌液OD₆₀₀约为1.0。4000rpm离心10分钟收集菌体，重悬于转化介质(1/10X Gamborg B₅盐，30g/L蔗糖，3.9g/L MES，pH 5.4，灭菌后加入40mg/L乙酰丁香酮)中；

(3)切下吸涨后大豆的胚根，以下胚轴为外植体，将外植体在重悬菌液中浸入30分钟，完成侵染后在滤纸上吸干浸染液，将侵染后的大豆外植体置于共培养培养基(1/10XGamborg B₅盐，30g/L蔗糖，3.9g/L MES，4.25g/L琼脂，pH 5.4，灭菌后加入Cysteine400mg/L，40mg/L乙酰丁香酮)上避光培养3天；

(4)将共培养后的大豆外植体的下胚轴插入发根诱导培养基(1X Gamborg B₅盐，30g/L蔗糖，0.59g/L MES，7g/L琼脂，pH 5.7，灭菌后加入Cefotaxime 100mg/L)中，在25℃、12L/12D条件培养14天诱导发根。

将筛选得到的转化pH2GW7Δ-GmLHY:LUC的发状根切成约1cm小段，放入有固体培养基的96孔板中，每孔加入40μl萤火虫荧光素酶底物(1.25mM)。转移至25℃、持续黑暗条件，每隔3小时使用生物发光检测仪检测生物发光信号。

生物发光检测结果如图2所示，分别在清晨(ZT24)、下午(ZT33)和夜间(ZT42)进行3小时光照处理(荧光灯管，光强约100μmol/m²/s)，每个时间点处理材料数量为24个。结果显示，在清晨进行3小时的光照处理，大豆GmLHY启动子节律性表达的相位前移，在下午进行3小时的光照处理，GmLHY:LUC表达相位无明显变化；在夜间进行3小时的光照处理，GmLHY:LUC表达相位后置。结果表明，GmLHY启动子可驱动目标基因时间特异性响应光信号处理改变节律性表达的相位。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 河南大学

<120> 启动子GmLHY在调控基因时间特异性响应光信号中的应用

<130> KHP201118726.8

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3752

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagacgtgaa acctcatatt agttccattc ttggcaatga ccgtccaata atattaaaaa 60

ttatatttat taaatgtaat agatagtaaa attattaaga ataaaaatta aaaaataaac 120

tattattaat atatatttct attttatttt ttaaaatata ttttttaatt cattaattaa 180

actattatta ataaaaatat atatttctat ttctatttta agatattgta atcaataaaa 240

aaaattatcc ctaaatgatg ggtgttgggt ggcgtacaga cagggattca atgatttttc 300

ctacttttct ttttcttttt cagttattga actaccatgg atctaatctt atgtgttgca 360

aaacagagaa attctatttc atattctgaa ttttaatttg tttaacggcg agagcatttt 420

atgatctgga ttgagaaaat gaatctgatt actcaagaat gatttaatgg atcaaacttg 480

tatttgaaaa ggaagaactt gtggtgttaa aacataaaga agattgaact tgcatagaag 540

gtgactgaaa attttgtgca gaagtagtga gaatgacgta aaaaggtaaa aaaccaaagg 600

ggagagagga gaaagaatta atgggagaaa taaatgacag aatagagaaa aatgagtttt 660

catttttttt tttaaaactt aaatgataaa ttactattct atccttaaaa tgaattcagc 720

aaaacaatat aagtaattag tttttttttt ccaaatattt ttgtatcgaa ataattgaaa 780

ctgccccatc taagcagaac cttgggcccg accgtttcat tcatttgctg gcaatcccac 840

gacggaaatt tcaccacaat atacgcttac catttgtatt gataaatgat aaaagcagat 900

tctacccaag cacaaacaat taacagttag aaagtaaggg aaagagggtg taaaagtgaa 960

aagtgaagtg tgtttaggag aagcctattc tgtggcactt tctcttctct tctgcttatt 1020

cttcttaatg tttgtttgtt tgggcctcag gccctccttc taacaaaaaa taaaagaaat 1080

caacataatg ccattctcct aaccaaaaca tttactcaca gtaatttata tgtatatata 1140

tttttaaata aattttaata ataattttat ggatattaat taaataatta ttaaaaatta 1200

atatattatc aaaaatataa aattattcaa tattattttt ataacaaaaa acatattaaa 1260

taaaatgtat ctcgctacca aaaaaagatg tatctaaata atttttttat caatatcttt 1320

aaaatccatg taaatatttt attattattt aagtttaatt tttcccatct tattattatt 1380

attattataa gataatattg caataaatac gagtttgatc tggattaggt taaaaaattg 1440

aaaattagat gagtttggat cggttcttgg attttatttt tgaaaatcca atcaaatttg 1500

atccacccga ttatttatta ttttttttat atttattcta acctttagag tttaggcttt 1560

ttagcccaat ccaatttaat tatattattt tattccaagg atattgatta attattacta 1620

tagttataat ataaaatata gtttaatttt taacttgaaa tataacatgt tttgtattgg 1680

actagctagt agttaaaaaa tagtttttaa gttaaatgta tttaattgca taatattaaa 1740

atcacttttc taattatttt taaaaaaatt actttaaaga aaaatcattt tttattttta 1800

ttttaaatcc aattcaagcc gcttataatg gagttagtta aaatcatatt agagacttaa 1860

attaggaaaa ttttcattaa tccaaatcaa ttaaaattaa tcaaaattac ttttgaccac 1920

aaattcgatc caaaatgacc catgcccacc cctaaattgc ttagattatt atcatccaga 1980

aatgggcaac aggacaagac ctaacacact ctgctcacct ccttccttta gatgccacat 2040

ggcaactcct gtaccacaaa aatacaaaac cagttttgtt ccagaaagaa aatattaaaa 2100

acaaattatt acatccacta tgttcatttc ttgcaaaaag gtttccatat ttgtgcttta 2160

agccttaaag ttgtggccaa ctaaaatagc aatatacttg tcaacccaga aacaataaaa 2220

tatactatta ggaagtgtag ttatcacgtg taacttaatt attataattt aacttcatta 2280

aaatactttt atttaataaa aaagtgtgat attattaaaa atacttattt tttaataatc 2340

acttaaaaac tatatattta atttttagta gagaataccc ttggttttta taagcgttca 2400

atgaaaacct tgtatattaa tcaattaaca tgcttcatga taccgtaaag gtatagtatc 2460

taaaaaaaag tacttgtatc ttgataatat aaaattctga agagaaaaaa accaccagga 2520

agaatcgaag ggatgtcaca gggagtcatg gaacgcacaa caagtaacga accataaaga 2580

gagcgccacg tagcagtctc tgaaaagcga ggtgccacgt tggcgaggca acttgagggg 2640

cccacatgtg acagctggcg ttggagtttg tggatgagat ttcactttaa gggggaaaag 2700

gccacaaaaa acaatattaa agagtgcaag gatttgcttg cgttagctcc accagccact 2760

gaattgatgc cacttgtccc aatcccttgc agttttacac ttccacactt agcagcctca 2820

aattaaaacg tcgccttcct tttcaccaaa ataaataaat aaaaatgcca gcaaattcta 2880

gtggctgata ttgcttctgc ttcctttgtt gtagttgaag tcgctcccct cattcttctt 2940

tcgttgctac ttctactgtt tcttcctccg atccctcatt gccgcaaatg actcctcctg 3000

ctagtgttag gtgaattccc tcgcttcaca tgcatgatcg caccttcaac tctcttcttc 3060

ttcttcttct ccatggcttt ttttcaaggt acttttctct tcctttttca aaattattca 3120

gtttcccctc tttttggtta ccgagaaaat ttaatcgccg gaaactgcca aacgactgaa 3180

taactttccg gatttgtata tatcaggtac gttgagttaa cctctgcttg ctctgtgtga 3240

ttaagtattc tcggcaaccc attaggagaa cggaaattgg agtatagtgg cagagatagt 3300

aattttgaag tgttgttgtg atatatacac taattgtagt tctttccgcg tttgaaaggt 3360

tttggcgccg tggagttcgt tttggtgagg attctgatta aagagttttc ttttattctt 3420

tcggagaagc gtctctgtct ctctgttgcg gtggattctt aaaatttgct aaatcttttt 3480

ttttcttttt ctaatctcta ttagtatcat cctgcgtgtg gcttgtgatt ggaatgctta 3540

gatttatatt ttttgttacc aaacagagac ggatctctac ctttctattt cttttgcagt 3600

agcatcaccg tatcatcagc ttcagcttgc tttcaccaaa acggctttac tatttggtgt 3660

gttccatgtc acaaaaaacg aaaggagata ttccttttac ccactcctcg tcagggaaga 3720

tctgaagcag cgctagcagc acacgtcctc ta 3752

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgggatccag acgtgaaacc tcatattagt tcc 33

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggggtaccta gaggacgtgt gctgctag 28

Claims (10)

1.启动子GmLHY或含有所述启动子GmLHY的表达盒、载体或微生物在调控基因在植物中近日节律性表达中的应用。

2.启动子GmLHY或含有所述启动子GmLHY的表达盒、载体或微生物在驱动目标基因在环境温度恒定、持续黑暗条件下近日节律性表达中的应用。

3.启动子GmLHY或含有所述启动子GmLHY的表达盒、载体或微生物在检测植物在环境温度恒定、持续黑暗条件下的近日节律表型中的应用。

4.启动子GmLHY或含有所述启动子GmLHY的表达盒、载体或微生物在通过环境光信号处理，时间特异性调控目标基因在植物中节律性表达相位中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述调控近日节律性表达的相位为近日节律性表达的相位的前移或后置；

优选地，在“清晨”进行光信号处理，近日节律性表达相位前移，在“下午”进行光信号处理，近日节律性表达相位不变，在“夜间”进行光信号处理，近日节律性表达相位后置。

6.启动子GmLHY或含有所述启动子GmLHY的表达盒、载体或微生物在植物时间特异性响应光信号的近日节律性调控中的应用。

7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物；优选为豆科植物，更优选为大豆。

8.根据权利要求1～7任一项所述的应用，其特征在于，所述启动子GmLHY的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

9.一种调控基因在植物中时间特异性响应光信号调控近日节律性表达的方法，其特征在于，将所述基因可操作性地连接于启动子GmLHY的下游，以启动子GmLHY驱动所述基因在植物中时间特异性响应光信号改变近日节律性表达的相位。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物为双子叶植物，优选为豆科植物，更优选为大豆；

所述启动子GmLHY的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

Images