CN102864145A - 一种高效诱导表达型启动子及应用 - Google Patents
一种高效诱导表达型启动子及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高效诱导表达型启动子及应用。本发明提供DNA片段(GBP1)，来源于大豆(Glycine max(L.)Merrill.)，为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)序列表的序列1自5’末端第8-1501位核苷酸；3)序列表的序列1中任意一段包含序列1中自5′末端第1305-1501位核苷酸的DNA分子；4)在严格条件下与1)、2)或3)所述DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；5)与1)、2)或3)中所述DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。本发明的启动子在农业生产中将会有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高效诱导表达型启动子及应用。
背景技术
植物启动子是一段能与RNA聚合酶及其转录因子特异结合、决定基因转录起始的DNA序列。启动子作为一种基因表达的重要顺式作用元件，从1983年第一株转基因植物问世以来，一直是基因工程中的研究热点，在基因表达调控中起着关键作用，很大程度上决定目的基因的时空表达特性。目前植物基因工程中广泛应用的是组成型启动子，驱动目的基因在植物生长发育时期的各个组织均有表达，造成物质和能量的浪费，增加植物代谢负担，一定程度上影响植物的发育，甚至引起植物形态的改变。
因此采用特异性启动子取代组成型启动子，实现对基因表达的预想调控，从而实现基因的组织器官特异性、发育阶段特异性、外部环境内部激素诱导特异性的准确调控表达，并尝试依此作为研究顺式作用元件和反式作用因子相互作用的方法。
大豆是植物发育生物学和分子生物学研究的模式植物，大豆基因组测序工作的完成，为大豆基因功能的研究提供了便利条件，但目前关于大豆高效诱导表达启动子分离的工作研究甚少。因此，利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因在改良作物的抗性中成为目前研究的热点。然而，目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此，对于新的抗逆相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是启动子研究的重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效诱导表达型启动子及应用。
本发明提供的DNA片段，来源于大豆(Glycine max(L.)Merrill.)，为如下1)-8)中任一所述的DNA片段：
1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)序列表的序列1自5’末端第8-1501位核苷酸；3)序列表中序列1自5′末端起第457-1501位核苷酸；4)序列表中序列1自5′末端起第655-1489位核苷酸；5)序列表中序列1自5′末端起第768-1487位核苷酸；6)序列表中序列1自5′末端起第1305-1501位核苷酸；7)在严格条件下与1)-6)中任一所述DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA片段；8)与1)-7)中任一所述DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段。
上述序列1由1512个核苷酸组成。上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有以上任一所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组载体为将上述编码基因插入pBI 121的HindIII和Bam HI识别位点间获得的重组载体。
扩增以上任一所述DNA片段的引物对也属于本发明的保护范围。
所述引物对为如下任一1)-5)所示的引物对：1)、所述引物对中的一条引物为序列2所示的核苷酸，另一条引物为序列3所示的核苷酸；2)：所述引物对中的一条引物为序列4所示的核苷酸，另一条引物为序列5所示的核苷酸；3)：所述引物对中的一条引物为序列6所示的核苷酸，另一条引物的序列为序列7所示的核苷酸；4)：所述引物对中的一条引物为序列8所示的核苷酸，另一条引物为序列9所示的核苷酸；5)：所述引物对中的一条引物为序列10所示的核苷酸，另一条引物为序列11所示的核苷酸。
上述DNA片段使目的基因在植物组织中表达的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，所述植物组织为根、茎、叶、花或种子。上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。上述应用中，所述单子叶植物为烟草，所述双子叶植物为拟南芥。
所述表达是通过光照调节、激素胁迫或高温胁迫实现的；所述激素优选为细胞分裂素、赤霉素、水杨酸或脱落酸；所述高温为37℃和/或42℃。
所述光照调节的方式为如下1)-4)中任一一种：1)在16h光/8h暗条件下培养48小时后，连续48小时光照处理；2)在16h光/8h暗条件下培养48小时后，连续48小时暗处理；3)在8h光/16h暗条件下培养48小时后，连续48小时光照处理；4)在8h光/16h暗条件下培养48小时后，连续48小时暗处理。
本发明的实验证明，将本发明中启动子GBP1与GUS基因一起导入烟草或拟南芥中后，赤霉素、水杨酸、细胞分裂素处理以及一定范围内高温能促进启动子调控GUS基因的表达：受水杨酸诱导表达，表明该启动子在植物胁迫抗性中起作用；受细胞分裂素诱导表达，表明该启动子在细胞分裂增殖中起作用；受赤霉素诱导表达，表明该启动子在植物赤霉素诱导开花途径中起作用；受高温诱导表达，表明该启动子可能参与抗旱耐热反应。
将本发明的启动子与GUS基因一起导入拟南芥后，转基因幼苗植株分别置于长日照(16h光/8h暗)、短日照(8h光/16h暗)下培养，发现该启动子受短日照诱导表达，GUS表达平均水平约为长日照下2倍。研究还发现连续光或连续暗处理均打破了该启动子原有的昼夜节律性。
将本研究中热激相关的GBP1启动子导入到植物中，培育抵御恶劣环境的植株，在更广泛的环境和条件下(如高温炎热性地域)种植，提高农作物产量，也可以在沙漠、荒山等地增加绿化，保护环境。此外，利用其对外源激素的应答效应，改良作物品种，进而大幅提高作物产量性状，创造更高的经济价值。由于该启动子同时受光周期调控，短日照诱导，长日照抑制，在植物的引种、育种工作中可将光周期诱导性启动子，与不同的光周期效应因子融合导入植物体内，通过控制日长驱动目的基因，调节植株的光周期敏感性，调节植物的开花时间，改变植物不同纬度的种植范围，具有极为重要的意义。由于该启动子受日长调控，因此还可以和其他的目的基因融合，仅需要改变日长的长短控制目的基因的表达量，简单、方便易行。
因此，在转基因育种工作中将本发明的启动子取代组成型启动子，可实现对目的基因表达的准确调控，进而提高其对环境的适应性，在农业生产中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为GBP1基因启动子GBP1
图2为GBP1基因启动子顺式作用元件分析
图3为GBP1基因启动子GBP1及该启动子5′端缺失片段pBI121质粒载体构建示意图
图4为GBP1基因启动子GBP1及该启动子5′端缺失片段转化农杆菌后的PCR扩增示意图
图5为GBP1基因启动子GBP1 T1代转基因烟草叶片的GUS基因表达示意图
图6为水杨酸(SA)、赤霉素(GA3)、细胞分裂素(6-BA)，脱落酸(ABA)喷施T1代转基因烟草植株后根中GUS组织化学染色示意图
图7为水杨酸(SA)、赤霉素(GA3)、细胞分裂素(6-BA)，脱落酸(ABA)喷施T1代转基因烟草植株后茎中GUS组织化学染色示意图
图8为水杨酸(SA)、赤霉素(GA3)、细胞分裂素(6-BA)，脱落酸(ABA)喷施T1代转基因烟草植株后叶中GUS组织化学染色示意图
图9为为水杨酸(SA)、赤霉素(GA3)、细胞分裂素(6-BA)，脱落酸(ABA)喷施T1代转烟草植株后GUS活性示意图
图10为热激处理后T1代转基因烟草叶片中的GUS组织化学染色示意图
图11为热激处理后T1代转基因烟草叶片中的GUS活性示意图
图12为GBP1基因启动子GBP1 T1代转基因拟南芥发育不同时期的GUS组织化学染色示意图
图13为GBP1基因启动子GBP1及5′端缺失片段转基因拟南芥生长6天、15天后的GUS组织化学染色示意图
图14为水杨酸(SA)喷施转GBP1启动子(A)及5′端缺失片段拟南芥T1代植株后GUS活性示意图(B)
图15为为赤霉素(GA3)喷施转GBP1启动子(A)及5′端缺失片段拟南芥T1代植株后GUS活性示意图(B)
图16为细胞分裂素(6-BA)喷施转GBP1启动子(A)及5′端缺失片段拟南芥T1代植株后GUS活性示意图(B)
图17为热激处理转GBP1启动子(A)及5′端缺失片段拟南芥T1代植株GUS活性示意图(B)
图18转GBP1启动子拟南芥T1代植株96h光周期(长日照48h后连续48h光照)下GUS基因表达示意图(黑色虚框代表光期，黑色实框代表暗期，浅色条纹代表原有暗期被光替代)。
图19转GBP1启动子拟南芥T1代植株96h光周期(长日照48h后连续48h黑暗)下GUS基因表达示意图(黑色虚框代表光期，黑色实框代表暗期，深色条纹代表原有光期被暗替代)
图20转GBP1启动子拟南芥T1代植株96h光周期(短日照48h后连续48h光照)下GUS基因表达示意图(黑色虚框代表光期，黑色实框代表暗期，浅色条纹代表原有暗期被光替代)
图21转GBP1启动子拟南芥T1代植株96h光周期(短日照48h后连续48h黑暗)下GUS基因表达示意图(黑色虚框代表光期，黑色实框代表暗期，深色条纹代表原有光期被暗替代)
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
DNA片段回收采用博大泰克公司回收试剂盒，并按其说明书进行操作。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂，试剂均为国产分析纯，引物由上海生工公司合成，Ependorf梯度式PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司。
植物材料：大豆(Glycine max(L.)Merrill.)光敏感品种东农42记载在陈丽君，不同播期对大豆东农42产质量性状动态变化规律研究，[J].大豆科学，2008，(03).中，公众可从东北农业大学获得。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia野生型(Col-0，以下简称野生型拟南芥)记载在孙枫，刘裴清，董汉松.昼夜节律调控拟南芥核黄素信号传导[J].江苏农业科学，2010(2)：17-20.公众可从东北农业大学获得。
烟草(Nicotiana tabacum)记载在Legg，P.D.，Collins，G.B.，Litton，C.C.，1970.Registration of LA Burley 21 tobacco germplasm.Crop Sci.10，212.中，公众可从东北农业大学获得。
农杆菌LBA4404菌株记载在根癌农杆菌介导B.t.基因和CpTI基因对花椰菜的转化.植物生理与分子生物学学报.2002，28(3)：193-199中，公众可从东北农业大学获得。
pMD-18T vector购自TAKARA公司。
载体pBI 121记载在Chen P，Wang C，Soong S，To K.Complete sequence of the binaryvector pBI 121 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants.Molecular Breeding.2003，11(4)：287-293.中，公众可从东北农业大学获得。
限制性内切酶和T4DNA连接酶等均购自TAKARA公司。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、启动子的克隆及载体构建
1、植物总DNA的提取：
大豆(G1ycine max(L.)Merrill.)光敏感品种东农42，培养于25℃光照培养箱，250μmolm-2sec-1白光，长日照(LD)(16h光/8h暗)条件下生长，剪取第三个三出复叶，按照CTAB法提取大豆总DNA。
2、引物设计：
根据Phytozome大豆基因组文库(www.phytozome.net)报道的序列，Blast比对分析后定位GBP1基因起始密码子上游序列，应用Primer Premier 5.0设计5′侧翼序列下游引物，具体引物序列如表1所示：
表1引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5′→3′) |
| pGBP1-F | GCAAGCTT GAAAGCACATGGCATTATTAGAGG(序列2) |
| pGBP1-1F | GCAAGCTT TTGCTGTGGTGTTAATTTTCTTTT (序列4) |
| pGBP1-2F | GCAAGCTT GATATTGTAAGAAAGGGAGTTCATT(序列6) |
| pGBP1-3F | GCAAGCTT CTTCTCATCAGATGGACATTTTAC(序列8) |
| pGBP1-4F | GCAAGCTT CACTTATAAAAGGGCCAACACTACC(序列10) |
| pGBP1-1R | GC GGA TCC GATTTTGCAGGAGGAAGAAGCT(序列5) |
| pGBP1-2R | GC GGA TCC GGAAGAAGCTCTTTCAGAGTGG(序列7) |
| pGBP1-3R | GC GGA TCC AAGAAGCTCTTTCAGAGTGGC(序列9) |
| pGBP1-4R | GC GGA TCC GATTTTGCAGGAGGAAGAAGCT(序列11) |
| pGBP1-R | GC GGA TCC GATTTTGCAGGAGGAAGAAGCT(序列3) |
2、PCR扩增
以大豆总DNA为模板，以引物pGBP1-F和pGBP1-R进行PCR扩增，得到1512bp PCR产物；
以大豆总DNA为模板，以引物pGBP1-1F和pGBP1-1R进行PCR扩增，得到1063bp PCR产物；
以大豆总DNA为模板，以引物pGBP1-2F和pGBP1-2R进行PCR扩增，得到851bp PCR产物；
以大豆总DNA为模板，以引物pGBP1-3F和pGBP1-3R进行PCR扩增，得到735bp PCR产物；
以大豆总DNA为模板，以引物pGBP1-4F和pGBP1-4R进行PCR扩增，得到215bp PCR产物；
以上PCR条件均为94℃5min，94℃30s，58℃1min30s，72℃10min，35个循环，1512bpPCR产物结果如图1所示。将上述PCR产物均测序，结果如下：1512bp PCR产物具有序列表中序列1的自5’末端第8-1501位核苷酸；该PCR产物的DNA片段命名为GBP1；1063bp PCR产物具有序列表中序列1自5′末端起第457-1501位核苷酸；该PCR产物的DNA片段命名为GBP1-1；851bpPCR产物具有序列表中序列1自5′末端起第655-1489位核苷酸；该PCR产物的DNA片段命名为GBP1-2；735bp PCR产物具有序列表中序列1自5′末端起第768-1487位核苷酸；该PCR产物的DNA片段命名为GBP1-3；215bp PCR产物具有序列表中序列1自5′末端起第1305-1501位核苷酸；该PCR产物的DNA片段命名为GBP1-4。
5、GBP1启动子序列的分析：
应用TSSP软件分析确定GBP1转录起始位点(http://linux1.softberry.com)为腺嘌呤(A)，位于基因的起始密码子ATG上游126bp碱基处，本研究中将转录起始位点处碱基定位+1位，进而确定了启动子区域为转录起始位点上游-1bp～-1336bp。采用启动子预测软件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对GBP1序列进行功能预测与分析。发现GBP1启动子除了含有必须的起始转录位点、TATA-BOX、CAAT增强子外还包含多个调控元件：1)光应答元件：如BOX-4，(5′ATTAAT 3′)，6个拷贝；G-BOX，(5′CACATGG3′)，单拷贝；2)赤霉素应答元件：P-BOX(5′GCCTTTTG3′)，单拷贝；3)水杨酸应答元件TCA(5′GAGAAGAATA3′)单拷贝；4)热激元件：HSE(5′AAATTTC 3′)3个拷贝，以及节律钟Circadian(5′CAANNATC3′)等(见图2)。将该启动子序列分解成4个不同的功能区段，即序列表中序列1自5′末端起第457-1501位核苷酸(GBP1-1)，序列表中序列1自5′末端起第655-1489位核苷酸(GBP1-2)，序列表中序列1自5′末端起第768-1487位核苷酸(GBP1-3)，序列表中序列1自5′末端起第1305-1501位核苷酸(GBP1-4)。
6、启动子表达载体构建：
将上述1512bp PCR产物连接到pMD-18T vector中，得到中间载体pMD-18T-GBP1，再将中间载体pMD-18T-GBP1经HindIII和Bam HI酶切，得到的小片段与经过同样酶切的pBI121载体大片段(切取35S启动子)连接，得到连接产物。将该连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行卡那霉素抗性筛选，将得到的转化子在摇床37℃培养过夜，提取质粒，测序验证，该质粒为将序列表中序列1的自5’末端第8-1501位核苷酸插入到pBI121的HindIII和Bam HI酶切位点间得到的质粒，该质粒命名pGBP1::GUS-nos(构建流程见图3所示)，含有该质粒的重组菌命名为PBI121/pGBP1::GUS-nos。
采用同样的方法，将1063bp PCR产物连接到pBI121载体上，得到重组载体，经过测序，该重组载体为将序列表中序列1自5′末端起第457-1501位核苷酸插入pBI121载体的HindIII和Bam HI的识别位点间得到的载体，命名为pGBP1-1::GUS-nos；含有该质粒的重组菌命名为pBI121/pGBP1-1::GUS-nos。
采用同样的方法，将851bp PCR产物连接到pBI 121载体上，得到重组载体，经过测序，该重组载体为将序列表中序列1自5′末端起第655-1489位核苷酸插入pBI121载体的HindIII和Bam HI的识别位点间得到的载体，命名为pGBP1-2::GUS-nos；含有该质粒的重组菌命名为pBI121/pGBP1-2::GUS-nos。
采用同样的方法，将735bp PCR产物连接到pBI 121载体上，得到重组载体，经过测序，该重组载体为将序列表中序列1自5′末端起第768-1487位核苷酸插入pBI121载体的HindIII和Bam HI的识别位点间得到的载体，命名为pGBP1-3::GUS-nos；含有该质粒的重组菌命名为pBI121/pGBP1-3::GUS-nos。
采用同样的方法，将215bp PCR产物连接到pBI 121载体上，得到重组载体，经过测序，该重组载体为将序列表中序列1自5′末端起第1305-1501位核苷酸插入pBI121载体的HindIII和Bam HI的识别位点间得到的载体，命名为pGBP1-4::GUS-nos；含有该质粒的重组菌命名为pBI121/pGBP1-4::GUS-nos。
7、重组农杆菌的制备与鉴定
三亲杂交方法转化根癌农杆菌，方法如下：
1)将农杆菌LBA4404放入含相应抗生素(链霉素，所述抗生素在培养基中的终浓度为50mg/L，利福平，所述抗生素在培养基中的终浓度为25mg/L)的YEP液体培养基里28℃培养1-2天。将pRK2013(Use of the plasmid pRK 2013 as a vehicle for transposition in Azotobactervinelandii S.H.PHADNIS and H.K.DAS，J.Biosci.，1987，12(2)：131-135，公众可从东北农业大学获得。)放入含有卡那霉素(所述抗生素在培养基中的终浓度为50mg/L)的LB液体培养基里37℃过夜培养。将pBI121/pGBP1::GUS-nos放入含卡那霉素抗生素(所述抗生素在培养基中的终浓度为50mg/L)的LB液体培养基里37℃过夜培养。2)当三种菌液达到0D值为0.6时，分别将其从摇床中取出。各取1000μL加入到离心管中，12000rpm离心5min，弃上清液。分别加入1000μL相应的不含抗生素的YEP液体培养基重悬，12000rpm再离心5min，弃上清液。然后再加入1000μL相应的不含抗生素的液体培养基重悬。3)分别取三种菌液100μL混合于一个EP管中。梯度体积(10ul、20ul、30ul)将混合液滴于不含抗生素的LB固体培养基上，28℃过夜培养。4)用接菌环在LB固体培养基上沾取少量的菌落，用划线的方式接种于含相应抗生素(链霉素，所述抗生素在培养基中的终浓度为50mg/L，利福平，所述抗生素在培养基中的终浓度为25mg/L，卡那霉素，所述抗生素在培养基中的终浓度为50mg/L)的LB固体培养基上，28℃培养1-2天。5)挑取白色单菌落在含有适当抗生素的YEP液体培养基(链霉素，所述抗生素在培养基中的终浓度为50mg/L，利福平，所述抗生素在培养基中的终浓度为25mg/L，卡那霉素，所述抗生素在培养基中的终浓度为50mg/L)中28℃培养，PCR鉴定阳性克隆。引物为pGBP1-F和pGBP1-R，结果得到1512bp的目的片段(图4A)，该菌为阳性菌株，将该菌株提取质粒，送去测序，结果为该质粒为pGBP1::GUS-nos，进一步证明该菌株为阳性，命名为LBA4404/pGBP 1::GUS-no s。
采用上述方法分别将pGBP1-1::GUS-nos、pGBP1-2::GUS-nos、pGBP1-3::GUS-nos和pGBP1-4::GUS-nos均转到农杆菌中，分别得到克隆1、克隆2、克隆3、克隆4；
采用下述方法鉴定，结果如图4B-4E所示，B为克隆1鉴定，C为克隆2鉴定，D为克隆3鉴定，E为克隆4鉴定，结果如下：克隆1的PCR鉴定的引物为pGBP1-1F和pGBP1-1R，结果得到1063bp的目的片段，该菌为阳性菌株，将该菌株提取质粒，送去测序，结果为该质粒为pGBP1-1::GUS-nos，进一步证明该菌株为阳性，命名为LBA4404/pGBP1-1::GUS-nos；克隆2的PCR鉴定的引物为pGBP1-2F和pGBP1-2R，结果得到851bp的目的片段，该菌为阳性菌株，将该菌株提取质粒，送去测序，结果为该质粒为pGBP1-2::GUS-nos，进一步证明该菌株为阳性，命名为LBA4404/pGBP1-2::GUS-nos；克隆3的PCR鉴定的引物为pGBP1-3F和pGBP1-3R，结果得到735bp的目的片段，该菌为阳性菌株，将该菌株提取质粒，送去测序，结果为该质粒为pGBP1-3::GUS-nos，进一步证明该菌株为阳性，命名为LBA4404/pGBP1-3::GUS-nos；克隆4的PCR鉴定的引物为pGBP1-4F和pGBP1-4R，结果得到215bp的目的片段，该菌为阳性菌株，将该菌株提取质粒，送去测序，结果为该质粒为pGBP1-4::GUS-nos，进一步证明该菌株为阳性，命名为LBA4404/pGBP1-4::GUS-nos。
实施例2、转GBP1烟草的获得及GBP1的功能鉴定
一、转GBP1烟草的获得
1、转GBP1烟草的获得
1)、取幼嫩健康的烟草(Nicotiana tabacum，以下简称野生型烟草。)叶片，用蒸馏水冲洗一遍，70％乙醇清洗45秒，体积分数10％次氯酸钠水溶液消毒6-8分钟，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分。
2)、将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm的小块，叶片近轴面向下，接种在愈伤组织诱导培养基(培养基为MS中加入萘乙酸NAA，6-苄基嘌呤6-BA和琼脂糖，所述NAA在培养基中的浓度为0.2mg/L，6-BA在培养基中的浓度为3.0mg/L，琼脂糖在培养基中体积分数为0.8％。)上，预培养2-3天，得到叶盘，作为外植体。
3)、挑取LBA4404/pGBP1::GUS-nos单菌落，接种到20ml加有相应抗生素(卡那霉素，所述抗生素在培养基中的终浓度为50mg/L，链霉素，所述抗生素在培养基中的终浓度为50mg/L，利福平，所述抗生素在培养基中的终浓度为25mg/L。)的YEP液体培养基中，在27℃恒温摇床上培养到OD值为0.6-0.8。取上述培养物按1％-2％的比例，转入新鲜的无抗菌素的YEP液体培养基中，继续培养6小时，当OD值为0.2-0.5时即可用于转化。
4)、在超净工作台上，将菌液倒入无菌的50ml离心管中，4000rpm 10min，去上清，MS1液体培养基重悬菌液，倒入无菌小培养皿中，将预培养的外植体，放入菌液中浸泡8-10分钟。取出外植体在无菌滤纸上吸去附着的菌液，将吸干后的叶盘背面向上平放在铺有一层滤纸的MS1共培养培养基上，28℃暗培养3天。
5)、将经过共培养的外植体依次用无菌水洗15分钟，含抑菌剂头孢霉素(所述抗生素在培养基中的终浓度为500mg/L)的无菌水洗15分钟，MS2冲洗培养基洗20分钟，洗掉叶盘表面的农杆菌，其间不时摇动，使叶盘中充分接触溶液。
6)用药勺捞出叶盘，放于吸水纸上，吸干多余水分。
7)将叶盘背面向下，放在MS3芽诱导固体培养基上，使其生长和诱导分化，叶盘边缘轻压入培养基中，25℃(16h光/8h暗)培养。
8)侵染叶盘不断膨大，大约10天后长出绿色愈伤组织，约两周后切下带芽的叶缘，插入到MS3芽诱导培养基中，继续培养，2周继代一次，继代两次后诱导出不定芽。
9)将叶缘长出的幼芽从基部与叶盘切开，淘汰白化苗及畸形苗，选出形态正常生长旺盛的抗性苗，待不定芽长到2-3cm长时，解剖刀切下，插入到MS4生根培养基中诱导生根。
10)两周左右长出不定根，驯化后即移入土中与温室培养，得到30株T0代转GBP1烟草。
上述所用培养基组成：MS0为MS基本培养基；MS1为细菌重悬及共培养培养基：培养基为MS中加入萘乙酸NAA，6-苄基嘌呤6-BA，抑菌剂头孢霉素，乙酰丁香酮和琼脂糖，NAA在培养基中的浓度为0.2mg/L，6-BA在培养基中的浓度为3.0mg/L，抑菌剂头孢霉素在培养基中的浓度为500mg/L，乙酰丁香酮在培养基中的浓度为100uM，琼脂糖在培养基中的体积分数为0.8％。)。MS2为冲洗培养基：培养基为MS1中加入抑菌剂头孢霉素，抑菌剂头孢霉素在培养基中的浓度为500mg/L。MS3为分化及筛选培养基：培养基为MS0中加萘乙酸NAA，6-苄基嘌呤6-BA，抗性筛选剂卡那霉素kan，抑菌剂头孢霉素cef和琼脂糖，NAA在培养基中的浓度为0.2mg/L，6-BA在培养基中的浓度为1.0mg/L，kan在培养基中的浓度为100mg/L，cef在培养基中的浓度为500mg/L，琼脂糖在培养基中的体积分数为0.8％。MS4为生根培养基：培养基为1/2MS中加入抗性筛选剂卡那霉素和抑菌剂头孢霉素。卡那霉素在培养基中的浓度为80mg/L，抑菌剂头孢霉素在培养基中的浓度为400mg/L。
从上述获得的T0代转GBP1烟草收获种子，播种后得到25株T1代转GBP1烟草。
将上述得到的20株阳性T1代转GBP1烟草提取基因组DNA，以pGBP1-F和pGBP1-R为引物，得到约1512bp(测序为含有序列1自5’末端第8-1501位核苷酸)的即为阳性T1代转GBP1烟草，共得到20株阳性T1代转GBP1烟草。
二、启动子GBP1的功能验证
分别将25株T1代转GBP1烟草叶片放入盛有X-gluc反应液(1M pH 7.0磷酸钠缓冲液500ul、0.033g/ml铁氰化钾100ul、0.042g/ml亚铁氰化钾100ul、0.5M PH 8.0乙二胺四乙酸20ul、Triton X-10010ul和2.5mg X-gluc，水溶至10ml得到GUS组织化学染色反应液)的离心管中，抽真空，37℃染色16h，然后将组织用70％乙醇脱色，观察拍照。以野生型烟草为对照。
结果如图5所示，GUS组织化学染色可见启动子GBP1使目的基因GUS在T1代转GBP1烟草叶片中表达，共筛选得到20株阳性T1代转GBP1烟草。野生型烟草的叶片中无GUS表达。以上结果表明：转基因烟草中的GBP1能启动GUS表达，证明该片段为启动子。
三、启动子GBP1的功能验证实验2
1、检测方法
A：GUS蛋白的提取：称取0.1g阳性T1代转GBP1烟草组织(根、茎或叶片)，加入400μL酶提缓冲液(由100ul β-巯基乙醇、2ml 0.5M PH 8.0EDTA二钠、100ul Triton X-100、0.1g十二烷基肌氨酸钠和50ml 1M pH 7.0磷酸缓冲液加水定容至100ml混合得到)。在冰浴中磨成匀浆。4℃、12000rpm/min离心10min后取上清液得到GUS粗酶溶液。
B：蛋白含量测定：取20μL步骤1)得到的GUS粗酶溶液，加H2O至4mL，再加入1mL考马斯亮蓝溶液，混匀，25℃下放置2min。测定595nm光吸收值，根据标准曲线计算样品蛋白含量。
C：GUS酶反应：在1mL37℃预热的反应缓冲液中(72mlGUS酶提取液(配制方法同A)中加入50mg 4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷，购自sigma公司，产品目录号L10287混合得到反应缓冲液，使4-MUG在反应缓冲液中的浓度为2mmol/L)，再加入100μL由A得到的GUS粗酶溶液，混匀，于37℃下保温30min，然后取出100μL反应液加入到900μL 0.2mol/L Na2CO3水溶液中终止反应，用FL-2500荧光分光光度计测定Ex365nm/Em455nm荧光值。以1min水解4-MUG生成1pmol 4-MU的所需酶量为一个酶活力单位，以每毫克蛋白的酶活力表示GUS活性。
2、检测结果：
I、激素胁迫处理：
将上述获得的阳性T1代转GBP1烟草幼嫩植株在培养液1、2、3或4中分别培养4h后进行GUS组织化学染色，并取在培养液1、2、3或4中分别培养4h后的阳性T1代转GBP1烟草幼嫩植株进行GUS酶活力荧光分光光度计检测分析。以培养于25℃光照培养箱，长日照(LD)(16h光/8h暗)条件下未经培养液处理的阳性T1代转GBP1烟草幼嫩植株为阴性对照(CK)。
培养液1(6-BA)由1/2MS培养液和细胞分裂素6-BA组成，所述6-BA在所述培养液中的浓度为1mg/L。
培养液2(GA3)由1/2MS培养液和赤霉素GA3组成，所述GA3在所述培养液中的浓度为2mM。
培养液3(SA)由1/2MS培养液和水杨酸SA组成，所述SA在所述培养液中的浓度为2mM。
培养液4(ABA)由1/2MS培养液和脱落酸ABA组成，所述ABA在所述培养液中的浓度为2mM。
将上述处理后的植株分为5组：
6-BA：阳性T1代转GBP1烟草经培养液1处理；
GA3：阳性T1代转GBP1烟草经培养液2处理；
SA：阳性T1代转GBP1烟草经培养液3处理；
ABA：阳性T1代转GBP1烟草经培养液4处理；
CK：阳性T1代转GBP1烟草正常培养(CK)。
将5组植株的根、茎和叶片分别采用上述的GUS组织化学染色法进行染色，结果如图6、7、8所示。
采用A方法分别提取6-BA组、GA3组、SA组、ABA组、CK组的根、茎和叶片GUS蛋白，分别测定GUS蛋白浓度(采用B方法)和进行GUS酶反应(采用C方法)，
结果如下：6-BA组GUS蛋白浓度分别为0.0012mg/g(根)、0.0012mg/g(茎)、0.0011mg/g(叶)；GA3组GUS蛋白浓度分别为0.0010mg/g(根)、0.0011mg/g(茎)、0.0016mg/g(叶)；SA组GUS蛋白浓度分别为0.0009mg/g(根)、0.0008mg/g(茎)、0.0017mg/g(叶)；ABA组GUS蛋白浓度分别为0.0010mg/g(根)、0.0010mg/g(茎)、0.0009mg/g(叶)；CK组GUS蛋白浓度分别为0.0011mg/g(根)、0.0010mg/g(茎)、0.0010mg/g(叶)。
6-BA组GUS酶比活分别为9897.6374-MUG pmol/min/mg蛋白(根)、24726.934-MUGpmol/min/mg蛋白(茎)、16926.314-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；GA3组GUS酶比活分别为10224.584-MUG pmol/min/mg蛋白(根)、13469.644-MUG pmol/min/mg蛋白(茎)、3807.3354-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；SA组GUS酶比活分别为8731.3254-MUG pmol/min/mg蛋白(根)、10738.244-MUG pmol/min/mg蛋白(茎)、5060.4534-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；ABA组GUS酶比活分别为8181.3934-MUG pmol/min/mg蛋白(根)、10408.524-MUGpmol/min/mg蛋白(茎)、4211.8734-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)。CK组GUS酶比活分别为8068.6054-MUG pmol/min/mg蛋白(根)、10877.434-MUG pmol/min/mg蛋白(茎)、4451.0964-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；
将酶活结果作图9，结合图6-8可以看出，与对照相比，1mg/L的细胞分裂素(6-BA)对T1代转GBP1烟草的诱导效应很强，且主要集中在叶片及茎中。GUS酶活叶片中约为对照的3.8倍，茎中约为对照的2.3倍，根部无明显增加；赤霉素(GA3)促进根、茎部GUS表达；水杨酸(SA)促进根、叶片中GUS表达，然而增加幅度较6-BA明显减小；脱落酸(ABA)对GUS表达量未见明显影响。以上激素诱导表达实验表明启动子GBP1主要参与细胞分裂素途径。
II、高温热激诱导
将上述获得的阳性T1代转GBP1烟草(生长在MS固体培养基)置于光照培养箱中，分别于37℃、42℃下处理，20min后进行GUS组织化学染色及GUS酶活力荧光分光光度计检测分析，以未经热处理(25℃)的阳性T1代转GBP1烟草苗作为阴性对照CK。
将上述处理后的植株分为6组：
37℃：37℃处理阳性T1代转GBP1烟草；
42℃：42℃处理阳性T1代转GBP1烟草；
CK：25℃处理阳性T1代转GBP1烟草；
将3组植株的叶片分别采用上述的GUS组织化学染色法进行染色，结果如图10所示。
将3组植株的叶片分别提取GUS蛋白(采用上述A方法)，分别测定蛋白浓度(采用上述B方法)和进行GUS酶反应(采用上述C方法)，结果如下：
37℃组GUS蛋白浓度为0.0009mg/g(叶)；42℃组GUS蛋白浓度为0.0014mg/g(叶)；CK组GUS蛋白浓度为0.0008mg/g(叶)；
37℃组GUS酶比活为9270.8254-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；42℃组GUS酶比活为12775.814-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；CK组GUS酶比活为4593.5214-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；
GUS酶反应如图11所示，结果表明：与对照相比，T1代转GBP1烟草经37℃处理20min后GUS酶活约为对照(25℃)时的2.0倍；至42℃后GUS表达量有明显增加，约为对照的2.8倍。推测GBP1启动子可能参与抗旱耐热防御反应，这与启动子分析序列显示的具体热的基序ATTTGGG相一致。
实施例3、转GBP1拟南芥的获得及功能鉴定
一、转基因拟南芥的获得
1、受体拟南芥的制备
将拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia(col-0，野生型(野生型拟南芥)种子用蒸馏水浸泡后，4℃春化2-4天后，撒播于1∶1的营养土：蛭石中，在培养室培养(温度为22℃±2℃，光照强度为0.3-0.4mmolm-2·s-1)，生长的光/暗周期为16h/8h，相对湿度为80％左右。)。当植株生长至茎高约3cm时，去掉其顶生花序，以刺激腋生花序的生长。待腋生花序长出时，其下部的花已有少量果荚出现时进行转化。转化前，将已长出的果荚除掉。
2、菌液制备及渗透操作
分别挑取农杆菌pBI121/pGBP1::GUS-nos、pBI121/pGBP1-1::GUS-nos、pBI121/pGBP1-2::GUS-nos、pBI121/pGBP1-3::GUS-nos和pBI121/pGBP1-4::GUS-nos单克隆放于5ml含有链霉素(所述抗生素在培养基中的终浓度为50mg/L)、利福平(所述抗生素在培养基中的终浓度为25mg/L)、卡那霉素(所述抗生素在培养基中的终浓度为50mg/L)的YEP培养液中，28℃，220rpm震荡培养至OD600为0.5左右。在转化前一天，转入50ml同样的含抗生素的YEP培养液中培养过夜(12h)，第二天，当菌液OD600在1.6-2.0时取出使用。25℃，10000rpm离心5min，弃上清液，沉淀悬浮于1/2MS渗透培养液(1/2MS培养液中加入质量分数为5％的蔗糖，体积分数为0.02％的表面活性剂silwet-17)中。将重悬液倒在小瓷盘中，将培养拟南芥的钵子横倒在瓷盘边，植株浸泡在悬浮液中，一定要保证莲座叶以上部分浸没于液体中，浸泡30s。取出植株，横放在塑料膜上，用保鲜膜盖在上面以保持湿度，并在保鲜膜上再覆盖一层锡纸避光。放在恒温室(24℃)培养。第二天揭开纸和保鲜膜，竖直培养。4-5d后，根据拟南芥的生长情况继续浸染一到二次。培养3-4周，得到30株T0代转GBP1拟南芥、30株T0代转GBP1-1拟南芥、30株T0代转GBP1-2拟南芥、30株T0代转GBP1-3拟南芥和30株T0代转GBP1-4拟南芥。
分别将上述植株进行PCR鉴定：提取T0代转GBP1拟南芥叶片的DNA作为模板，引物为pGBP1-F和pGBP1-R，得到约1512bp(测序为含有序列1自5’末端第8-1501位核苷酸)的为阳性T0代转GBP1拟南芥；得到27株阳性T0代转GBP1拟南芥；
提取T0代转GBP1-1拟南芥叶片的DNA作为模板，引物为pGBP1-1F和pGBP1-1R，得到约1063bp(测序为含有序列1自5’末端第457-1501位核苷酸)的为阳性T0代转GBP1-1拟南芥；得到25株阳性T0代转GBP1-1拟南芥；
提取T0代转GBP1-2拟南芥叶片的DNA作为模板，引物为pGBP1-2F和pGBP1-2R，得到约851bp(测序为含有序列1自5’末端第655-1489位核苷酸)的为阳性T0代转GBP1-2拟南芥；得到27株阳性T0代转GBP1-2拟南芥；
提取T0代转GBP1-3拟南芥叶片的DNA作为模板，引物为pGBP1-3F和pGBP1-3R，得到约735bp(测序为含有序列1自5’末端第768-1487位核苷酸)的为阳性T0代转GBP1-3拟南芥；得到25株阳性T0代转GBP1-3拟南芥；
提取T0代转GBP1-4拟南芥叶片的DNA作为模板，引物为pGBP1-4F和pGBP1-4R，得到约215bp(测序为含有序列1自5’末端第1305-1501位核苷酸)的为阳性T0代转GBP1-4拟南芥；得到28株阳性T0代转GBP1-4拟南芥；
待以上阳性T0代种子成熟后，分别收取种子即分别为T1代转GBP1拟南芥种子、T1代转GBP1-1拟南芥种子、T1代转GBP1-2拟南芥种子、T1代转GBP1-3拟南芥种子、T1代转GBP1-4拟南芥的种子，将这些种子干燥器中存放。
二、启动子的功能验证
1)方法：GUS蛋白的提取、蛋白含量测定、GUS酶反应方法参考实例2中A、B、C。
2)实验：
分别选取阳性T1代转GBP1拟南芥种子、阳性T1代转GBP1-1拟南芥种子、阳性T1代转GBP1-2拟南芥种子、阳性T1代转GBP1-3拟南芥种子、阳性T1代转GBP1-4拟南芥的种子适量，分别装入灭菌的1.5mL离心管中加入适量的无菌水，4℃春化2-4天，用75％的乙醇冲洗30s，无菌水洗2-3次后，再用体积分数为10％的次氯酸钠(NaClO)冲洗8-10min，不断振荡，吸去上清，然后迅速加入无菌水重新悬浮种子，如此重复3-5次，以洗去种子上的消毒液；再次用少量无菌水悬浮种子，吸起种子悬浮液，尽可能均匀的将其铺到1/2MS固体培养基板上(含卡那霉素所述抗生素在培养基中的终浓度为50mg/L)，待晾干培养基，用膜(Parafilm)封口后，光照培养，250μmol m-2sec-1白光，长日照(LD)(16h光/8h暗)。
I、GUS组织化学染色：
1、GBP1启动子
将阳性T1代转GBP1拟南芥种子萌发，培养条件为250μmol m-2sec-1白光，长日照(LD)(16h光/8h暗)。0、2、4、6、10、15天及30天结荚后分别采集植株不同部位进行GUS组织化学染色(见图12，A-F分别表示转基因种子萌发0天、2天、4天、6天、10天、15天大小幼苗中GUS基因的表达情况；G-K表示生长30天的转基因植株茎生叶、根、顶端花序中GUS基因的表达情况；L-Q表示转基因拟南芥种子成熟过程中种皮GUS基因的表达情况；R-T表示种子成熟过程中外果皮中GUS表达情况。)，以野生型拟南芥为对照。
结果表明：在T1代转GBP1拟南芥整个生长发育时期，GBP1启动子均能驱动GUS基因表达，在萌发的种子及幼苗下胚轴中表达量较高(图12A，B)，伴随转基因拟南芥幼苗的进一步发育，GUS表达量逐渐减弱(图12C-F)，30天大小的转基因植株，茎生叶脉、根中GUS基因则呈优势表达(图12G、H)；顶端花序中花瓣，花丝，花药及柱头部位均清晰可见GUS表达，上部叶片GUS表达减弱(图12I-K)；种子形成的过程中，种皮部位检测到GUS表达，随着种子进一步成熟，果荚中GUS表达渐弱(图12L-T)。至果皮干枯，种子完全成熟，染色剂无法进入组织内部，未能提供参考依据。以上结果表明：转基因拟南芥中的GBP1能启动GUS表达，证明该片段均为启动子。野生型拟南芥无GUS表达。
2、GBP1启动子及该启动子5’端缺失片段启动子
T1代转GBP1拟南芥种子、T1代转GBP1-1拟南芥种子、T1代转GBP1-2拟南芥种子、T1代转GBP1-3拟南芥种子、T1代转GBP1-4拟南芥种子消毒灭菌后播种于含有卡那霉素(所述抗生素在培养基中的终浓度50mg/L)的MS固体培养基上，待各转基因种子萌发6天、15天后采集整株进行GUS组织化学染色(见图13，a-e为转入GBP1启动子全长序列GBP1及各缺失片段GBP1-1、GBP1-2、GBP1-3、GBP1-4的拟南芥幼苗生长6天后GUS组织化学染色，A-E为转入启动子全长序列GBP1及各缺失片段GBP1-1、GBP1-2、GBP1-2、GBP1-4的拟南芥幼苗生长15天后GUS组织化学染色。)。以野生型拟南芥为对照。
结果表明：生长6天后，T1代转GBP1拟南芥子叶，下胚轴处均有GUS表达，缺失至1063bp(即含序列表中序列1自5′末端起第457-1501位核苷酸)的T1代转GBP1-1拟南芥两片子叶中及下胚轴处的GUS表达明显增强，缺失至851bp(即含序列表中序列1自5′末端起第655-1489位核苷酸)的T1代转GBP1-2拟南芥，GUS表达有所减弱但稍强于1512bp，缺失至735bp(即含序列表中序列1自5′末端起第768-1487位核苷酸)的T1代转GBP1-3拟南芥中GUS表达明显减弱，至最短的缺失片段215bp时(即含序列表中序列1自5′末端起第1305-1501位核苷酸)的T1代转GBP1-4拟南芥的子叶及下胚轴与胚根衔接点处，GUS表达增强且强于缺失至735bp，下胚轴处GUS表达较弱。生长至15天后，T1代转GBP1拟南芥的新生叶片及根部有微弱的GUS表达；莲座叶GUS表达稍强，同6天时染色类似，含长度为1063bp启动子缺失片段的拟南芥，莲座叶及下胚轴部分GUS表达量最多，其次为215bp，而851bp及735bp中GUS表达均较弱。
由以上组织化学染色分析可见，本实验中215bp启动子片段即含序列表中序列1自5′末端起第1305-1501位核苷酸(T1代转GBP1-4拟南芥)即可驱动GUS报告基因表达，且具有一定的表达水平，推测此区段可能存在增强子元件，在215bp-735bp处可能存在负调控元件，而在851bp-1063bp处可能存在增强启动子表达的正调控元件。目前尚未能明确究竟是何种元件在起调控作用，有待进一步验证。野生型拟南芥无GUS表达。以上结果表明：转基因拟南芥中的GBP1、GBP1-1、GBP1-2、GBP1-3、GBP1-4均能启动GUS表达，证明这些片段均为启动子。
II、激素胁迫处理：
鉴于实例1启动子元件分析结果，GBP1启动子内部无脱落酸应答元件；实例2中组织化学染色表明转基因烟草亦对脱落酸无应答，故在转基因拟南芥激素胁迫实验中摒弃脱落酸处理组，选择以下3种激素进行GUS酶活力检测分析。检测方法与实施例2相同。
1、水杨酸(SA)诱导对转基因植株中启动子的影响
图14A实验组(SA)：T1代转GBP1拟南芥种子在正常条件下(温度为22℃±2℃，光照强度为0.3-0.4mmolm-2·s-1)，生长的光/暗周期为16h/8h，相对湿度为80％左右。)培养16天，用含2mM水杨酸(SA)的培养液(由1/2MS培养液和SA组成，所述SA在所述培养液中的浓度为2mM。)喷施植株叶片，分别在处理0.5(30min)、1、2、4、6、8、12、24、48h取叶片检测GUS活性。
图14A的对照组(CK)：与实验组的方法基本相同，不同的是T1代转GBP1拟南芥种子喷施不含水杨酸的1/2MS培养液。
蛋白浓度的结果如下：14A实验组GUS蛋白浓度：0.5h为0.0021mg/g(叶)；1h为0.0021mg/g(叶)；2h为0.0022mg/g(叶)；4h为0.0021mg/g(叶)；6h为0.0021mg/g(叶)；8h为0.0020mg/g(叶)；12h为0.0021mg/g(叶)；24h为0.0021mg/g(叶)；48h为0.0019mg/g(叶)；14A对照组GUS蛋白浓度：ck为0.0021mg/g(叶)
14A实验组GUS酶比活：0.5h为6085.4614-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；1h为4371.634-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；2h为4527.7144-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；4h为7702.8124-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；6h为3024.5564-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；8h为4374.5224-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；12为3989.5924-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；24h为3645.344-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；48h为2754.1284-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；14A对照组GUS酶比活：ck为1620.664-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)。
结果表明，水杨酸可以诱导GUS表达，且启动子调控的GUS活性随处理时间的延长而提高，在4h达到最大值，GUS活性是处理前的4.7倍，然后开始下降。据此可以初步确定，水杨酸是GBP1基因启动子的诱导物。
图14B的实验组(SA)：T1代转GBP1拟南芥和T1代转入GBP1启动子缺失片段的拟南芥种子分别在正常条件下(温度为22℃±2℃，光照强度为0.3-0.4mmolm-2·s-1，生长的光/暗周期为16h/8h，相对湿度为80％左右。)培养16天，用含2mM水杨酸(SA)的培养液(由1/2MS培养液和SA组成，所述SA在所述培养液中的浓度为2mM)喷施植株叶片，处理4h，取叶片检测GUS活性。T1代转入GBP1启动子缺失片段的拟南芥分别为T1代转GBP1-1拟南芥、T1代转GBP1-2拟南芥、T1代转GBP1-3拟南芥、T1代转GBP1-4拟南芥。
图14B的对照组(CK)：如上述培养下的转基因拟南芥喷施不含水杨酸的1/2MS培养液，得到T1代转GBP1拟南芥对照组、T1代转GBP1-1拟南芥对照组、T1代转GBP1-2拟南芥对照组、T1代转GBP1-3拟南芥对照组、T1代转GBP1-4拟南芥对照组。
14B实验组GUS蛋白浓度：T1代转GBP1拟南芥为0.002078mg/g(叶)；T1代转GBP1-1拟南芥为0.001692mg/g(叶)；T1代转GBP1-2拟南芥为0.001732mg/g(叶)；T1代转GBP1-3拟南芥为0.001712mg/g(叶)；T1代转GBP1-4拟南芥为0.00174mg/g(叶)；
14B对照组GUS蛋白浓度：T1代转GBP1拟南芥对照组为0.002112mg/g(叶)；T1代转GBP1-1拟南芥对照组为0.001724mg/g(叶)；T1代转GBP1-2拟南芥对照组为0.001709mg/g(叶)；T1代转GBP1-3拟南芥对照组为0.001762mg/g(叶)；T1代转GBP1-4拟南芥对照组为0.002086mg/g(叶)。
14B实验组GUS酶比活：
T1代转GBP1拟南芥(pGBP1)为7702.8124-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；T1代转GBP1-1拟南芥(pGBP1-1)为9064.4634-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；T1代转GBP1-2拟南芥(pGBP1-2)为7088.3054-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；T1代转GBP1-3拟南芥(pGBP1-3)为2334.5344-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；T1代转GBP1-4拟南芥(pGBP1-4)为1302.9064-MUGpmol/min/mg蛋白(叶)；
14B对照组GUS酶比活：
T1代转GBP1拟南芥对照组((ck)pGBP1)为1205.2584-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；
T1代转GBP1-1拟南芥对照组((ck)pGBP1-1)为1456.5994-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；
T1代转GBP1-2拟南芥对照组((ck)pGBP1-2)为1176.2844-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；
T1代转GBP1-3拟南芥对照组((ck)pGBP1-3)为809.33884-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；
T1代转GBP1-4拟南芥对照组((ck)pGBP1-4)为281.5494-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；
结果表明，水杨酸可以显著诱导GBP1-1::GUS-nos，GBP1-2::GUS-nos，GBP1-3::GUS-nos中的启动子活性，该元件缺失后，启动子片段对水杨酸的应答效应体现较弱。据此可以初步确定，水杨酸的响应原件在-590-490bp之间，这与启动子分析的响应原件GGAACTAGC一致。
2、赤霉素(GA3)诱导对转基因植株中启动子的影响
图15A的实验组(GA3)：T1代转GBP1拟南芥(pGBP1)种子在正常条件下(温度为22℃±2℃，光照强度为0.3-0.4mmolm-2·s-1，生长的光/暗周期为16h/8h，相对湿度为80％左右。)培养16天，用含2mM的赤霉素培养液(由1/2MS培养液和GA3组成，所述GA3在所述培养液中的浓度为2mM。)喷施植株叶片，分别在处理0.5、1、2、4、6、8、12、24、48h取叶片检测GUS活性。图15A的对照组(CK)：如上述培养下的转基因拟南芥喷施不含赤霉素的1/2MS培养液(CK)。
15A实验组GUS蛋白浓度：0.5h为0.002051mg/g(叶)；1h为0.002063mg/g(叶)；2h为0.002052mg/g(叶)；4h为0.002058mg/g(叶)；6h为0.002043mg/g(叶)；8h为0.002097mg/g(叶)；12h为0.002102mg/g(叶)；24h为0.002147mg/g(叶)；48h为0.001828mg/g(叶)；15A对照组GUS蛋白浓度：ck为0.0021mg/g(叶)
15A实验组GUS酶比活：0.5h为4230.1474-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；1h为4768.014-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；2h为2524.9324-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；4h为7976.394-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；6h为5600.5924-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；8h为3221.7494-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；12为2638.3784-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；24h为3328.7754-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；48h为2468.134-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；15A对照组GUS酶比活：ck为1620.664-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)。
结果表明，赤霉素可以诱导GUS表达，且活性随处理时间的延长而提高，在4h达到最大值，GUS活性是处理前的4.9倍，然后逐渐降低。据此可以初步确定，赤霉素是GBP1基因启动子的诱导物。
图15B的实验组(GA3)：T1代转GBP1拟南芥(pGBP1)和T1代转入GBP1启动子缺失片段的拟南芥种子在正常条件下(温度为22℃±2℃，光照强度为0.3-0.4mmolm-2·s-1，生长的光/暗周期为16h/8h，相对湿度为80％左右。)培养16天，用含2mM的赤霉素培养液(由1/2MS培养液和GA3组成，所述GA3在所述培养液中的浓度为2mM。)喷施植株叶片，处理4h，取叶片检测GUS活性。T1代转入GBP1启动子缺失片段的拟南芥分别为T1代转GBP1-1拟南芥(pGBP1-1)、T1代转GBP1-2拟南芥(pGBP1-2)、T1代转GBP1-3拟南芥(pGBP1-3)、T1代转GBP1-4拟南芥(pGBP1-4)。
图15B的对照组(CK)：如上述培养下的转基因拟南芥喷施不含赤霉素的1/2MS培养液，得到T1代转GBP1拟南芥对照组(ck-pGBP1)、T1代转GBP1-1拟南芥对照组(ck-pGBP1-1)、T1代转GBP1-2拟南芥对照组(ck-pGBP1-2)、T1代转GBP1-3拟南芥对照组(ck-pGBP1-3)、T1代转GBP1-4拟南芥对照组(ck-pGBP1-4)。
15B实验组GUS蛋白浓度：pGBP1为0.002058mg/g(叶)；pGBP1-1为0.001709mg/g(叶)；pGBP1-2为0.001743mg/g(叶)；pGBP1-3为0.001821mg/g(叶)；pGBP1-4为0.001714mg/g(叶)15B对照组GUS蛋白浓度：ck-pGBP1为0.002112mg/g(叶)；ck-pGBP1-1为0.001724mg/g(叶)；ck-pGBP1-2为0.001709mg/g(叶)；ck-pGBP1-3为0.001762mg/g(叶)；ck-pGBP1-4为0.002086mg/g(叶)
15B实验组GUS酶比活：pGBP1为7976.394-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；pGBP1-1为3962.7944-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；pGBP1-2为2482.6194-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；pGBP1-3为1839.8994-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；pGBP1-4为1668.2274-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；
15B对照组GUS酶比活：(ck)pGBP1为1205.2584-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；(ck)pGBP1-1为1456.5994-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；(ck)pGBP1-2为1176.2844-MUGpmol/min/mg蛋白(叶)；(ck)pGBP1-3为809.33884-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；(ck)pGBP1-4为281.5494-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；
结果表明，赤霉素可以显著诱导GUS表达中启动子的活性，该元件缺失后，启动子片段对赤霉素的应答效应体现较弱。据此可以初步确定，赤霉素的响应原件在-1110～-1180bp之间，这与启动子分析的响应原件GCCTTTTG一致。
3、细胞分裂素诱导对转基因植株中启动子的影响
图16A的实验组(6-BA)：T1代转GBP1拟南芥(pGBP1)种子在正常条件下(温度为22℃±2℃，光照强度为0.3-0.4mmolm-2·s-1，生长的光/暗周期为16h/8h，相对湿度为80％左右。)培养16天，用含1mg/L的细胞分裂素(6-BA)的培养液(由1/2MS培养液和6-BA组成，所述6-BA在所述培养液中的浓度为1mg/L。)喷施植株叶片，分别在处理0.5、1、2、4、6、8、12、24、48h取叶片检测GUS活性。图16A的对照组(CK)：如上述培养下的转基因拟南芥喷施不含细胞分裂素的1/2MS培养液(CK)。
蛋白浓度：16A实验组GUS蛋白浓度：0.5h为0.001997mg/g(叶)；1h为0.00206mg/g(叶)；2h为0.002111mg/g(叶)；4h为0.002112mg/g(叶)；6h为0.002121mg/g(叶)；8h为0.002142mg/g(叶)；12h为0.002547mg/g(叶)；24h为0.00208mg/g(叶)；48h为0.001783mg/g(叶)；16A对照组GUS蛋白浓度：ck为0.0021mg/g(叶)
GUS酶反应：16A实验组GUS酶比活：0.5h为3344.9354-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；1h为2359.5144-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；2h为2892.1734-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；4h为5280.3384-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；6h为5166.5174-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；8h为3774.6244-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；12h为3213.4574-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；24h为3441.3714-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；48h为2743.2614-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；16A对照组GUS酶比活：ck为1620.664-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)。
结果表明，细胞分裂素可以诱导GUS表达，且活性随处理时间的延长而提高，在6h达到最大值，GUS活性是处理前的3.2倍，然后逐渐降低。据此可以初步确定，细胞分裂素是GBP1基因启动子的诱导物。
图16B的实验组：T1代转GBP1拟南芥(pGBP1)和T1代转入GBP1启动子缺失片段的拟南芥种子在正常条件下培养16天，用含1mg/L的细胞分裂素培养液(由1/2MS培养液和6-BA组成，所述6-BA在所述培养液中的浓度为1mg/L)喷施植株叶片，处理6h，取叶片检测GUS活性。T1代转入GBP1启动子缺失片段的拟南芥分别为T1代转GBP1-1拟南芥(pGBP1-1)、T1代转GBP1-2拟南芥(pGBP1-2)、T1代转GBP1-3拟南芥(pGBP1-3)、T1代转GBP1-4拟南芥(pGBP1-4)。图16B的对照组：如上述培养下的转基因拟南芥喷施不含细胞分裂素的1/2MS培养液，得到T1代转GBP1拟南芥对照组((CK)pGBP1)、T1代转GBP1-1拟南芥对照组((CK)pGBP1-1)、T1代转GBP1-2拟南芥对照组((CK)pGBP1-2)、T1代转GBP1-3拟南芥对照组((CK)pGBP1-3)、T1代转GBP1-4拟南芥对照组((CK)pGBP1-4)。
16B实验组GUS蛋白浓度：pGBP1为0.002112mg/g(叶)；pGBP1-1为0.001712mg/g(叶)；pGBP1-2为0.001806mg/g(叶)；pGBP1-3为0.00183mg/g(叶)；pGBP1-4为0.001799mg/g(叶)；16B对照组GUS蛋白浓度：(CK)pGBP1为0.002112mg/g(叶)；ck-pGBP1-1为0.001724mg/g(叶)；(CK)pGBP1-2为0.001709mg/g(叶)；ck-pGBP1-3为0.001762mg/g(叶)；(CK)pGBP1-4为0.002086mg/g(叶)
16B实验组GUS酶比活：pGBP1为5280.3384-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；pGBP1-1为2752.7474-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；pGBP1-2为2991.5954-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；pGBP1-3为2183.5044-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；pGBP1-4为1540.9064-MUGpmol/min/mg蛋白(叶)；16B对照组GUS酶比活：(CK)pGBP1为1205.2584-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；(CK)pGBP1-1为1456.5994-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；(CK)pGBP1-2为1176.2844-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；(CK)pGBP1-3为809.33884-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；(CK)pGBP1-4为281.5494-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；
结果表明，细胞分裂素可以显著诱导GUS表达，该元件缺失后，启动子片段对赤霉素的应答效应体现较弱。据此初步推断出细胞分裂素的响应原件位置，可能与赤霉素的效应元件位于同一区域，软件分析也未确定其具体位置，有待于作进一步验证。
III高温热激诱导：
图17A实验组(每列分别为37℃，42℃温度处理)：T1代转GBP1拟南芥(pGBP1)种子在正常条件下(温度为22℃±2℃，光照强度为0.3-0.4mmolm-2·s-1，生长的光/暗周期为16h/8h，相对湿度为80％左右。)培养16天，分别转入37℃、42℃下胁迫，每组处理于20min后取叶片进行GUS组织化学染色。
图17A对照组：如上述培养下的转基因拟南芥，未做高温胁迫(25℃，对照)。
蛋白浓度：17A实验组GUS蛋白浓度：37℃处理组为0.001758mg/g(叶)；42℃处理组为0.001764mg/g(叶)；17A对照组GUS蛋白浓度：ck为0.001484mg/g(叶)；
17A实验组GUS酶比活：37℃处理组为6723.7994-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；42℃处理组为9273.7564-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；17A对照组GUS酶比活：ck为4661.069
4-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)。
结果表明：胁迫处理20min后，37℃高温即可诱导GUS表达，表达量约为对照的1.4倍，42℃下GUS表达量约为对照的2.0倍。
图17B实验组(37℃)：T1代转GBP1拟南芥(pGBP1)和T1代转入GBP1启动子缺失片段的拟南芥种子在正常条件下(温度为22℃±2℃，光照强度为0.3-0.4mmolm-2·s-1)，生长的光/暗周期为16h光/8h暗，相对湿度为80％左右。)培养16天，转入37℃下胁迫，于20min后取叶片进行GUS酶活力检测。T1代转入GBP1启动子缺失片段的拟南芥分别为T1代转GBP1-1拟南芥(pGBP1-1)、T1代转GBP1-2拟南芥(pGBP1-2)、T1代转GBP1-3拟南芥(pGBP1-3)、T1代转GBP1-4拟南芥(pGBP1-4)。
图17B对照组(CK)：如上述培养下的转GBP1启动子缺失片段的拟南芥，未做高温胁迫，得到T1代转GBP1拟南芥对照组((CK)pGBP1)、T1代转GBP1-1拟南芥对照组((CK)pGBP1-1)、T1代转GBP1-2拟南芥对照组((CK)pGBP1-2)、T1代转GBP1-3拟南芥对照组((CK)pGBP1-3)、T1代转GBP1-4拟南芥对照组((CK)pGBP1-4)。
17B实验组GUS蛋白浓度：pGBP1为0.001758mg/g(叶)；pGBP1-1为0.001757mg/g(叶)；pGBP1-2为0.001785mg/g(叶)；pGBP1-3为0.00172mg/g(叶)；pGBP1-4为0.001715mg/g(叶)17B对照组GUS蛋白浓度：(CK)pGBP1为0.002112mg/g(叶)；ck-pGBP1-1为0.001724mg/g(叶)；
(CK)pGBP1-2为0.001709mg/g(叶)；ck-pGBP1-3为0.001762mg/g(叶)；
(CK)pGBP1-4为0.002086mg/g(叶)。
GUS酶反应：
17B实验组GUS酶比活：pGBP1为6723.7994-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；pGBP1-1为3929.5984-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；pGBP1-2为3258.9544-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；pGBP1-3为2098.0784-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；pGBP1-4为605.27874-MUGpmol/min/mg蛋白(叶)；17B对照组GUS酶比活：(CK)pGBP1为1205.2584-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；(CK)pGBP1-1为1456.5994-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；(CK)pGBP1-2为1176.2844-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；(CK)pGBP1-3为809.33884-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；(CK)pGBP1-4为281.5494-MUG pmol/min/mg蛋白(叶)；
结果表明，37℃高温可以显著诱导GBP1启动子活性，随着5′端逐渐缺失，3个不同位置的热激元件依次删除，GUS表达量渐弱，初步确定了3个热激调控元件的位置-480～-380bp；-780～-680bp；-1160～-1080bp，这与启动子分析的响应原件AAATTTC一致。
IV、光敏感性实验：
1、长日照(16h光/8h暗)下不同光周期对GBP1启动子昼夜节律性的影响：
T1代转GBP1拟南芥种子消毒后播种到MS培养基中置于光/暗周期为16h光/8h暗、温度为18-22℃、20000lx的光照培养箱内培养12d左右，长出2-4片真叶，然后转移到土中，16h光/8h暗，培养温度为18-22℃。28天后待植株生长良好，进行光敏感性检测，分两组处理：(1)长日照条件下培养48小时后连续48小时光照处理(即LD-LL，在16h光/8h暗条件下培养48小时后，连续48小时光照处理。)，96小时周期内每3小时取材一次，计32个样品。(2)长日照条件下培养48小时后连续48小时暗处理(即LD-DD；在16h光/8h暗条件下培养48小时后，连续48小时暗处理。)，96小时周期内每3小时取材一次，计32个样品，荧光分光光度计检测GUS酶活力。
结果表明：长日照条件下，自光期开始，T1代转GBP1拟南芥的GUS表达量逐步下调，12小时左右最低，此后3小时上调，15小时左右到达光期最高值，进入暗期前又回落至较低水平。暗期开始后GUS活性逐渐增强，4小时左右到达暗期下的最高值，暗期将近结束时维持在初始水平，进入下一个光周期表达模式。
处于长日照培养下的T1代转GBP1拟南芥植株，光周期结束后继续给予光照，GUS活性大幅增强，连续光照3小时后GUS活力明显增强，水平稍强于正常光周期光期下最高值；持续光照27小时后，GUS表达出现第二个峰值，约为正常光周期光期下最高值的1.5倍。随后降至初始平均水平，由图可见，连续的光照处理打破了该启动子原有的昼夜节律，并在特定时间一定程度上调节GUS表达量(见图18，具体见表2)。
处于长日照培养下的T1代转GBP1拟南芥，暗期结束后继续给予黑暗，12小时内GUS活性呈上升趋势，此后无规律上下波动，直至黑暗处理84小时时，出现第二个峰值，是正常光周期暗期下最高值的1.2倍。随后12小时内逐渐下调，但仍高于正常光周期下平均值。(见图19，具体见表2)。
2、短日照(8h光/16h暗)下不同光周期对GBP1启动子活性的影响：
T1代转GBP1拟南芥种子消毒后播种到MS培养基中，置于光/暗周期为16h光/8h暗、温度为18-22℃、20000lx的光照培养箱内培养12d左右，长出2-4片真叶，然后转移到土中，8h光/16h暗，培养温度为18-22℃。28天后待植株生长良好，进行光敏感性检测，分两组处理：(1)短日照条件下培养48小时后连续48光照处理(即SD-LL；在8h光/16h暗条件下培养48小时后，连续48小时光照处理。)，96小时周期内每3小时取材一次，计32个样品。(2)短日照条件下培养48小时后连续48暗处理(即SD-DD；在8h光/16h暗条件下培养48小时后，连续48小时暗处理。)，96小时周期内每3小时取材一次，计32个样品，荧光分光光度计检测GUS酶活力。
结果表明：短日照条件下受GBP1启动子调控的GUS酶平均活性高于长日照，约为长日照2倍，且仍能呈现一定的节律性。但与长日照下有所不同的是：随着短日条件下光期的缩短，光期下GUS表达在3小时左右即积累至较高水平，此后开始下调，进入暗期7小时左右后开始上调，9小时左右达最高值，水平与光期下最高值相当。随着暗期结束GUS表达逐渐下降，回落到初始水平，继续进入下一个光周期表达模式。
处于短日照培养下的转基因植株，正常光周期后继续给予光照，持续光照16小时内启动子活性基本维持恒定，未能体现相应的规律，此后GUS表达量急剧增强，约为正常光周期光期下最高值的1.8倍。之后的20小时内再次下调至相应水平，但GUS酶活力仍高于正常光周期下平均值(见图20，具体见表2)。
处于短日照培养下的转基因植株，暗期结束后继续给予黑暗，与正常短日照下暗期内表现类似，9小时内GUS表达明显上调，最高值约为正常光周期暗期下最高值的1.3倍，此后GUS表达量呈现不规则波动，直至黑暗处理结束时，GUS表达的水平仍稍高于正常光周期下平均值(见图21，具体见表2)。
光敏感实验的结果具体如下表2所示：
表2光敏感试验数据统计：
从表2中看出：1、GBP1的转录受日长调控：2天内在SD下表达量均高于LD下，GUS表达量平均水平约为LD下的2倍；SD促进该基因的表达。两种光周期(LD/SD)下暗期的长短(8h或16h)影响了该启动子光暗时期下峰值出现的时刻。短日照条件下，光期缩短8个小时，则GUS基因在光期下表达的峰值相应的提前9小时左右出现；暗期增长8个小时，则GUS基因在暗期下表达的峰值相应的推迟了6小时左右出现。2、GBP1的转录受生物钟所调控：由LD和SD分别转移至LL下，LL下表达方式与分别在LD和SD下相似，说明生物钟调控该基因的昼夜节律表达方式。
综合上述两点，该基因的转录受生物钟和日长的共同调控，并且SD诱导该基因的表达，从而推测该基因为大豆短日途径的开花促进因子。以上系列实验发现，在不同的光周期类型(长日；短日；长日照后连续48小时光处理；长日照后连续48小时暗处理；短日照后连续48小时光处理；短日照后连续48小时暗处理)下，GBP1启动子的活性产生了不同程度的改变，从GUS的表达量变化即可看出。然而植物对光周期的反应在分子水平上涉及细胞内外多种转录因子与顺式作用元件，目前，对于模式植物拟南芥中已确定的与光周期节律相关基因如LATE ELONGA TED HYPOCOTYL(LHY)，CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIA TED1(CCA 1)，TIMING OFCAB EXPRESSION 1(TOC1)，CONSTANS(CO)，FLOWERING TIME(FT)等，节律性的实现依赖于诸如上述基因的相互作用及分级调控，其中任一因子的改变均会对植物节律性的体现产生影响。本研究中给予转基因拟南芥以不同光暗周期，每组光周期下GUS表达量呈现不同的变化，推测植株体内与光周期节律钟相关的转录因子或蛋白等相应的以某种特定方式结合GBP1启动子内部光调控元件上，并指导其活性，进而诱导或抑制了GBP1启动子对光的应答效应，从而受启动子驱动的GUS基因表达量随之体现为不同程度的变化。本研究中目的基因GUS仅为报告基因，不能参与到光周期相关基因的表达模式体系中，难以推断与其功能关联的上下游基因，GUS基因的时空表达特点只能表明该基因在光调控之下独立表达的昼夜节律性，尚未能如实反映GBP1启动子或GBP1基因在光信号传递网络中的确切作用，后续工作将以此为参考，进一步证实该基因参与光周期反应的分子机理。
Claims (9)
1.DNA片段，为如下1)-9)中任一所述的DNA片段：
1)序列表的序列1所示的DNA分子；
2)序列表的序列1自5’末端第8-1501位核苷酸；
3)序列表中序列1自5′末端起第457-1501位核苷酸；
4)序列表中序列1自5′末端起第655-1489位核苷酸；
5)序列表中序列1自5′末端起第768-1487位核苷酸；
6)序列表中序列1自5′末端起第1305-1501位核苷酸；
7)在严格条件下与1)-6)中任一所述DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA片段；
8)与1)-7)中任一所述DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段。
2.含有权利要求1中所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.扩增权利要求1中所述DNA片段的引物对。
4.根据权利要求3所述的引物对，其特征在于：
所述引物对为如下任一1)-5)所示的引物对：
1)：所述引物对中的一条引物为序列2所示的核苷酸，另一条引物为序列3所示的核苷酸；
2)：所述引物对中的一条引物为序列4所示的核苷酸，另一条引物为序列5所示的核苷酸；
3)：所述引物对中的一条引物为序列6所示的核苷酸，另一条引物为序列7所示的核苷酸；
4)：所述引物对中的一条引物为序列8所示的核苷酸，另一条引物为序列9所示的核苷酸；
5)：所述引物对中的一条引物为序列10所示的核苷酸，另一条引物为序列11所示的核苷酸。
5.权利要求1所述DNA片段在使目的基因在植物组织中表达中的应用。
6.根据权利要求5中所述的应用，其特征在于：所述植物组织为根、茎、叶、花或种子。
7.根据权利要求5或6中所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
8.根据权利要求5-7中任一所述的应用，其特征在于：所述单子叶植物为烟草，所述的双子叶植物为拟南芥。
9.根据权利要求5-8中任一所述的应用，其特征在于：所述表达是通过光照调节、激素胁迫或高温胁迫实现的；所述激素优选为细胞分裂素、赤霉素、水杨酸、脱落酸，所述高温为37℃和/或42℃；
所述光照调节的方式为如下1)-4)中任一一种：
1)在16h光/8h暗条件下培养48小时后，连续48小时光照处理；
2)在16h光/8h暗条件下培养48小时后，连续48小时暗处理；
3)在8h光/16h暗条件下培养48小时后，连续48小时光照处理；
4)在8h光/16h暗条件下培养48小时后，连续48小时暗处理。
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