JP2003000082A - 選択マーカーを含まない組換え植物の作出方法、ならびに該方法により作出される組換え植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 選択マーカーを含まない組換え植物の効率的
な作出方法の提供。 【解決手段】 選択マーカーを含まない組換え植物の作
出方法であって、目的遺伝子および選択マーカーを植物
に導入し、該遺伝子導入植物を自殖させ、自殖後代のＤ
ＮＡ分析により目的遺伝子を含みかつ選択マーカーを含
まない植物個体を選抜し、さらに選抜した植物個体を用
いて目的遺伝子による形質の発現を検定する、ことを含
んでなる前記方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、選択マーカーを取
り除くことで安全性に配慮した組換え植物、特に経済的
に重要なイネ品種「コシヒカリ」組み換え体の作出方法
に関する。また本発明は、該方法により作出された組換
え植物に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、遺伝子組換えにより作出されたダ
イズやトウモロコシがアメリカなどから輸入され始めた
が、一般消費者はこれらに漠然とした不安感を抱き敬遠
している。組換え作物の安全性論議の中で指摘されるの
は、これらの輸入組換え作物が抗生物質抵抗性遺伝子を
残存させている点である。これらに使われているカナマ
イシン抵抗性遺伝子は十分な安全性評価が行われている
にもかかわらず、この点が最も問題視されている。さら
に、イネの遺伝子組換えにおいて選択マーカーとして最
も使われているハイグロマイシン抵抗性遺伝子について
は安全性に関するデータの蓄積が十分なされていない。
そのため、イネにおいてはこの遺伝子を除去した組換え
体を作出することが望ましい。しかし、抗生物質抵抗性
遺伝子の除去に主眼をおいた有用な遺伝子組換え作物の
開発方法についての報告はまだ少ない。

【０００３】また、輸入組換え作物の除草剤抵抗性など
の有用遺伝子が微生物に由来することも不安感をかき立
てる一因となっていることから、植物本来が持つ有用遺
伝子を用いることが望ましい。イネにおいては、植物本
来が持つ有用遺伝子としてイネの核由来キチナーゼを再
導入したイネがいもち病抵抗性を向上させた報告（Nish
izawa Y.ら、1999. Theoret. and Appl.Genet.,99,383:
383-390）はあるものの、イネの花器由来キチナーゼを
再導入したイネでそのことを実証した報告はない。これ
まで、遺伝子組換えにより有用形質を付与したイネにつ
いての報告はみられるが、実用レベルにまで至ったもの
はほとんど知られていない。

【０００４】その原因としては、以下のようなことが考
えられる。従来、イネの形質転換においてはエレクトロ
ポレーション法（Harms,C.T.ら、1978. Theor.Appl.Gen
et.,53:57-63）、ポリエチレングリコール法（Hayashim
oto,A.ら、1990. Plant Physiol.,93:857-863）、パー
ティクルガン法（Christou,P.ら、1991. Bio/technolog
y,9:957-962）などの直接導入法が用いられていたが、
これらの方法では一般にアグロバクテリウム法のような
間接導入法に比べ、完全長の遺伝子導入が困難であった
り、導入遺伝子のコピー数が多くなる傾向がある。その
ため、発現そのものが不安定であったり、再分化当代に
は一過性の高い形質の発現がみられるものの、自殖後代
にはジーンサイレンシング等により発現が抑制されてし
まう場合が多い。その後、単子葉植物にアグロバクテリ
ウム法を用いることが可能となり、イネにおいてもコピ
ー数を低く抑え、インタクトな状態で安定して導入でき
るようになった（特許第2649287号、Hiei,Y.ら、1994.
Plant J.,6:271-282）。

【０００５】しかし、有望個体の選抜場面では、再分化
当代から目的形質の発現の高さにばかりに目が向けられ
た選抜方法が採られていることが多い。そのため、例え
ば再分化当代において高い病害抵抗性を示す個体が得ら
れても、それが偶発的に低コピーのものでなければ、上
記のように自殖後代でその高い病害抵抗性を均一に維持
した集団を得ることができない。さらに、植物の病害抵
抗性のような生物検定は評価にばらつきが生じやすく、
再分化当代１株のみで行えばエスケープが出たり、逆に
貴重な有望個体を失うことになる。一方、ＤＮＡ分析
は、PCR等を用いた導入遺伝子の検出により客観的で正
確な判定を下すことができる。したがって、遺伝子組換
えによる病害抵抗性等の付与を目標とする場合、遺伝的
に固定した系統の選抜を優先させ、形質の均一な後代を
複数個体用いて検定した方が、結果として精度が高く、
効率的な選抜方法といえる。

【０００６】一方、遺伝子組換えにより作出した植物
は、導入した遺伝子が植物の染色体上のどの位置に組み
込まれたかよって発現量が異なり、必ずしも目的とする
形質を十分に発揮するとは限らないが、植物の染色体上
の特定位置に遺伝子を導入する方法は確立されていな
い。さらに、上述した理由から、導入した遺伝子が低コ
ピー数でなければならないが、そのように調整できる方
法はこれまでに知られていない。従って、低コピー数
で、目的形質を十分に発現する組換え体を得るには、あ
らかじめ多数の組換え体を作出しその中から選抜してい
かなければならない。

【０００７】従来、培養が容易で再分化植物を得られや
すいイネ品種である「日本晴」、「キヌヒカリ」、「サ
サニシキ」などを材料として有用な組換えイネを開発し
た報告は多い。しかしながら、日本で最も作付け面積が
多い「コシヒカリ」については、遺伝子導入効率が低い
ため、その遺伝子組換え体を得ることが困難であった。
そのため、経済的に重要なイネ品種である「コシヒカ
リ」の組換え体を効率よく作出できる方法が必要とされ
る。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、所望の形質
を有し、かつ抗生物質抵抗性遺伝子等の選択マーカーを
除去した植物、特に前記特徴を有するイネ品種「コシヒ
カリ」を効率よく作出する方法を提供することを課題と
する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意検討した。その結果、所望の形質に関
する目的遺伝子と選択マーカーとをコ・トランスフォー
メーションにより対象とする植物に導入し、該植物の自
殖後代をＤＮＡ分析により選抜し、選抜個体をさらに目
的遺伝子による形質の発現について検定することで、所
望の形質が付与され、かつ選択マーカーを含まない遺伝
的に固定した植物系統を高精度かつ効率的に作出できる
ことを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成され
たものである。

【００１０】すなわち本発明は、選択マーカーを含まな
い組換え植物の作出方法であって、以下（ａ）〜（ｄ）
の工程を含む前記作出方法である； （ａ）目的遺伝子および選択マーカーを植物に導入する
工程、（ｂ）（ａ）の植物を自殖させる工程、（ｃ）自
殖後代のＤＮＡ分析により、目的遺伝子を含み、かつ選
択マーカーを含まない植物個体を選抜する工程、（ｄ）
（ｃ）で選抜した植物個体を用いて、目的遺伝子による
形質の発現を検定する工程。また本発明は、前記の組換
え植物の作出方法により作出された組換え植物である。

【００１１】

【発明実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）本発明の組換え植物の作出方法 本発明の組換え植物の作出方法は、選択マーカーを含ま
ない組換え植物の作出方法であって、以下（ａ）〜
（ｄ）の工程を含む前記作出方法であることを特徴とす
る； （ａ）目的遺伝子および選択マーカーを植物に導入する
工程、（ｂ）（ａ）の植物を自殖させる工程、（ｃ）自
殖後代のＤＮＡ分析により、目的遺伝子を含み、かつ選
択マーカーを含まない植物個体を選抜する工程、（ｄ）
（ｃ）で選抜した植物個体を用いて、目的遺伝子による
形質の発現を検定する工程。

【００１２】本発明の組換え植物の作出方法（以下、
「本発明の方法」と記す）を適用し得る植物としては、
特に限定するものではないが、例えば単子葉植物、具体
的にはイネを挙げることができる。また、イネ品種とし
ては、例えば「日本晴」、「キヌヒカリ」、「ササニシ
キ」および特に経済的に重要なイネ品種である「コシヒ
カリ」を挙げることができるが、これらに限定されな
い。以下、各工程について詳しく説明する。

【００１３】（ａ）目的遺伝子および選択マーカーを植
物へ導入する工程 目的遺伝子および選択マーカーの植物への導入は、目的
遺伝子および選択マーカーを対象植物にコ・トランスフ
ォーメーションすることにより実施する。

【００１４】目的遺伝子としては、特に限定されるもの
ではないが、例えば植物がイネの場合、病害抵抗性、出
穂性や収量性等、量的形質に関与する遺伝子を用いるこ
とができる。特に植物がイネ品種「コシヒカリ」である
場合、限定するものではないが、目的遺伝子として、イ
ネのいもち病に対する抵抗性を向上させることが知られ
ているキチナーゼをコードする遺伝子、コメの食味に影
響を及ぼす因子の一つであるデンプン合成酵素をコード
するwaxy遺伝子（この遺伝子をアンチセンス方向に導入
し、胚乳中のアミロース含量を低下させると、コメの粘
りがよくなり、一般に食味が良くなるとされる）、コメ
のアレルゲンをコードする遺伝子（この遺伝子をアンチ
センス方向に導入し、そのアレルゲンを抑えることによ
り、コメにアレルギーのある人でも食べられるような低
アレルゲン米を開発し得ると考えられている）を用いる
ことができる。ここで、キチナーゼをコードする遺伝子
としてイネの花器由来キチナーゼをコードするcDNA（WO
98/29542[（株）オリノバ]、該cDNAと相同な遺伝子が三
重大学および京都大学の共同研究により単離された）
を、waxy遺伝子としてpWX15A（（株）三井業際植物バイ
オ研究所）を具体例として挙げることができるが、これ
らに限定されず、前記遺伝子と同機能を有することが知
られている遺伝子であれば、公知のデータベースから入
手してこれを用いてもよい。また、コメのアレルゲンを
コードする遺伝子は５,６種類あると推定されており、
このうち現在までに単離されているもののなかから、例
えばアレルゲンRA-17をコードする遺伝子や、解毒酵素
・アミラーゼインヒビターの一種であると同定されてい
る遺伝子(既知の小麦のアレルゲンとアミノ酸配列で93
％の相同性を有する)を用いることができる。

【００１５】また、前記目的遺伝子は、一般消費者の不
安感に配慮するという目的から、微生物などに由来する
ものではなく、植物由来のものが望ましい。また、発現
効率の点からは同種植物由来であることが望ましい。従
って、例えば植物がイネである場合、目的遺伝子はイネ
由来のもの、例えばイネの花器由来キチナーゼをコード
するcDNA（前掲）やwaxy遺伝子のアンチセンス遺伝子
（前掲）を挙げることができる。

【００１６】さらに、前記目的遺伝子が未知の機能を有
する遺伝子（配列）であった場合には、本発明の方法を
用いて該遺伝子を導入した組換え植物を作出することに
より、前記遺伝子の機能が解明されるだけでなく、同時
に選択マーカーが付与された組換え植物を得ることがで
きる。

【００１７】選択マーカーとしては、特に限定されない
が、例えば抗生物質抵抗性遺伝子を挙げることができ
る。抗生物質抵抗性遺伝子としては、限定するものでは
ないが、例えば植物がイネである場合、ハイグロマイシ
ン抵抗性遺伝子、ビアラフォス抵抗性遺伝子等を挙げる
ことができる。ただし、これらの選択マーカーは形質転
換細胞の効率的な選抜にのみ必要な遺伝子であり、その
後は植物細胞内に残存させる意味のないものである。こ
れらの安全性に関するデータ蓄積もまだ十分とはいえ
ず、開発された組換え作物を一般消費者に少しでも理解
してもらえるようにするには、このような不安要因を取
り除くことが重要である。本発明の方法を用いて組換え
植物を作出することにより、こうした問題点を解決する
ことができる。

【００１８】前記目的遺伝子および前記選択マーカーの
対象植物へのコ・トランスフォーメーションは、限定す
るものではないが、例えばエレクトロポレーション等に
よる直接的導入法、またはアグロバクテリウム属細菌を
介する間接的導入法を用いて実施することができる。し
かしながら、遺伝子導入効率を考慮すると、後者のアグ
ロバクテリウム属細菌を介する導入法が好適である。

【００１９】アグロバクテリウム属細菌を介する間接的
導入法を用いる場合、前記コ・トランスフォーメーショ
ンは、当業者に公知の手法に従い、例えば目的遺伝子お
よび選択マーカーを挿入したベクターを構築し、該ベク
ターを含むアグロバクテリウム属細菌を対象植物に感染
させることにより実施できる。

【００２０】目的遺伝子および選択マーカーを挿入した
ベクターとしては、限定するものではないが、例えば、
１つのアグロバクテリウム属細菌内に接続されていない
２つのT-DNAを配置したベクター（以下、「コ・トラン
スフォーメーション用ベクター」と記す）を用いること
ができる。このコ・トランスフォーメーション用ベクタ
ーを用いることにより、遺伝子導入した植物の自殖後代
において選抜マーカーを分離・除去することが可能とな
る。

【００２１】前記コ・トランスフォーメーション用ベク
ターは更に、スーパーバイナリー型のベクター（アグロ
バクテリウム・ツメファシエンス[Agrobacterium tumef
aciens]菌系のうち、感染能力の強い病原性の菌系のVir
領域の一部を、T-DNAを有するプラスミド中に配置する
ことにより目的遺伝子の導入効率を高めたバイナリーベ
クター。詳細はHiei,Y.ら、1994. Plant J., 6:271-282
を参照されたい）であってもよく、かかるベクターとし
ては、例えばオリノバ(株)により開発されたpSBシリー
ズのベクター（WO95/16031、Komari,T.ら、1996. Plant
J.,10:165-174）を挙げることができる。

【００２２】前記コ・トランスフォーメーション用ベク
ターは、限定するものではないが、例えば、T-DNA領域
に目的遺伝子を含む中間ベクターと、T-DNA領域に選択
マーカーを含むアクセプターべクターとをそれぞれ構築
し、これらをアグロバクテリウム属細菌中での相同組換
えによって調整することにより構築することができる。
これにより、２つのT-DNA領域をもったハイブリッドベ
クター（すなわち前記コ・トランスフォーメーション用
ベクター）が形成される。具体的には、後述の実施例１
および２の工程（ａ）に記載した通りにして、目的遺伝
子を含むコ・トランスフォーメーション用ベクターを構
築する。

【００２３】尚、前記コ・トランスフォーメーション用
ベクターを用いると一般に遺伝子導入効率が低くなるこ
とが知られているが、本発明の方法によれば、該ベクタ
ーを導入する植物の培養条件等の改良(後述)により、特
に遺伝子導入効率が低いとされるイネ品種「コシヒカ
リ」においても遺伝的に安定した組換え体を高頻度で得
ることができる。前記ベクターは、前記目的遺伝子およ
び前記選択マーカーの他に、例えばプロモーター等の他
の配列を有していてもよい。

【００２４】用いられるプロモーターとしては、該プロ
モーターを導入した植物の細胞内で機能するものであれ
ば特に制限はないが、目的とする導入形質が有効に発揮
されるものを適宜使用するのがよい。例えば、植物とし
てイネを用いていもち病に対する抵抗性の導入を目的と
する場合、葉茎あるいは穂で組織特異的に働くプロモー
ター、あるいは病原菌の感染により誘導されるプロモー
ターが適している。また、安全性配慮の観点からは目的
遺伝子と同様に、植物に由来するものが望ましい。しか
し、植物の形質転換に通常よく用いられるカリフラワー
モザイクウイルス３５Ｓプロモーター等でも十分形質を
発現させることが可能である。

【００２５】前記ベクターを含むアグロバクテリウム属
細菌としては、例えば、アグロバクテリウム・ツメファ
シエンス(Agrobacterium tumefaciens)を用いることが
好ましいが、これに限定されない。アグロバクテリウム
属細菌を感染させる植物の形態としては、限定するもの
ではないが、例えばカルス、葉、胚軸、根、種子、懸濁
培養細胞、プロトプラスト等があり、当業者であれば、
当該植物の再分化系に応じて適宜選択することができ
る。植物がイネである場合、通常はイネの胚盤由来カル
スを用いるが、安定した高い遺伝子導入効率を求めるに
は、完熟種子から誘導後概ね３週間以内の前記カルスを
用いることが好ましい。尚、従来の培養方法では、培養
細胞の生育の遅いイネ品種「コシヒカリ」で３週間以内
にカルスを誘導することは困難であったが、本発明の方
法においては「コシヒカリ」のカルスの培養条件に工夫
を加えることにより、３週間以内で分裂活性が高く、遺
伝子導入に適したカルスを誘導することを可能とした。
従って、本発明の方法により、従来遺伝子導入効率が低
かったイネ品種「コシヒカリ」においても、その組換え
体を効率的に作出することが可能である。

【００２６】具体的には、イネ品種「コシヒカリ」のカ
ルスを、以下に示す培養条件下で培養する。すなわち、
カルス誘導培地として、Ｎ６基本培地の窒素濃度を抑制
し、適当なアミノ酸を添加した培地（例えば、ＫＳＰ培
地[津川ら、1993.育種学雑誌43巻(別２)、121]）を使用
する。また、植物ホルモンとして2mg/Lの2,4-ジクロロ
酢酸（2,4-D）、糖として30g/Lマルトース、凝固剤とし
て0.8％アガロースを使用する。表面殺菌したイネ品種
「コシヒカリ」の玄米をこのカルス誘導培地に植え込
む。この際、胚乳部分は培地中に完全に埋め込み、胚部
分だけを露出させる。容器はシャーレを使い、ふたを粘
着力の弱いビニルテープ等で覆って、緩やかな乾燥を促
す。培養環境は28〜30℃の明室とする。このように培養
することで、イネ品種「コシヒカリ」の完熟種子から、
遺伝子導入に適した細かい粒状のカルスを３週間以内に
誘導することができる。

【００２７】前記形態の植物へのアグロバクテリウム属
細菌の感染、共存培養、植物の除菌、遺伝子導入された
植物の選抜・増殖、選抜された植物からの植物体再分化
は、当業者に公知の手法に従って実施することができ
る。しかしながら、植物がイネ品種「コシヒカリ」であ
る場合には、本発明者らが以前に開発した方法(Hashizu
meら、1999. Plant Biotechnology,16:397-401)を用い
ることが好ましい。具体的には、後述の実施例１（ａ）
中に記載した通りにして、イネ品種「コシヒカリ」のカ
ルスに遺伝子を導入する。その結果、再分化当代
（Ｔ₀）には、目的遺伝子と選択マーカーの両方を有す
る遺伝子導入植物が作出される。

【００２８】（ｂ）遺伝子導入植物を自殖させる工程 その後、（ａ）の工程において得られた再分化当代（Ｔ
₀）の植物を、当業者に公知の手法に従って順化、栽培
し、自殖後代を得る。例えば植物がイネである場合に
は、後述の実施例１（ｂ）中に記載した通りにして自殖
第１世代、Ｔ₁を採取する。

【００２９】（ｃ）自殖後代のＤＮＡ分析による選抜 上記（ａ）および（ｂ）の工程で得られた遺伝子導入植
物の再分化当代（Ｔ₀）、自殖第１世代（Ｔ₁）、自殖第
２世代（Ｔ₂）のＤＮＡをそれぞれ分析し、最終的に選
択マーカーを含まず、目的遺伝子を優性ホモの形で持つ
遺伝的固定系統を選抜する。

【００３０】ＤＮＡ分析は、各世代の植物の葉（特に植
物がイネである場合、幼苗の葉）からの簡易法によるＤ
ＮＡ抽出と、適切なＤＮＡ増幅・検出法との組み合わせ
で、導入した遺伝子の有無を調査することにより実施す
る。これにより多数の個体を取り扱うことができるう
え、早期に検定するため不要な系統を栽培する無駄を省
くこともできる。

【００３１】ＤＮＡ抽出に使用し得る簡易法としては、
限定するものではないが、例えばＳＤＳ簡易抽出法を挙
げることができる。尚、葉を抽出液に浸して砕く操作は
従来手作業により行っているが、この方法では時間と労
力がかかる上に、イネ等の繊維が発達した単子葉植物の
葉では効率が悪い。したがって、ＤＮＡ抽出は適切な粉
砕機（例えばQIAGN社のMixer Mill MM 300）を用いて、
機械的に粉砕する方法が効率の点で望ましい。

【００３２】適切なＤＮＡ増幅・検出法としては、限定
するものではないが、例えばＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、Ｉ
-ＣＡＮ法を挙げることができる。特に、ＬＡＭＰ法(T.
Notomi et al., Nucleic Acids Res., 20,1691-1696,e6
3(2000))は、増幅効率が高く、検出も簡便であるため、
本工程の効率化という点では好ましい。ＤＮＡ分析によ
る選抜は、例えば以下のようにして実施することができ
る。まず、再分化当代（Ｔ₀）では目的遺伝子と選択マ
ーカーの両方を持つ個体を選抜する。

【００３３】自殖第１世代（Ｔ₁）のＤＮＡ分析では、
１因子遺伝・選抜マーカー分離型のＴ₀を系統群として
選抜し、その中から選択マーカーを含まないＴ₁を新た
な系統として選抜する。ここでいう１因子遺伝・選抜マ
ーカー分離型とは、選択マーカーと分離した独立型の目
的遺伝子が植物の染色体上の１座位にのみ組み込まれ、
それ以外の座位（独立型の選択マーカーが入った座位、
目的遺伝子と選択マーカーが連鎖した座位）が１ないし
２であることをいう。

【００３４】自殖第２世代（Ｔ₂）のＤＮＡ分析では、
選択マーカーを含まないことの確認と、すべての個体で
目的遺伝子のみ持つ遺伝的固定系統（Ｔ₁）を選抜す
る。例えば、独立型の選択マーカーと独立型の選択マー
カー（または連鎖した遺伝子）がそれぞれ１座位のＴ₀
を選抜した場合、3/16の確率で目的遺伝子のみを含むＴ
₁個体が得られ、そのうちの1/3から優性ホモ系統を得ら
れる。具体的には、ＤＮＡ分析による選抜は、後述の実
施例１中工程（ｃ）に記載した通りにして実施すること
ができる。

【００３５】（ｄ）ＤＮＡ分析により選抜した植物個体
を用いて、目的遺伝子による形質の発現を検定する工程 上記のようにして選抜した優性ホモのＴ₂個体を、当業
者に公知の手法に従って、目的遺伝子による形質の発現
検定に供する。

【００３６】目的遺伝子により植物に付与される形質が
いもち病等の病害に対する抵抗性である場合、かかる病
害抵抗性検定は、例えば、遺伝子導入イネにいもち病菌
の胞子懸濁液を接種し、一定期間経過した後に前記イネ
の罹病率（抵抗性の程度）を調べて、その結果得られる
抵抗性の程度を元品種と比較し、発病の抑制程度の大き
い系統を選抜することにより実施する。ここでいもち病
菌を接種するイネの部位としては、限定するものではな
いが、例えば葉、茎、穂、穂首を選択することができ
る。また、いもち病の接種法としては、限定するもので
はないが、例えば針で接種部位に胞子懸濁液を注入する
手法を用いることができる。具体的には、病害抵抗性検
定は、後述の実施例１(ｄ)中に記載した通りにして実施
することができる。

【００３７】以上の操作により選抜された植物個体は、
選抜マーカーを含まず、また該植物に導入した目的遺伝
子により所望の形質を付与された、遺伝的に固定した組
換え植物系統である。

【００３８】（２）本発明の組換え植物 本発明の組換え植物は、上記本発明の方法により作出さ
れた組換え植物であることを特徴とする。本発明の組換
え植物は、選択マーカーが除去されていることから、一
般消費者の組換え作物に対する不安感を軽減するもので
ある。ここで植物とは、上記方法によって得られた植物
体だけでなく、この植物体から得られる栄養繁殖物およ
び種子等を含む概念である。

【００３９】

【実施例】以下に、実施例を示して本発明をさらに詳細
に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるもの
ではない。 〔実施例１〕 選択マーカーを含まない、いもち病抵抗
性イネ組換え体の作出（ａ）遺伝子の導入コ・トランスフォーメーション用ベクターの構築 コ・トランスフォーメーション用ベクターとして、スー
パーバイナリーベクターpSB424（WO95/16031、Komari,
T.ら、1996. Plant J.,10:165-174）を用いた。これ
は、中間ベクターpSB24とアクセプターベクターpSB4
（いずれもオリノバ（株）から契約分譲により入手）の
相同組換えによるハイブリッドベクターである。目的遺
伝子として、イネの花器由来キチナーゼをコードするcD
NA（WO98/29542[(株)オリノバ]、該遺伝子と相同な遺伝
子を三重大学より入手）を用いた。また、そのプロモー
ターとして、プラスミドpBE7131-GUS（Mitsuhara,I.
ら、1996. Plant Cell Physiol.,37:47-59）に含まれる
高発現を示すプロモーター領域を用いた。

【００４０】具体的な構築は以下のように行った。プラ
スミドpBE7131-GUSを制限酵素HindIIIとBamHIで消化し
た後、電気泳動にかけ、Prep-A-Gene DNA Purification
Matrix Kit(BIO RAD)を用いて2.2Kbの高発現プロモー
ター領域を含む断片を回収した。このDNAを同じ制限酵
素の組合せで消化した中間ベクターpSB24とDNA Ligatio
n kit(Takara Co.)を使って連結させ、プロモーター領
域を置換したサブクローンpSB25を得た。このサブクロ
ーンDNAを制限酵素BamHIとSacIで消化し、8.7Kbのベク
ター部分を回収した。このDNAをKlenow酵素(Boehringer
Mannheim)を用いて平滑化し、アルカリホスファターゼ
(ウシ小腸由来)(Takara Co.)を用いて脱リン酸化した。
一方、イネの花器由来キチナーゼをコードするcDNAを含
むプラスミドを制限酵素SmaIとEcoRVで消化し、1.3Kbの
該cDNAを含む断片を回収し、平滑化した。

【００４１】上記のようにして得られた該cDNAを含む断
片と高発現プロモーターに置換した中間ベクターをDNA
Ligation kit(Takara Co.)を用いて連結し、クローンpS
B25Chiを得た。挿入の方向性は、両者に存在するSphIサ
イトを利用して確認した。

【００４２】次に、アクセプターベクターpSB4を含むア
グロバクテリウム属細菌LBA4404、中間ベクターpSB25Ch
iを含む大腸菌LE392、およびヘルパープラスミドpRK201
3を含む大腸菌HB101の３種の菌をNutrient Agar(Difco)
上で混合し、一晩28℃で共存培養した。

【００４３】その後、混合した菌を50ｍg/Lのスペクチ
ノマイシンと50ｍg/Lのハイグロマイシンを含むAB培地
（Chilton,M.-D.ら、1974. Proc.Natl.Acad.Sci. ,USA,
71:3672-3676）上に薄く条播する操作を数回繰り返
し、両抗生物質に抵抗性のクローンを選抜した。このク
ローンは、pSB4由来のハイグロマイシン抵抗性とpSB25C
hiに由来するスぺクチノマイシン抵抗性を合わせ持った
ハイブリッドベクターを含むアグロバクテリウム属細菌
で、LBA4404／pSB425Chiと命名した。ベクターpSB425Ch
iの構造を図１に示す。

【００４４】キチナーゼをコードする遺伝子の導入 水稲品種「コシヒカリ」（Oryza sativa L. var Koshih
ikari）の完熟種子を表面殺菌後、KA-1培地（KSP培地を
基本とし、2mg/Lの2,4-D、30g/Lのマルトース、0.8％の
アガロース）に植え込み、シャーレを野菜結束テープ
（日東電工）で封をして28℃明室で培養した。３週間
後、分裂活性の高い、細かい粒状のカルスが多数誘導さ
れた。

【００４５】上記のようにして得られたカルスを、上記
で作製したアグロバクテリウム属細菌LBA4404／pSB42
5Chi に感染させ、Hashizumeら(1999)の方法に従って、
共存培養、カルスの除菌、遺伝子導入カルスの選抜・増
殖および、カルスからの植物体再分化を行った。具体的
な操作を以下に示す。

【００４６】まず、50mg/Lのハイグロマイシンを含むAB
培地（Chilton,M.-D.ら、1974. Proc.Natl.Acad.Sci.,
USA, 71:3672-3676）上で増殖させアグロバクテリウム
の菌体をミクロスパーテルで１さじとり、10mg/Lのアセ
トシリンゴンを含むKA-1液体培地（KSP培地を基本と
し、2,4-Dを2mg/Lに、シュークロースをマルトース30g/
Lに改変、pH5.8）20mLに、菌の塊がほぐれ、均一になる
まで十分に懸濁した。この懸濁液を9cmのガラスシャー
レに移した。次に、誘導したカルスをかごの形にしたス
テンレスメッシュ（網の大きさ：20メッシュ）に入れ、
このメッシュごとカルス全体が浸るように1分30秒間菌
懸濁液に漬けた。菌懸濁液を除去し、カルスを滅菌した
濾紙の上に移し、余分な水分を取り除いた。KA-1co培地
（KA-1培地に10g/Lのグルコース、10mg/Lのアセトシリ
ンゴンを添加、1.5％バクトアガー、pH5.2）上に2枚の
滅菌した濾紙を重ね置き、その上にカルスを互いに重な
らないように置いた。28℃、暗室で3日間共存培養した
後、滅菌水で液が透明になるまで余分な菌体をカルスか
ら洗い落とし、250mg/Lのカルベニシリンを含むKA-1液
体培地でリンスした。滅菌した濾紙で水切りし、カルス
をKA-1se培地（KA-1培地に250mg/Lのカルベニシリン、5
0mg/Lのハイグロマイシンを添加、0.8％アガロース、pH
5.8）に置床した。28-30℃、14時間日長の明室で３週間
培養した後、すべてのカルスを新鮮なKA-1se培地に移植
した。２〜３週間後、ハイグロマイシンによる選抜で生
き残り、増殖してきたカルスをKA-2培地（KA-1培地に30
g/Lのソルビトール、2g/Lのカザミノ酸、125mg/Lのカル
ベニシリン、50mg/Lのハイグロマイシンを添加、植物ホ
ルモンを0.4mg/Lの2,4-D、0.5mg/Lのアブシシン酸(AB
A)、0.1mg/Lのカイネチンに改変、0.8％アガロース、pH
5.8）に1週間置いた後、KA-3培地（KA-2培地の植物ホル
モンを0.5mg/Lの6-ベンジルアミノプリン(BAP)、0.2mg/
Lのインドール酢酸(IAA)に、ハイグロマイシン濃度を25
mg/Lに改変、0.8％アガロース、pH5.8）に移植し、３〜
４週間で植物体に再分化させた。

【００４７】（ｂ）自殖 その結果、ハイグロマイシン抵抗性を示す再分化当代の
植物体（Ｔ₀）を119個体得た。これらの再分化させた幼
苗を、個体別に育苗用培土（製品名「くみあい粒状培土
クリーン２号」；成分：１kｇ当たり窒素0.27g、燐酸0.
40g、カリ0.33g；製造：全農；販売：（株）三菱化学）
を入れた１粒播き用多穴ポット（製品名「みのる式ポッ
ト」）に植えた。次に、このポットを密閉のできる容器
（製品名「クリスタル・コンテナー」）に入れ、十分な
湿度を保ち、25℃、14時間日長で１〜２週間順化、活着
させた。その後、密閉容器から出し、個体別に220mL容
量のプラスチックカップに鉢上げし、25〜35℃、14時間
日長で栽培した。４〜５ヶ月後、88系統から成熟した種
子（自殖第１世代、Ｔ₁）を個体別に採取した。

【００４８】（ｃ）ＤＮＡ分析による選抜１次分析 再分化当代（Ｔ₀）の幼苗の葉からSDS簡易抽出法によ
り、ゲノムDNAを抽出した。具体的には下記の通り行っ
た。

【００４９】2-5cm長の葉片を採取し、直径3mmの硬質ビ
ーズと共に2.0mLマイクロチューブに入れた。硬質ビー
ズは、発達した硬い葉の場合はタングステンビーズ（QI
AGEN、比重14.9g/mL）を、幼苗の柔らかい葉の場合はジ
ルコニアビーズ（アズワン、比重5.5g/mL）を用いた。
これに、120μLのSDS抽出液を入れ、ミキサーミルＭＭ
３００（QIAGEN社製）を用いて、20Hz/sで2分間、さら
にサンプルの向きを変えて20Hz/sで2分間振動させた。
サンプルは15,000rpm、5分間遠心分離し、水層を採取す
る操作を2回繰り返し、夾雑物を除去した。これに100μ
Lのイソプロパノールを加えて、さらに15,000rpm、10分
間遠心分離し、水層を除去した。沈殿を70%エタノール
で洗浄し、乾燥させた後、30μLの1/10TE（20μg/mLの
リボヌクレアーゼ(Wako)含む）に溶解した。

【００５０】この溶液をテンプレート（1μL/本）とし
てPCRを行い、導入遺伝子に特異的な領域の増幅を図っ
た。プライマーとして、以下の２つのオリゴヌクレオチ
ド：5'-gacacccgcaagcgtga-3'（配列番号１）および5'-
ttgaacgccaccgtcgggtccgtt-3'（配列番号２）を用いて
イネ花器由来キチナーゼをコードするcDNA(PCR産物300
b)を、また以下の２つのオリゴヌクレオチド：5'-atgaa
aaagcctgaactcaccgcga-3' （配列番号３）および5'-tcc
atcacagtttgccagtgataca-3'（配列番号４）を用いてハ
イグロマイシン抵抗性遺伝子(同500b)の検出を行った。

【００５１】酵素にはEx-Taq DNAポリメラーゼ(Takara
Co.)を用い、MgCl₂濃度は1.0mMとし、他は添付マニュア
ルに従って10μL／本の反応液を調整した。これをPCR T
hermal Cycler MP(Takara Co.)にかけ、94℃-30秒を１
回の後、［94℃-20秒、55℃-1分、72℃-2分］を１サイ
クルとして35回繰り返して増幅反応を行った。次いで、
PCR産物を3.0％アガロースゲル電気泳動にかけて、Ｔ₀
個体における前記各遺伝子の存在を調べた。結果を下記
表１に示す。

【００５２】

【表１】

【００５３】（結果）イネ花器由来キチナーゼをコード
するcDNA、あるいはハイグロマイシン抵抗性遺伝子に特
異的なDNAバンドが確認された。このバンドパターンの
有無により、再分化当代（Ｔ₀）119個体のうち、119個
体(100％)すべてにハイグロマイシン抵抗性遺伝子が、1
02個体(85.7％)に花器由来キチナーゼをコードするcDNA
が組み込まれていることが確認された。また、種子（Ｔ
₁）を採取できた88個体に限れば、78個体(88.6％)にキ
チナーゼをコードするcDNAが組み込まれていた。

【００５４】なお、本実施例では、SDS抽出法は粉砕機
を用いて機械的に行ったが、この方法は従来の手作業に
よる方法（メスで細断し、抽出液になじませながらマイ
クロチップでたたいてつぶす）に比較して、作業時間を
半分以下（従来6時間要した工程を2〜2.5時間程度）に
短縮することが可能であった。

【００５５】２次分析 自殖第１世代の種子（Ｔ₁）を１系統当たり15〜20粒づ
つ１本植え用の多穴ポットに播種し、１週間後に幼苗の
葉片を採取した。上記と同様の方法でDNAを抽出し、こ
れをテンプレートとしてPCRによりＤＮＡの１次分析を
行った。有望な系統については１系統当たり30〜50粒に
種子数を増やして、２次分析を行った。２次分析を終え
た12系統のうち、5系統を１因子遺伝・選抜マーカー分
離型のＴ₀として選抜した。結果を下記表２に示す。ま
た、これらのＴ₁を個体ごとに１つの系統として、前記
工程（ｂ）と同様に自殖第２世代（Ｔ₂）を育成してそ
の種子を採取した。

【００５６】

【表２】

【００５７】３次分析 上記のようにして選抜したＴ₀系統群のうち、選択マー
カーを含まないＴ₁系統のＴ₂種子を１系統当たり30〜60
粒播種し、同様に３次分析を行った。結果を下記表３に
示す。

【００５８】

【表３】

【００５９】（結果）３次分析を終えた３系統群３系統
のうち、２系統群２系統が優性ホモであり、ハイグロマ
イシン抵抗性遺伝子を含んでいないことが確認された。

【００６０】（ｄ）発現形質の検定 上記で得られた優性ホモＴ₂個体を220mLポットに１系統
当たり10個体鉢上げし、４〜５葉期にイネいもち病菌
（Magnaporthe grisea）に対する病害抵抗性検定を行っ
た。

【００６１】まず最初に、前記いもち病菌（race003、0
07）を9cmシャーレに20mL注いだオートミール培地（50g
/Lのオートミール、20g/Lのショ糖、12.5％バクトアガ
ー）に移植し、28℃、暗室で培養した。２週間後に気中
菌糸を除去し、BLBランプを１週間照射して、形成され
た胞子を収集した。検定は精度を高めるため、以下の異
なる接種方法で２回行った。

【００６２】茎における病害抵抗性検定 まず、胞子懸濁液（race003）を1×10⁵個／mLの濃度
で、上記で得られたＴ₂ホモ系統のイネ組換え体および
元品種のイネ（非組換え体）にまんべんなく噴霧接種
し、２６℃の接種箱に２４時間静置した。その後日陰で
乾かし、温室に移して２ヶ月後に罹病により枯死した茎
の数を調査した。

【００６３】葉における病害抵抗性検定 次に、上記検定で生き残った茎の葉に、針で穴をあけ、
その部分に胞子を密集させた素寒天片を塗り付ける針接
種法を行った。接種後は同様に処理し、１週間後に以下
に示す畑苗代における圃場抵抗性調査基準（浅賀、198
1）（下記表４）により発病調査を行った。茎および葉
における結果を併せて下記表５に示す。

【００６４】

【表４】

【００６５】

【表５】

【００６６】（結果）その結果、２系統ともに対照の元
品種「コシヒカリ」と比較して、茎での発病は20％減少
し、葉での発病は病斑面積換算で対照40％に対し10％に
まで減少した（表５）。噴霧接種した元品種「コシヒカ
リ」（図２右側）には著しい褐変症状を示し枯死する茎
がしばしばみられるのに対し、コシヒカリ組換え体（図
２左側）では枯死する茎が少なく、生き残った茎の生長
も良好であった。これらのことにより、コシヒカリの大
きな欠点であるいもち病に対する抵抗性を向上させた組
換え体の遺伝的固定系統を作出できたことが確認でき
た。

【００６７】（ｅ）後代集団における病害抵抗性の確認 次に、組換えイネにおける病害抵抗性が導入した遺伝子
（キチナーゼ遺伝子）に起因していること、および後代
で病害抵抗性形質が固定されていることの確認を試み
た。

【００６８】(1) RT-PCR分析 イネの葉からQuick Prep Micro mRNA Purification Kit
（アマシャムファルマシア）を用いて、mRNAを抽出し
た。このmRNA（5-10 ng/μL）を鋳型として、SuperScri
pt One-step RT-PCR System (GIBCOBRL)を用いてRT-PCR
を行った。プライマーはゲノムDNAのPCRと同じキチナー
ゼcDNA特異的なものを使った。反応液はサーマルサイク
ラーPC-700（アステック）にかけ、50℃で30分間cDNAを
合成を行い、次に、94℃、2分間プレヒートした後、94
℃、15秒−55℃、30秒−68 ℃、2分の反応を25回繰り返
し、増幅した。増幅産物は3 %アガロースゲルで電気泳
動した。結果を図4に示す。

【００６９】(2) ウエスタンブロット分析 イネの葉からSDS抽出液（75 mM Tris-HCl, pH 6.8、2.5
% SDS、8M 尿素、 7.5 % 2-メルカプトエタノール）で
粗タンパク質を抽出した。150 mgのサンプルに対し、50
0 mLの抽出液を加え、ミキサーミルＭＭ３００（QIAGE
N）で粉砕した。15,000 rpmで10分間遠心分離し、水層
を新しいチューブに移し、3分間煮沸した。再度遠心分
離し、上澄み液を回収した。それぞれのサンプルのタン
パク濃度をプロテインアッセイキットII（BIO-RAD）で
定量した。

【００７０】Laemmli法に従い、12.5 %のSDSポリアクリ
ルアミドゲルにサンプル（20μg相当量）をのせ、20 mA
の定電流で16時間電気泳動した。次にセミドライブロッ
ティングによって、タンパク質を電気泳動転写膜（クリ
アブロットメンブレンＰ、ATTO）に転写した。ECLウエ
スタンブロット検出システム（アマシャムファルマシ
ア）により、キチナーゼタンパク質の検出を行った。１
次抗体（(株)オリノバから分譲）は1000倍希釈、HRP標
識２次抗体は5000倍希釈して用いた。結果を図5に示
す。

【００７１】（結果）RT-PCR分析（図4）においては、
非形質転換イネおよびキチナーゼ遺伝子を含まないhomo
zygousな T₁イネではキチナーゼ遺伝子特異的増幅産物
は認められなかったのに対し、キチナーゼ遺伝子を含む
イネではキチナーゼ遺伝子特異的増幅産物が確認でき
た。キチナーゼ遺伝子を含むイネの間で比較すると、he
terozygousなT₀ およびT₁イネに比べ、homozygousな T₁
イネではキチナーゼ遺伝子の発現量が大きかった。ま
た、その自殖第２世代（T₂）集団での発現はhomozygous
な T ₁イネと同程度で、病害抵抗性形質の安定した遺伝
が確認された。

【００７２】ウエスタン分析（図5）においても、同様
に、非形質転換イネに比べ、キチナーゼ遺伝子を含むイ
ネでは目的のタンパク質が強く検出され、homozygousな
T₁イネとその後代集団（T₂）では同程度の大きさであ
った。このことから、病害抵抗性はキチナーゼ遺伝子の
導入により誘導されたことが裏付けられた。以上より、
本発明の遺伝性分析に基づいた固定系統選抜法は、安定
した遺伝子発現をする後代集団の作出に有効であること
が確認できた。

【００７３】〔実施例２〕 選択マーカーを含まない、
waxy遺伝子を導入したイネ組換え体の作出 （ａ）遺伝子の導入コ・トランスフォーメーション用ベクターの構築 コ・トランスフォーメーション用ベクターとして、スー
パーバイナリーベクターpSB424（WO95/16031、Komari,
T.ら、1996. Plant J.,10:165-174）を用いた。これ
は、中間ベクターpSB24とアクセプターベクターpSB4
（いずれもオリノバ（株）から契約分譲により入手）の
相同組換えによるハイブリッドベクターである。目的遺
伝子として、イネのデンプン合成酵素をコードするcDNA
を含むプラスミド、pWX15A（（株）三井業際植物バイオ
研究所から分譲により入手）を用いた。また、そのプロ
モーターとして、プラスミドpBE7131-GUS（Mitsuhara,
I.ら、1996. Plant Cell Physiol.,37:47-59）に含まれ
る高発現を示すプロモーター領域を用いた。

【００７４】具体的な構築は以下のように行った。イネ
のデンプン合成酵素をコードするcDNAを含むプラスミ
ド、pWX15A(前掲)を制限酵素EcoRＩで消化した後、電気
泳動にかけ、Prep-A-Gene DNA Purification Matrix Ki
t(BIO RAD)を用いて2.0Kbの該cDNAを含む断片を回収
し、Klenow酵素(Boehringer Mannheim)を用いて平滑化
した。

【００７５】実施例１と同様にして高発現プロモーター
に置換した中間ベクターを作成し、これと前記のcDNAを
含む断片とをDNA Ligation kit(Takara Co.)を使って連
結した。これを大腸菌LE392に形質転換し、得られたク
ローンの中からアンチセンス方向に１コピーのみ導入さ
れたものを選抜し、pSB25Wxaとした。挿入の方向性およ
びコピー数は、制限酵素HindIIIとXhoIを同時処理して
得られる断片の長さを利用して確認した。

【００７６】次に、アクセプターベクターpSB4を含むア
グロバクテリウム属細菌LBA4404、中間ベクターpSB25Wx
aを含む大腸菌LE392、およびヘルパープラスミドpRK201
3を含む大腸菌HB101の３種の菌をNutrient Agar(Difco)
上で混合し、一晩28℃で共存培養した。

【００７７】その後、混合した菌を50ｍg/Lのスペクチ
ノマイシンと50ｍg/Lのハイグロマイシンを含むAB培地
（Chilton,M.-D.ら、1974. Proc.Natl.Acad.Sci. ,USA,
71:3672-3676）上に薄く条播する操作を数回繰り返
し、両抗生物質に抵抗性のクローンを選抜した。このク
ローンは、pSB4由来のハイグロマイシン抵抗性とpSB25W
xaに由来するスぺクチノマイシン抵抗性を合わせ持った
ハイブリッドベクターを含むアグロバクテリウム属細菌
で、LBA4404／pSB425Wxaと命名した。ベクターpSB425Wx
aの構造を図３に示す。該ベクター中では、2.0Kbのwaxy
遺伝子がアンチセンス方向に挿入されてる。

【００７８】次いで、実施例１と同様にして、水稲品種
「コシヒカリ」（Oryza sativa L.var Koshihikari）の
完熟種子から誘導したカルスを上記アグロバクテリウム
属細菌LBA4404／pSB425Wxa に感染させて、感染カルス
からの植物体再分化を行った。 （ｂ）自殖 その結果、ハイグロマイシン抵抗性を示す再分化当代の
植物体（Ｔ₀）を77個体得た。

【００７９】（ｃ）ＤＮＡ分析による選抜 再分化当代の植物体（Ｔ₀）について、実施例１と同様
に、ＤＮＡ分析による選抜を行った。アンチセンスwaxy
cDNA遺伝子の検出には、以下の２つのオリゴヌクレオ
チド：5'-ttggcggtgatgtacttgtcc -3'（配列番号５）、
5'- aggcagcactcgaggctccta-3'（配列番号６）をプライ
マーとして用いた。１次分析は省き、２次分析（T₁集団
の分析）から開始した。１系統あたり15〜20粒供試した
ＤＮＡ分析の結果、３つの１因子遺伝・選抜マーカー分
離型Ｔ₀の候補系統を選抜した。

【００８０】（ｄ）形質発現検定 供試数を増やした最終的な２次選抜をせず、予備試験的
に３つの候補Ｔ₀から、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子
を含まないＴ₁を新たな系統として育成し、Ｔ₂種子を採
取した。その種子（胚乳部分）を１個体当たり10粒用い
て、フリアーノの方法に準じてアミロース含量を求め
た。なお、検量線はポテトアミロース（タイプIII、シ
グマ）を標本として作成した。結果を表６に示す。

【００８１】

【表６】

【００８２】（結果）８系統を調査した結果、非形質転
換イネに比べてアミロース含量が低い個体が６系統みら
れ、最もアミロース含量が低いT51-3-4では、非形質転
換イネの85 %程度の含有量だった（表６）。以上より、
本発明の方法を用いてアンチセンス waxy cDNA 遺伝子
を導入することにより、イネの胚乳中のアミロース含量
を低下させ、食味の向上が期待できるコメを作出しうる
ことが確認できた。

【００８３】

【発明の効果】本発明の方法により、選択マーカーが除
去された組換え植物を作出することができる。とりわ
け、本発明の方法により、経済的に重要品種であるが、
従来遺伝子導入効率が低かったイネ品種「コシヒカリ」
を含む広範なイネ品種に対して、遺伝的に固定した実用
性の高い組換え体を効率よく作出することができる。

【００８４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mie prefecture <120> A method for producing transformed plant free from selection maker s, and the transformed plant produced by the method. <130> P00-0973 <150> JP2001-80886 <151> 2001-03-22 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized primer. <400> 1 gacacccgca agcgtga 17 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer used to detect cDNA enc oding chitinase derived from floral organ of rice. <400> 2 ttgaacgcca ccgtcgggtc cgtt 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer used to detect hygromyc in-resistant gene. <400> 3 atgaaaaagc ctgaactcac cgcga 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer used to detect hygromyc in-resistant gene. <400> 4 tccatcacag tttgccagtg ataca 25 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer used to detect antisens e cDNA of waxy gene. <400> 5 ttggcggtga tgtacttgtc c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer used to detect antisens e cDNA of waxy gene. <400> 6 aggcagcact cgaggctcct a 21

【００８５】

【配列表フリーテキスト】配列番号１：イネ花器由来キ
チナーゼをコードするcDNAを検出する為に使用したプラ
イマー。配列番号２：イネ花器由来キチナーゼをコード
するcDNAを検出する為に使用したプライマー。配列番号
３：ハイグロマイシン抵抗性遺伝子を検出する為に使用
したプライマー。配列番号４：ハイグロマイシン抵抗性
遺伝子を検出する為に使用したプライマー。配列番号
５：アンチセンスwaxy遺伝子cDNAを検出する為に使用し
たプライマー。配列番号６：アンチセンスwaxy遺伝子cD
NAを検出する為に使用したプライマー。

【図面の簡単な説明】

【図１】コ・トランスフォーメーション用ベクターpSB4
25Chiの構造を示す図である。

【図２】いもち病菌（race003、007）の接種による発病
の様子を示す写真である。

【図３】コ・トランスフォーメーション用ベクターpSB4
25Wxaの構造を示す図である。

【図４】RT-PCR分析における電気泳動の結果を示す写真
である。

【図５】ウェスタンブロッティングの結果を示す写真で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2B030 AB03 CA05 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA12 BA80 CA04 DA01 DA05 EA04 FA10 GA11 GA17 4B063 QA19 QA20 QQ04 QQ09 QQ44 QR08 QR42 QR56 QR62 QS25 QS34 QX02 4B065 AA88X AB01 AC20 BA02 CA31 CA53

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 選択マーカーを含まない組換え植物の作
   出方法であって、以下（ａ）〜（ｄ）の工程を含む前記
   作出方法； （ａ）目的遺伝子および選択マーカーを植物に導入する
   工程、（ｂ）（ａ）の植物を自殖させる工程、（ｃ）自
   殖後代のＤＮＡ分析により、目的遺伝子を含み、かつ選
   択マーカーを含まない植物個体を選抜する工程、（ｄ）
   （ｃ）で選抜した植物個体を用いて、目的遺伝子による
   形質の発現を検定する工程。
2. 【請求項２】 工程（ａ）において、目的遺伝子および
   選択マーカーの植物への導入がアグロバクテリウム属細
   菌を介して行われる、請求項１記載の組換え植物の作出
   方法。
3. 【請求項３】 工程（ｃ）において、ＤＮＡ分析が目的
   遺伝子および選択マーカーそれぞれに特異的にハイブリ
   ダイズするプライマーを用いて行われる、請求項１また
   は２に記載の植物の作出方法。
4. 【請求項４】 組換え植物がイネである、請求項１〜３
   のいずれか１項に記載の植物の作出方法。
5. 【請求項５】 イネがイネ品種「コシヒカリ」であり、
   かつ工程（ａ）において目的遺伝子および選択マーカー
   が「コシヒカリ」の完熟種子から誘導開始後３週間以内
   のカルスに導入される、請求項４記載の組換え植物の作
   出方法。
6. 【請求項６】 目的遺伝子がイネの花器由来キチナーゼ
   をコードする遺伝子またはwaxy遺伝子のアンチセンス遺
   伝子である、請求項４または５記載の組換え植物の作出
   方法。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項に記載の組
   換え植物の作出方法により作出された組換え植物。