CN112029761A - 一种基于转录组测序的扩增基因全序列的方法 - Google Patents

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CN112029761A CN202010725593.3A CN202010725593A CN112029761A CN 112029761 A CN112029761 A CN 112029761A CN 202010725593 A CN202010725593 A CN 202010725593A CN 112029761 A CN112029761 A CN 112029761A
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Abstract

本发明公开一种基于转录组测序的扩增基因全序列的方法，涉及扩增基因序列技术领域。本方法利用转录组建库、测序、拼接、注释后，获得转录组序列信息，再通过相关物种基因的同源比对，获取所需的基因序列，以获取的基因序列为模板来设计引物，扩增目的基因条带。本方法使用信息学的方法拼接得到目的基因序列全长，两个引物都是基于基因已知片段设计，方法简单，提高扩展效率，保证扩增序列的准确性，有助于推动未知序列扩增技术的发展。

Description

一种基于转录组测序的扩增基因全序列的方法
技术领域
本发明涉及扩增基因序列技术领域，具体涉及一种基于转录组测序的扩增基因全序列的方法。
背景技术
扩增基因序列是探明基因功能的基础。传统的扩增未知基因序列的方法主要通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)。它是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法。其原理是利用mRNA的末端的特殊序列，设计含有接头引物，与保守序列的特异引物扩增获得未知序列，再进行拼接，得到基因全序列。
RACE技术需要使用到RNA末端的特殊引物，方法复杂。
发明内容
本发明的目的就是针对现有RACE技术存在的需要使用到RNA末端的特殊引物，方法复杂的不足，提供一种基于转录组测序的简便快速获得未知序列片段的新方法。本方法利用转录组建库、测序、拼接、注释后，获得转录组序列信息，再通过相关物种基因的同源比对，获取所需的基因序列。以获取的基因序列为模板，设计引物，扩增目的基因条带。该方法简单方便，无需合成特殊引物，扩增效率高，准确性高，是未知序列扩增的有效方法。
本发明采用以下技术方案。
本发明提供一种基于转录组测序的扩增基因全序列的方法，利用转录组建库、测序、拼接、注释后，获得转录组序列信息，再通过相关物种基因的同源比对，获取所需的基因序列，以获取的基因序列为模板来设计引物，扩增目的基因条带。
进一步的，本发明的扩增基因全序列的方法包括以下步骤：
S1，用Trizol试剂或者RNAiso Plus试剂提取金线莲总RNA；
S2，以提取的金线莲总RNA为模板，以oligo(dT)18为逆转录引物，合成cDNA第一链；
S3，以cDNA第一链为模板，用cDNA第二链合成试剂盒(Second Strand cDNASynthesis Kit)合成cDNA第二链；
S4，对得到的cDNA第二链样品，建立cDNA文库，再进行总RNA测序，对测序数据过滤、组装和去冗余后获得金线莲Unigene序列，对金线莲Unigene序列进行功能注释；
S5，获取除金线莲外的其他兰科植物的基因序列，与获得的金线莲Unigene序列进行比对，获取与所述其他兰科植物的基因序列相同功能的金线莲的基因序列，以所述金线莲的基因序列为模板，设计引物并扩增得到目的基因。
优选地，步骤S1具体包括：
(1)取金线莲植株，加液氮快速研磨成粉状，取50～150mg装入离心管，加入0.5～1.5mL RNAiso Plus，摇晃离心管使金线莲粉状样品与RNAiso Plus充分混匀后，静置5～15min；
(2)以10000～14000g的离心力，2～6℃条件下，离心5～15min，取离心后离心管中的上清液300～900μL，放置于新的离心管中；
(3)向放置上清液的试管中加入50～250μL氯仿，摇晃混匀，静置5～15min；
(4)以10000～14000g离心力、2～6℃条件下，离心10～20min；
(5)将上清液200～400μL转移至新的离心管中，加入200～400μL异丙醇混匀，静置5～15min；
(6)10000～14000g的离心力、2～6℃条件下，离心5～15min，吸弃离心管中的上清液，先后加入500～1000μL无水乙醇和100～400μL RNase-free水，混匀以洗涤RNA；以10000～14000g离心力、2～6℃条件下，离心10～20min，吸弃去上清液；
(7)重复步骤(6)一到二次；
(8)吸弃去上清的离心管于室温中干燥5～30min，向干燥的离心管中加入20～40μL的RNase-free水，以溶解RNA；
(9)RNA溶解后，测定260和280nm吸光值，计算总RNA浓度和OD260/OD280值；并进行电泳分离，检测总RNA样品质。
优选地，步骤S2具体包括：
(1)取总RNA 0.5～1.5μg、dNTP Mixture0.5～1.5μL、oligo(dT)18 0.5～1.5μL和RNase free ddH2O 1～10μL，配制逆转录混合液I于离心管中；
(2)取5×PrimeScriptTM Buffer 3～5μL、DTT(100μmol/L)0.1～0.5μL、RNaseInhibitor0.1～1μL、PrimeScriptTM Reverse Transcriptase 0.5～1.5μL和RNase freeddH2O 1～10μL，配制逆转录混合液II于另一离心管中；
(3)将逆转录混合液I在50～68℃温浴3～8min后，冰浴1～3min；
(4)瞬时离心逆转录混合液I为2～15秒使液体混合液收集到离心管底部后，加入逆转录混合液II，瞬时离心2～15秒使液体混合液收集到离心管底部后30～50℃反应30～60min；
(5)在78～85℃条件下反应3～10min，使混合液中的酶液失活，得到cDNA第一链的样品，-30℃～-10℃保存备用。
优选地，步骤S3具体包括：
(1)取cDNA第一链样品10～30μL，在冰浴上加入无核酸酶ddH2O 50～80μL、Reaction buffer(10×)5～10μL、DNA polymerase I(19U/μL)1～8μL和RNase H(1U/μL)0.5～2μL；
(2)混匀，10～20℃温浴1～3h；
(3)加入2～10μL0.5 mol/L乙二胺四乙酸溶液混匀，终止反应；
(4)向终止反应的混合液加入等体积酚、氯仿和异戊醇混合液，以10000～16000g离心力，离心5～15min；
(5)吸取离心管中的上清液，转移至新的离心管中，加入相同体积的氯仿溶液，充分混匀后，以10000～16000g的离心力，离心2～10min；
(6)吸取离心管中的上清液，转移至新的离心管中，加入1/20～1/5体积的3M NaAc和2～3倍体积的预冷乙醇，充分混匀，在-30℃～-10℃中静置沉淀12h以上；
(7)以10000～16000g的离心力，在2～6℃条件下，离心40～100min，吸弃上清液体；
(8)向吸弃上清液的离心管中加入0.5～1.5mL乙醇，离心出的沉淀物质，再以10000～16000g的离心力，离心2～10min，吸弃上清液体，室温干燥得到cDNA第二链样品。
优选地，步骤S4具体包括：
(1)将得到的cDNA第二链样品，经过poly(A)加尾和末端修复后连接到测序接头，选择300～500bp大小的片段为模板，进行PCR扩增，建立cDNA测序文库，并在IIIuminaHiSeq xten平台两端测序；
(2)使用FastQCv0.11.3软件对测序原始数据进行质量评估；
(3)用NGSQCToolkitv2.3.3软件进行质量过滤，去除接头、去除低质量和未知碱基含量超过1％的短序列；
(4)用Trinity v2.4.0软件对过滤后的短序列进行DeNovo组装，去冗余后获得非重复序列基因，获得金线莲Unigene序列；
(5)用BLAST v2.2.31+软件，将长度大于200bp的Unigene序列与SWSSPROT和KOG数据库进行同源比对，并用TransDecoderv2.0.1软件进行功能注释。
优选地，步骤S5具体包括：
(1)通过NCBI数据库获取除金线莲外的其他兰科植物的PAL基因序列，与获得的金线莲Unigene序列比对，得到金线莲PAL基因序列，并以金线莲PAL基因序列为模板，设计引物5'-ATGGACCATGCTAGGGAGAACG-3'/5'-CTAGCAAATAGGGAGAGGAGCTTCA-3'扩增得到目的基因片段；
(2)通过NCBI数据库获取其他兰科植物的CHS基因序列，与获得的金线莲Unigene序列进行比对，得到金线莲CHS基因序列，并以金线莲CHS基因序列为模板，设计引物5'-ATGCCGAGCCTCGAATCCA-3'/5'-TTAAAGAGGAACGCTGCGAA-3'扩增得到目的基因片段；
(3)通过NCBI数据库获取其他兰科植物的FPS基因序列，与获得的金线莲Unigene序列进行比对，得到金线莲FPS基因序列，并以金线莲FPS基因序列为模板，设计引物5'-ATGGAGGAAGGGGACAGGA-3'/5'-CTACTTTTGCCTTTTATAAATCTTATGA-3'扩增得到目的基因片段。
本发明的有益效果是：
1、本发明采用转录组测序的方法，通过生物信息学技术，先获得目的基因的Unigene序列，再设计两端引物扩增，避免使用兼并引物，提高基因扩增的准确性。通过本方法可避免需要合成如应用RACE技术时使用到的RNA末端的特殊引物。本发明使用信息学的方法拼接得到目的基因序列全长，两个引物都是基于基因已知片段设计，方法简单，提高扩展效率，保证扩增序列的准确性，推动未知序列扩增技术的发展。
2、本发明采用转录组测序的方法，可获得该物种的整个转录本，理论上可获得该物种的所有基因序列，从广度上提高了基因扩增的效率。
附图说明
图1为金线莲PAL基因开放阅读框的扩增片段电泳图。
图2为获得的金线莲PAL Unigene与扩增片段测序序列比对图。
图3为金线莲CHS基因开放阅读框的扩增片段电泳图。
图4为获得的金线莲CHS Unigene与扩增片段测序序列比对图。
图5为金线莲FPS基因开放阅读框的扩增片段电泳图。
图6为获得的金线莲FPS Unigene与扩增片段测序序列比对图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例
为让一般技术人员更了解本发明的技术方案，以金线莲为例，讲述本发明的方案，本实施例包括五个部分，具体如下：
第一部分RNA提取
用RNA提取试剂RNAiso Plus(TaKaRa，大连)，按下列步骤分别提取金线莲的总RNA：
(1)取金线莲植株，加液氮快速研磨成粉状，取100mg左右装入1.5mL离心管，立即加入1mL RNAiso Plus，用力摇晃离心管直至样品与RNAiso Plus充分混匀后，放置于室温中，静置10min左右。
(2)以12000g的离心力，4℃条件下，离心10min，取离心后离心管中的上清液600μL，放置于新的离心管中。
(3)向放置600μL上清液的试管中加入150μL氯仿，并用力摇晃混匀，放置于室温中，静置10min左右。
(4)以12000g离心力、4℃条件下，离心15min。
(5)将上清液300μL转移至新的离心管中，加入300μL异丙醇颠倒混匀，室温静置10min。
(6)12000g的离心力、4℃条件下，离心10min，吸弃离心管中的上清液，先后加入750μL无水乙醇和250μL RNase-free水，轻轻缓慢上下颠倒离心管以洗涤RNA。以12000g离心力、4℃条件下，离心15min，并尽可能多的吸弃去上清。
(7)重复步骤(6)一次。
(8)吸弃去上清的离心被放置于室温中干燥15min，向干燥的离心管中加入30μL的RNase-free水，溶解提出的RNA。
(9)RNA溶解后，使用超微量分光光度计(Bio-Rad，美国)测定260和280nm吸光值，计算总RNA浓度和OD260/OD280值。并使用0.8％非变性琼脂糖凝胶电泳(135V)分离，检测总RNA样品质。
总量>20μg，RNA浓度>250ng/μL，OD260/OD280在1.8～2.2之间，RIN>6.5的样品进行后续实验。
第二部分cDNA第一链合成
提取的金线莲总RNA为模板，采用PrimeScriptTMReverse Transcriptase(TaKaRa，China)，以oligo(dT)18为逆转录引物，按下列步骤合成cDNA第一链：
(1)按表1配方，配制逆转录混合液I(表1)，于0.2mL进口离心管中。
表1逆转录混合液I
Figure BDA0002601552480000051
(2)按表2配方，在另一0.2mL离心管中配制逆转录混合液II(表2)。
表2逆转录混合液II
Figure BDA0002601552480000061
(3)将逆转录混合液I在65℃温浴5min后，迅速冰浴冷却2min。
(4)瞬时离心数秒使液体混合液收集到离心管底部后，加入逆转录混合液II，瞬时离心数秒使液体混合液收集到离心管底部后42℃反应45min。
(5)在80℃条件下反应5min，使表1和表2中添加的酶液失活，得到cDNA第一链的样品，-20℃保存备用。
第三部分cDNA第二链合成
以cDNA第一链为模板，用Second Strand cDNA Synthesis Kit(Elabscience，武汉)合成cDNA第二链，详细步骤如下：
(1)取cDNA第一链样品20μL，在冰浴上加入无核酸酶ddH2O 68μL、Reactionbuffer(10×)8μL、DNA polymerase I(19U/μL)3μL和RNase H(1U/μL)1μL。
(2)低速涡窝振动混匀液体，15℃温浴2h。
(3)加入5μL0.5 mol/L乙二胺四乙酸(Ethylenediamine tetra acetic acid,EDTA)(pH8.0)混匀，终止反应。
(4)向终止反应的混合液加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，以13000g离心力，室温条件下，离心10min。
(5)吸取离心管中的上清液，转移至新的离心管中，加入相同体积的氯仿溶液，充分混匀后，以13000g的离心力，室温条件下，离心5min。
(6)吸取离心管中的上清液，转移至新的离心管中，加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积的预冷无水乙醇，充分混匀，在-20℃冰箱中静置沉淀12h以上。
(7)以13000g的离心力，在4℃条件下，离心70min，吸弃上清液体。
(8)向吸弃上清液的离心管中加入1mL70％乙醇，离心出的洗涤沉淀物质，再以13000g的离心力，离心5min，吸弃上清液体，并置于室温中，干燥至无乙醇味，得到cDNA第二链样品。
第四部分RNA测序和功能注释
(1)上述第三部分得到的cDNA第二链样品，经过poly(A)加尾和末端修复后连接到测序接头，选择300～500bp大小的片段为模板，进行PCR扩增，建立cDNA测序文库，并在IIIumina HiSeq xten平台两端测序。
(2)使用FastQCv0.11.3软件(https://www.softpedia.com/get/Science-CAD/Fast QC.shtml)对测序原始数据进行质量评估。
(3)用NGSQCToolkitv2.3.3软件(http://www.mybiosoftware.com/ngs-qc-toolkit-v2-3-3-toolkit-for-the-quality-control-qc-of-next-generation-sequencing-ngs-data.html)进行质量过滤，去除接头、去除低质量和未知碱基含量超过1％的短序列(reads)。
(4)用Trinity v2.4.0软件(https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki)对过滤后的短序列(reads)进行DeNovo(De novo assembly)组装，去冗余后获得非重复序列基因(Universal gene,Unigene)，获得金线莲Unigene序列。
(5)用BLAST v2.2.31+软件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，将长度大于200bp的Unigene序列与SWSSPROT(https://swissmodel.expasy.org/)和KOG(https://genome.jgi.doe.gov/Tutorial/tutorial/kog.html)数据库进行同源比对，并用TransDecoderv2.0.1(https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki)软件进行功能注释。
第五部分不同目的基因的获取及比对
(1)通过NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)获取其他兰科植物的PAL基因序列，与获得的金线莲Unigene序列比对，得到金线莲PAL基因序列，并以此为模板，设计引物5'-ATGGACCATGCTAGGGAGAACG-3'/5'-CTAGCAAATAGGGAGAGGAGCTTCA-3'扩增得到2000bp左右的目的片段(如图1)。图1为金线莲PAL基因开放阅读框的扩增片段电泳图，图中M表示marker，1表示金线莲PAL基因扩增条带。图2为获得的金线莲PAL Unigene与扩增片段测序序列比对图。通过测序，比对扩增片段与转录组同源比对Unigene序列的相似性为99.2％(如图2)，由结果可知，通过转录组测序获得金线莲PAL基因开放阅读框序列与实验验证扩增该基因序列的核苷酸序列完全相同2148bp，其中仅17bp碱基不同，相似率达99.2％，通过该方法获取目的基因全序列的方法准确性高。
(2)通过NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)获取其他兰科植物的CHS基因序列，与获得的金线莲Unigene序列进行比对，得到金线莲CHS基因序列，并以此为模板，设计引物5'-ATGCCGAGCCTCGAATCCA-3'/5'-TTAAAGAGGAACGCTGCGAA-3'扩增得到1000bp左右的目的片段(如图3)。图3为金线莲CHS基因开放阅读框的扩增片段电泳图，图中M表示marker，1表示金线莲CHS基因扩增条带。通过测序，比对扩增片段与转录组同源比对Unigene序列的相似性(如图4)，图4为获得的金线莲CHS Unigene与扩增片段测序序列比对图，由结果可知，通过转录组测序获得金线莲CHS基因开放阅读框序列与实验验证扩增该基因序列的核苷酸序列完全相同1173bp，通过该方法获取目的基因全序列的方法准确性高。
(3)通过NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)获取其他兰科植物的FPS基因序列，与获得的金线莲Unigene序列进行比对，得到金线莲FPS基因序列，并以此为模板，设计引物5'-ATGGAGGAAGGGGACAGGA-3'/5'-CTACTTTTGCCTTTTATAAATCTTATGA-3'扩增得到1000bp左右的目的片段(如图5)。图5为金线莲FPS基因开放阅读框的扩增片段电泳图，图中M表示marker，1表示金线莲FPS基因扩增条带。通过测序，比对扩增片段与转录组同源比对Unigene序列的相似性(如图6)，图6为获得的金线莲FPS Unigene与扩增片段测序序列比对图，由结果可知，通过转录组测序获得金线莲FPS基因开放阅读框序列与实验验证扩增该基因序列的核苷酸序列完全相同1047bp，通过该方法获取目的基因全序列的方法准确性高。
本发明利用Illumina测序平台，PE150测序策略，构建普通转录组转录组文库进行建库测序，对原始数据进行去除接头污染序列及低质量reads的处理，denovo序列组装后，通过Unigenes功能注释，同源比对获取目的基因序列信息，再通过序列信息扩增片段。通过本方法可避免需要合成如应用RACE技术时使用到的RNA末端的特殊引物。本发明使用信息学的方法拼接得到目的基因序列全长，两个引物都是基于基因已知片段设计，方法简单，提高扩展效率，保证扩增序列的准确性，有助于推动未知序列扩增技术的发展。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明要求保护的范围进行限制，基于本发明的实施例，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种基于转录组测序的扩增基因全序列的方法，其特征在于，利用转录组建库、测序、拼接、注释后，获得转录组序列信息，再通过相关物种基因的同源比对，获取所需的基因序列，以获取的基因序列为模板来设计引物，扩增目的基因条带。
2.根据权利要求1所述的基于转录组测序的扩增基因全序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，用Trizol试剂或者RNAiso Plus试剂提取金线莲总RNA；
S2，以提取的金线莲总RNA为模板，以oligo(dT)18为逆转录引物，合成cDNA第一链；
S3，以cDNA第一链为模板，用cDNA第二链合成试剂盒合成cDNA第二链；
S4，对得到的cDNA第二链样品，建立cDNA文库，再进行总RNA测序，对测序数据过滤、组装和去冗余后获得金线莲Unigene序列，对金线莲Unigene序列进行功能注释；
S5，获取除金线莲外的其他兰科植物的基因序列，与获得的金线莲Unigene序列进行比对，获取与所述其他兰科植物的基因序列相同功能的金线莲的基因序列，以所述金线莲的基因序列为模板，设计引物并扩增得到目的基因。
3.根据权利要求2所述的基于转录组测序的扩增基因全序列的方法，其特征在于，步骤S1具体包括：
(1)取金线莲植株，加液氮快速研磨成粉状，取50～150mg装入离心管，加入0.5～1.5mLRNAiso Plus，摇晃离心管使金线莲粉状样品与RNAiso Plus充分混匀后，静置5～15min；
(2)以10000～14000g的离心力，2～6℃条件下，离心5～15min，取离心后离心管中的上清液300～900μL，放置于新的离心管中；
(3)向放置上清液的试管中加入50～250μL氯仿，摇晃混匀，静置5～15min；
(4)以10000～14000g离心力、2～6℃条件下，离心10～20min；
(5)将上清液200～400μL转移至新的离心管中，加入200～400μL异丙醇混匀，静置5～15min；
(6)10000～14000g的离心力、2～6℃条件下，离心5～15min，吸弃离心管中的上清液，先后加入500～1000μL无水乙醇和100～400μL RNase-free水，混匀以洗涤RNA；以10000～14000g离心力、2～6℃条件下，离心10～20min，吸弃去上清液；
(7)重复步骤(6)；
(8)吸弃去上清的离心管于室温中干燥5～30min，向干燥的离心管中加入20～40μL的RNase-free水，以溶解RNA；
(9)RNA溶解后，测定260和280nm吸光值，计算总RNA浓度和OD260/OD280值；并进行电泳分离，检测总RNA样品质。
4.根据权利要求2所述的基于转录组测序的扩增基因全序列的方法，其特征在于，步骤S2具体包括：
(1)取总RNA 0.5～1.5μg、dNTP Mixture0.5～1.5μL、oligo(dT)18 0.5～1.5μL和RNasefree ddH2O 1～10μL，配制逆转录混合液I于离心管中；
(2)取5×PrimeScriptTM Buffer 3～5μL、DTT(100μmol/L)0.1～0.5μL、RNaseInhibitor0.1～1μL、PrimeScriptTM Reverse Transcriptase 0.5～1.5μL和RNase freeddH2O 1～10μL，配制逆转录混合液II于另一离心管中；
(3)将逆转录混合液I在50～68℃温浴3～8min后，冰浴1～3min；
(4)瞬时离心逆转录混合液I为2～15秒使液体混合液收集到离心管底部后，加入逆转录混合液II，瞬时离心2～15秒使液体混合液收集到离心管底部后30～50℃反应30～60min；
(5)在78～85℃条件下反应3～10min，使混合液中的酶液失活，得到cDNA第一链的样品，-30℃～-10℃保存备用。
5.根据权利要求2所述的基于转录组测序的扩增基因全序列的方法，其特征在于，步骤S3具体包括：
(1)取cDNA第一链样品10～30μL，在冰浴上加入无核酸酶ddH2O 50～80μL、Reactionbuffer(10×)5～10μL、DNA polymerase I(19U/μL)1～8μL和RNase H(1U/μL)0.5～2μL；
(2)混匀，10～20℃温浴1～3h；
(3)加入2～10μL0.5 mol/L乙二胺四乙酸溶液混匀，终止反应；
(4)向终止反应的混合液加入等体积酚、氯仿和异戊醇混合液，以10000～16000g离心力，离心5～15min；
(5)吸取离心管中的上清液，转移至新的离心管中，加入相同体积的氯仿溶液，充分混匀后，以10000～16000g的离心力，离心2～10min；
(6)吸取离心管中的上清液，转移至新的离心管中，加入1/20～1/5体积的3M NaAc和2～3倍体积的预冷乙醇，充分混匀，在-30℃～-10℃中静置沉淀12h以上；
(7)以10000～16000g的离心力，在2～6℃条件下，离心40～100min，吸弃上清液体；
(8)向吸弃上清液的离心管中加入0.5～1.5mL乙醇，离心出的沉淀物质，再以10000～16000g的离心力，离心2～10min，吸弃上清液体，室温干燥得到cDNA第二链样品。
6.根据权利要求2所述的基于转录组测序的扩增基因全序列的方法，其特征在于，步骤S4具体包括：
(1)将得到的cDNA第二链样品，经过poly(A)加尾和末端修复后连接到测序接头，选择300～500bp大小的片段为模板，进行PCR扩增，建立cDNA测序文库，并在IIIumina HiSeqxten平台两端测序；
(2)使用FastQCv0.11.3软件对测序原始数据进行质量评估；
(3)用NGSQCToolkitv2.3.3软件进行质量过滤，去除接头、去除低质量和未知碱基含量超过1％的短序列；
(4)用Trinity v2.4.0软件对过滤后的短序列进行DeNovo组装，去冗余后获得非重复序列基因，获得金线莲Unigene序列；
(5)用BLAST v2.2.31+软件，将长度大于200bp的Unigene序列与SWSSPROT和KOG数据库进行同源比对，并用TransDecoderv2.0.1软件进行功能注释。
7.根据权利要求2所述的基于转录组测序的扩增基因全序列的方法，其特征在于，步骤S5具体包括：
(1)通过NCBI数据库获取除金线莲外的其他兰科植物的PAL基因序列，与获得的金线莲Unigene序列比对，得到金线莲PAL基因序列，并以金线莲PAL基因序列为模板，设计引物5'-ATGGACCATGCTAGGGAGAACG-3'/5'-CTAGCAAATAGGGAGAGGAGCTTCA-3'扩增得到目的基因片段；
(2)通过NCBI数据库获取其他兰科植物的CHS基因序列，与获得的金线莲Unigene序列进行比对，得到金线莲CHS基因序列，并以金线莲CHS基因序列为模板，设计引物5'-ATGCCGAGCCTCGAATCCA-3'/5'-TTAAAGAGGAACGCTGCGAA-3'扩增得到目的基因片段；
(3)通过NCBI数据库获取其他兰科植物的FPS基因序列，与获得的金线莲Unigene序列进行比对，得到金线莲FPS基因序列，并以金线莲FPS基因序列为模板，设计引物5'-ATGGAGGAAGGGGACAGGA-3'/5'-CTACTTTTGCCTTTTATAAATCTTATGA-3'扩增得到目的基因片段。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105002569A (zh) * 2015-07-15 2015-10-28 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 转录组文库及其构建方法
CN108342402A (zh) * 2018-03-13 2018-07-31 三明学院 一种来源于福建金线莲的焦磷酸合酶基因
CN109371045A (zh) * 2018-11-30 2019-02-22 三明学院 一种来源于福建金线莲的查尔酮酶基因及其应用
CN109486805A (zh) * 2018-12-27 2019-03-19 三明学院 一种福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶及其编码基因、重组载体、重组工程菌及应用
CN109979534A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 安诺优达基因科技(北京)有限公司 一种c位点提取方法及装置
CN110106558A (zh) * 2019-05-22 2019-08-09 山西农业大学 莲草直胸跳甲热激蛋白基因的系统筛选及克隆鉴定方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105002569A (zh) * 2015-07-15 2015-10-28 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 转录组文库及其构建方法
CN109979534A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 安诺优达基因科技(北京)有限公司 一种c位点提取方法及装置
CN108342402A (zh) * 2018-03-13 2018-07-31 三明学院 一种来源于福建金线莲的焦磷酸合酶基因
CN109371045A (zh) * 2018-11-30 2019-02-22 三明学院 一种来源于福建金线莲的查尔酮酶基因及其应用
CN109486805A (zh) * 2018-12-27 2019-03-19 三明学院 一种福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶及其编码基因、重组载体、重组工程菌及应用
CN110106558A (zh) * 2019-05-22 2019-08-09 山西农业大学 莲草直胸跳甲热激蛋白基因的系统筛选及克隆鉴定方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YANG L, 等: "Expression response of chalcone synthase gene to inducing conditions and its effect on flavonoids accumulation in two medicinal species of Anoectochilus", 《SCI REP》 *
拓昊苑: "金线莲苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）和辣椒红素合成酶基因（CCS）的克隆与功能验证", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 *
汪峻 主编: "《基因操作技术》", 31 August 2010 *
邹福贤 等: "金线莲转录组测序及其黄酮类合成相关基因分析", 《中国药科大学学报》 *
金征宇 编著: "《基因与纳米探针-医学分子成像理论与实践 中》", 30 November 2017, 天津科学技术出版社 *

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