CN110106558A - 莲草直胸跳甲热激蛋白基因的系统筛选及克隆鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种莲草直胸跳甲热激蛋白基因的系统筛选及克隆鉴定方法，属于基因工程技术领域，包括取1~3龄幼虫，蛹为2~6日龄，成虫为1日内刚羽化，将以上处理样品收集在液氮中冻存；合成mRNA的全长cDNA并筛选全长cDNA片段，构建不同大小的cDNA文库；再次PCR扩增放大筛选的全长cDNA；对全长cDNA进行末端修复；然后再进行二次筛选，获得测序文库；文库构建完成后，对文库大小进行检测，文库质量检测结果达到要求后进行上机测序，再将得到的非冗余转录本序列与NR、Swissprot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG数据库比对，获得转录本的注释信息并筛选出所有热激蛋白基因，然后对每一条热激蛋白的EST序列群进行拼接组装，进而获得最完整的基因序列，最后根据完整序列设计引物、克隆测序。

Description

莲草直胸跳甲热激蛋白基因的系统筛选及克隆鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种莲草直胸跳甲热激蛋白基因的系统筛选及克隆鉴定方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

在自然界中昆虫经常面临冷或热的温度胁迫，经过长期的进化适应，昆虫自身也发展出了多种生理和生化上的应对策略。在生物体内已经鉴定出许多种与温度耐受性相关的基因，其中热激蛋白基因可能是与温度胁迫最为密切的基因之一，它作为分子伴侣参与许多生理生化过程。热激蛋白(Heat shock proteins,HSPs)是细胞或生物体受到热激或其它应激原作用下新合成或含量增加的一类遗传上高度保守的蛋白，在生物体中普遍存在，在细胞生长、发育、分化、基因转录等功能方面发挥重要的作用。根据分子量的大小和氨基酸同源性的差异，热激蛋白可以划分为几个家族：Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40以及小分子Hsp(sHsps)。

热激蛋白基因的诱导表达对昆虫在极端温度下的适应、生存是必须的。目前，国内外关于热激蛋白的研究对象主要以原核生物、哺乳动物及高等植物为主。其中对肿瘤的研究较多且最为深入，如Hsp27、Hsp70、Hsp90已成为重要的抗癌靶标分子。昆虫体内HSPs的研究不多，仅见于果蝇、家蚕、烟粉虱、埃及伊蚊、意大利蜜蜂、赤拟谷盗、美洲斑潜蝇和南美斑潜蝇等十几种昆虫，其中果蝇的研究最为深入。

目前，莲草直胸跳甲的基因组尚未测序，有关核酸及蛋白质的序列信息也很少，在GeneBank数据库中可查询到的序列信息也只有2条热激蛋白基因序列，本发明我们将通过使用PacBio SMRT转录组测序、生物信息学、分子克隆等方法技术对莲草直胸跳甲的热激蛋白基因进行系统鉴定，本发明将为系统鉴定物种的基因提供一种方法流程，为后期揭示莲草直胸跳甲热激蛋白功能和丰富昆虫热激蛋白研究奠定基础。

并且，关于热激蛋白基因的鉴定大多通过保守序列设计引物进行PCR扩增、克隆测序，或者通过二代转录组测序信息进行克隆鉴定，但是通过以上两种方法通常无法完成全部热激蛋白基因鉴定和获取完整的基因序列。

发明内容

为解决现有技术存在的技术问题，本发明提供了一种莲草直胸跳甲热激蛋白基因的系统筛选及克隆鉴定方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为莲草直胸跳甲热激蛋白基因的系统筛选及克隆鉴定方法，按照以下步骤进行，

a、莲草直胸跳甲各虫态的样品处理与制备

所取材料为25℃标准饲养的莲草直胸跳甲各虫态，具体为：卵为24h内所产，1～3龄幼虫进行24h饥饿处理，蛹为2～6日龄，成虫为1日内刚羽化；将以上处理样品收集在液氮中冻存，用于后续试验，各虫态RNA样品的制备均使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen，Valencia，CA，USA)，然后1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA是否降解和有污染，NanoDrop ND-1000spectrophotometer(NanoDrop Technologies,Rockland,DE,USA)测定RNA样品的浓度及纯度，Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies,CA,USA)再次精确检测RNA样品的完整性，最后将各虫态的总RNA混合用于文库构建及上机测序；

b、文库构建和SMRT测序

使用SMARTer^TM PCR cDNA Synthesis Kit合成mRNA的全长cDNA；使用BluePippin筛选全长cDNA片段，构建不同大小的cDNA文库；再次PCR扩增放大筛选的全长cDNA；对全长cDNA进行末端修复；连接SMRT哑铃型接头；进行核酸外切酶消化；使用BluePippin进行二次筛选，获得测序文库；文库构建完成后，使用Qubit2.0进行准确定量，使用Agilent 2100对文库大小进行检测，文库质量检测结果达到要求后进行上机测序，使用PacBio RS II进行全长转录组测序；

c、热激蛋白基因的筛选及克隆鉴定

使用BLAST软件version 2.2.26将得到的非冗余转录本序列与NR、Swissprot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG数据库比对，获得转录本的注释信息并筛选出所有热激蛋白基因，然后对每一条热激蛋白的EST序列群使用Vector NTI软件进行拼接组装，进而获得最完整的基因序列，最后根据完整序列利用Primer3设计引物、克隆测序。

优选的，所述步骤c中，在获取热激蛋白基因时，

第一、总RNA的提取

1)将各虫态样品在液氮中充分研磨后加入到1.5ml RNase-free的EP管中，样品总量为60mg，

2)向RNase-free EP管中加入1ml Trizon，10μlβ-巯基乙醇，用移液器吹打混匀后，室温静置10min，4℃下12000g，离心10min，

3)取上清液，转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，室温静置5min，加入200μl氯仿，剧烈震动约2～3min，室温静置3min，4℃下12000g离心15min，

4)吸取上清液转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，加入200μl氯仿，剧烈震动，室温静置3min，4℃下12000g离心15min，

5)吸取上清液转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，加入-20℃预冷等体积异丙醇和50μl 3M醋酸钠，上下颠倒混匀，置于-20℃保存1h左右，

6)4℃下12000g离心10min，

7)弃上清，向沉淀中加入75％乙醇，颠倒冲洗，室温7500g离心10min，重复2～3次，

8)弃上清，置于室温干燥5min左右，待乙醇挥发完全后加入100μl RNase-free的水溶解，然后琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，核酸蛋白检测仪测定其浓度和纯度，然后-80℃保存备用；

第二、RNA的纯化

1)在微量离心管中配制下列反应液体系

2)将提取的RAN在37℃反应20～30min，

3)加入50μl RNase free water，再加入100μl苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)后混匀。

4)12000g常温离心5min后吸取上清，

5)加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混匀，

6)12000g常温离心5min后吸取上清，

7)通过上述抽提将DNase I失活，然后加入10μl 3M醋酸钠和250μl预冷的75％乙醇，充分混匀后置于-20℃保存1h，

8)12000g，4℃离心10min，弃上清，室温干燥5min，

9)加入RNase-free的水溶解，然后电泳检测基因组DNA是否去除干净，如没有完全去除可以增加DNase I的量和反应的时间直至完全去除，然后-80℃保存备用；

第三、RNA反转录

1)在微量离心管中配制下列模板RNA/Oligo(dT)混合液

2)70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2min左右，

3)离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部，

4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，

5)42℃保温1小时，

6)70℃保温15分钟后冰上急冷，然后-20℃保存备用。

优选的，所述步骤c中，在热激蛋白基因的克隆、测序时，根据理论预测筛选的27条热激蛋白基因序列，设计引物，由于序列尚未提交GenBank，所以基因名称暂以“Hsp+家族+序号”方式命名，PCR扩增后，产物割胶回收纯化后连接到T-Vector pMDTM 20，并转化至大肠杆菌DH5α感受态中，经蓝白斑筛选后的阳性克隆送上海生工测序；

其中PCR扩增使用的引物序列如下：

第一、PCR扩增

PCR扩增反应体系：

PCR扩增反应参数：

第二、PCR产物回收

1)在长波紫外灯下，用干净的刀片将所需的DNA条带切下，

2)切下的含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管中，称重，

3)加入3倍体积溶胶液DD，

4)56℃水浴放置10分钟，每2～3分钟漩涡震荡一次，

5)上述溶液中加入到吸附柱EC管中，吸附柱放入收集管中，室温放置1min，12000g离心30～60s，弃离心管中的废液，

6)加入500μl漂洗液WB，12000g离心30～60s，弃离心管中的废液，

7)加入500μl漂洗液WB，12000g离心30～60s，弃离心管中的废液，

8)将吸附柱EC放回空收集管中，12000g离心2min，尽量除去漂洗液，

9)取出吸附柱EC，放入到一个干净的离心管中，在吸附膜中间部位加入50μl洗脱液冲洗EB，65℃水浴5min，室温放置2min，12000g离心1min；

第三、转化

在微量离心管中配制如下反应液，

2)向以上的DNA溶液中加入等体积(5μl)Solution I，充分混匀，

3)16℃温育30min，

4)取10μl加入至100μl E.coli感受态细胞中，轻柔混合，然后冰中放置30min。

5)42℃水浴加热1min后，迅速转入冰中放置2min，

6)加入890μl SOC培养基，预先在37℃保温，，37℃振荡培养1h，

7)取100μl转化液涂在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上37℃过夜培养，

8)挑选白色菌落，进行菌液PCR验证，

最后向上述PCR菌液鉴定阳性的克隆加入甘油使其终浓度为15％，分装于1.5ml的离心管置于-80℃冰箱保存，剩余菌液送上海生工测序。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：本发明通过PacBio SMRT单分子实时测序技术、生物信息学分析及克隆测序对莲草直胸跳甲的热激蛋白基因进行了系统鉴定，共鉴定出27条热激蛋白基因序列，与其他方法相比序列更加全面、完整。

附图说明

图1为本发明中莲草直胸跳甲Hsp90与其它昆虫氨基酸序列的比对示意图。

图2为本发明中莲草直胸跳甲Hsp70与其它昆虫氨基酸序列的比对示意图。

图3为本发明中莲草直胸跳甲Hsp60与Hsp70的ATP结合位点示意图。

图4为本发明中莲草直胸跳甲Hsp60与其它昆虫氨基酸序列的比对示意图。

图5为本发明中莲草直胸跳甲Hsp40与其它昆虫氨基酸序列的比对示意图。

图6为本发明中莲草直胸跳甲sHsp的氨基酸序列的比对示意图。

图7为本发明中莲草直胸跳甲与其它昆虫的HSPs系统发育分析示意图。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

莲草直胸跳甲热激蛋白基因的系统筛选及克隆鉴定方法，按照以下步骤进行，

1.莲草直胸跳甲各虫态的样品处理与制备

所取材料为25℃标准饲养的莲草直胸跳甲各虫态。具体为：卵为24h内所产，1～3龄幼虫进行24h饥饿处理，蛹为2～6日龄，成虫为1日内刚羽化。将以上处理样品收集在液氮中冻存，用于后续试验。各虫态RNA样品的制备均使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA,USA)，然后1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA是否降解和有污染，NanoDrop ND-1000spectrophotometer(NanoDrop Technologies,Rockland,DE,USA)测定RNA样品的浓度及纯度，Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies,CA,USA)再次精确检测RNA样品的完整性。最后将各虫态的总RNA混合用于文库构建及上机测序。

2.文库构建和SMRT测序

测序的流程为：使用SMARTer^TM PCR cDNA Synthesis Kit合成mRNA的全长cDNA；使用BluePippin筛选全长cDNA片段，构建不同大小的cDNA文库；再次PCR扩增放大筛选的全长cDNA；对全长cDNA进行末端修复。连接SMRT哑铃型接头；进行核酸外切酶消化；使用BluePippin进行二次筛选，获得测序文库。文库构建完成后，使用Qubit2.0进行准确定量，使用Agilent 2100对文库大小进行检测，文库质量检测结果达到要求后进行上机测序。使用PacBio RS II进行全长转录组测序。

3.热激蛋白基因的筛选及克隆鉴定

使用BLAST软件(version 2.2.26)将得到的非冗余转录本序列与NR、Swissprot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG数据库比对，获得转录本的注释信息并筛选出所有热激蛋白基因。然后对每一条热激蛋白的EST序列群使用Vector NTI软件进行拼接组装，进而获得最完整的基因序列。最后根据完整序列利用Primer3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计引物、克隆测序。具体步骤如下：

3.1总RNA的提取

1)将各虫态样品(约60mg)，液氮中充分研磨后加入到1.5ml RNase-free的EP管中。

2)向RNase-free EP管中加入1ml Trizon，10μlβ-巯基乙醇，用移液器吹打混匀后，室温静置10min，4℃下12000g，离心10min。

3)取上清液，转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，室温静置5min，加入200μl氯仿，剧烈震动约2～3min，室温静置3min，4℃下12000g离心15min。

4)吸取上清液转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，加入200μl氯仿，剧烈震动，室温静置3min，4℃下12000g离心15min。

5)吸取上清液转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，加入-20℃预冷等体积(500μl)异丙醇(isopropanol)和50μl 3M醋酸钠，上下颠倒混匀，置于-20℃保存1h左右。

6)4℃下12000g离心10min。

7)弃上清，向沉淀中加入75％乙醇，颠倒冲洗，室温7500g离心10min。(重复2～3次)。

8)弃上清，置于室温干燥5min左右，待乙醇挥发完全后加入100μl RNase-free的水溶解，然后琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，核酸蛋白检测仪(Biophotometer plus，Eppendorf)测定其浓度和纯度，然后-80℃保存备用。

3.2RNA的纯化

1)在微量离心管中配制下列反应液体系

2)37℃反应20～30min。

3)加入50μl RNase free water，再加入100μl苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)后混匀。

4)12000g常温离心5min后吸取上清。

5)加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混匀。

6)12000g常温离心5min后吸取上清。

7)通过上述抽提将DNase I失活，然后加入10μl 3M醋酸钠和250μl预冷的75％乙醇，充分混匀后置于-20℃保存1h。

8)12000g，4℃离心10min，弃上清，室温干燥5min。

9)加入RNase-free的水溶解，然后电泳检测基因组DNA是否去除干净，如没有完全去除可以增加DNase I的量和反应的时间直至完全去除，然后-80℃保存备用。

3.3RNA反转录

1)在微量离心管中配制下列模板RNA/Oligo(dT)混合液

2)70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2min左右。

3)离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。

4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

5)42℃保温1小时。

6)70℃保温15分钟后冰上急冷，然后-20℃保存备用。

3.4热激蛋白基因的克隆、测序

根据理论预测筛选的27条热激蛋白基因序列，设计引物(表1)。由于序列尚未提交GenBank，所以基因名称暂以“Hsp+家族+序号”方式命名。PCR扩增后，产物割胶回收纯化后连接到T-Vector pMDTM 20，并转化至大肠杆菌DH5α感受态中。经蓝白斑筛选后的阳性克隆送上海生工测序。

表1 PCR扩增使用的引物序列

Table1 Primer sequences used in the PCR

(1)PCR扩增

PCR扩增反应体系：

PCR扩增反应参数：

(二)PCR产物回收(博迈德)

1)在长波紫外灯下，用干净的刀片将所需的DNA条带切下。

2)切下的含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管中，称重。

3)加入3倍体积溶胶液DD。

4)56℃水浴放置10分钟，每2～3分钟漩涡震荡一次。

5)上述溶液中加入到吸附柱EC管中(吸附柱放入收集管中)，室温放置1min，12000g离心30～60s，弃离心管中的废液。

6)加入500μl漂洗液WB，12000g离心30～60s，弃离心管中的废液。

7)加入500μl漂洗液WB，12000g离心30～60s，弃离心管中的废液。

8)将吸附柱EC放回空收集管中，12000g离心2min，尽量除去漂洗液，。

9)取出吸附柱EC，放入到一个干净的离心管中，在吸附膜中间部位加入50μl洗脱液冲洗EB(65℃水浴5min)，室温放置2min，12000g离心1min。

(三)转化

1)在微量离心管中配制如下反应液。

2)向以上的DNA溶液中加入等体积(5μl)Solution I，充分混匀。

3)16℃温育30min。

4)取10μl加入至100μl E.coli感受态细胞中，轻柔混合，然后冰中放置30min。

5)42℃水浴加热1min后，迅速转入冰中放置2min。

6)加入890μl SOC培养基(预先在37℃保温)，37℃振荡培养1h。

7)取100μl转化液涂在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上37℃过夜培养。

8)挑选白色菌落，进行菌液PCR验证。

最后向上述PCR菌液鉴定阳性的克隆加入甘油使其终浓度为15％，分装于1.5ml的离心管置于-80℃冰箱保存。剩余菌液送上海生工测序。

3.5序列特征与进化分析

测序所得核酸序列利用NCBI的ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)预测HSP基因的开放阅读框。翻译后的氨基酸序列通过Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)、SMATR(http://smart.embl-heidelberg.de/)、Scanprosite(http://www.expasy.ch/tools/scnpsite.html)、InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)及NCBI的CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)数据库对编码蛋白质序列的保守结构域进行分析。使用ExPASy的ProtParam在线程序(http://web.expasy.org/protparam/)对Hsps蛋白序列进行理化性质预测分析。使用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)对Hsps蛋白序列进行亲水和疏水性预测分析。蛋白的二级结构预测采用在线程序SOMPA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_sopma.html)。蛋白质在细胞内的定位采用在线程序BaCeILo(http://gpcr.biocomp.unibo.it/bacello/)。利用MEGA 5.0的邻接法(Neighbor Joining，NJ)和最大似然法(Maximum Likehood，ML)构建重复1000次Bootstrap验证的系统进化树。

莲草直胸跳甲Hsp90基因的完整开放阅读框长度为2148bp，编码715个氨基酸，分子量为81941。通过与其它昆虫的氨基酸序列相似性搜索发现，莲草直胸跳甲与马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、异色瓢虫(Harmonia axyridis)、美洲斑潜蝇(Liriomyzasativae)和黄粉虫(Tenebrio molitor)等昆虫具有很高的相似性(84～91﹪)。该序列N端的第33-187位氨基酸具有Hsp90典型的ATPase功能域。保守的motif分析发现，该序列具有Hsp90家族5个典型的家族特征基序(motif)：NKEIFLRELISNSSDALDKI、LGTIAKSG、IGQFGVGFYSAYLVAD、IKLYVRRVFI和GVVDSEDLPLNISRE，另外C末端“MEEVD”是细胞质Hsp90的典型特征，如图1所示。

莲草直胸跳甲Hsp70家族与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、异色瓢虫(H.axyridis)、马铃薯甲虫(L.decemlineata)等昆虫具有很高的相似性。保守结构域分析表明，所有的Hsp70在N端均具有典型的ATPase功能域。保守的motif分析发现，6条Hsp70序列具有其3个典型的家族特征基序(motif)：IDLGTTYS、DLGGGTFD和VLVGGSTRIP，还有一个非细胞器保守基序RARFEEL，如图2所示。Hsp70-2、Hsp70-4、Hsp70-6的C末端含有定位细胞质的“EEVD”典型基序，Hsp70-3含有定位内质网的“KDEL”典型基序，然而Hsp70-1的C末端基序为“DEVD”，但理论预测其定位于细胞质中，Hsp70-5未发现上述类似基序，理论预测也定位于细胞质中。在Hsp70-6的“EEVD”motif上游发现了一个(GGMP)_n motif，但在其它Hsp70家族中未发现，该基序重复数目不等功能还未知，但在有些昆虫中存在(Huang&Kang,2007)。另外还发现6条Hsp70序列含有“AE/D/SA/TY/E/FLG”ATP结合位点，如图3所示。

莲草直胸跳甲Hsp60与其它昆虫如马铃薯甲虫(L.decemlineata)、山松甲虫(Dendroctonus ponderosae)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、稻象甲(Lissorhoptrusoryzophilus)、碟蛹金小蜂(Pteromalus puparum)等昆虫Hsp60的氨基酸相似性都在80﹪以上。莲草直胸跳甲Hsp60的C-末端具有线粒体Hsp60的特征序列(GGM)_n，表明该热激蛋白可能是线粒体(MT)Hsp60，定位于线粒体中发挥作用，如图4所示。另外在莲草直胸跳甲与比对昆虫的氨基酸序列均发现一个非常保守的ATP结合位点“DGVTVAK”，如图3所示。

莲草直胸跳甲Hsp40家族与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、山松甲虫(Dendroctonus ponderosae)、小火蚁(Wasmannia auropunctata)等昆虫的氨基酸比对中发现在N-端存在高度保守的J-domain，如图5所示。Hsp40的J-domain会与Hsp70的C-末端“EEVD”相互作用，激活Hsp70的N-端的ATP酶活性。从图1可以发现Hsp90的C-末端也存在“EEVD”motif，因此Hsp40的J-domain也可能与Hsp90的“EEVD”互作，从而激活Hsp90的ATP酶活性。还发现5条Hsp40氨基酸序列在J-domain结构中均含有非常保守的“HPD”三肽，该小肽不仅是Hsp40的重要特征序列，也是Hsp40发挥功能作用必不可少的功能序列。

小分子热激蛋白(sHsps)是所有HSPs家族中序列保守性最差、结构和功能变异最大的一类热激蛋白，通常将其C末端相对保守的α晶体状结构域(α-crystallins domain,ACD)作为家族进化保守的标志。由于其序列保守性较差，所以使用了Promals3D进行了氨基酸序列的比对，Promals3D是一个使用蛋白质结构来指导氨基酸比对的程序。图6为莲草直胸跳甲14个sHsps比对的结果。通过相关软件与不同物种中已经确定结构的sHsps分析莲草直胸跳甲sHsps的结构，莲草直胸跳甲C端含有典型的由8个β-折叠组成的ACD结构域，8个从N端至C端分别命名为β2-β9，并且在C-末端延伸区发现“I/V-P-I/V”的保守motif，该motif的功能是帮助sHsps完成大寡聚体的装配。

HSPs是生物体普遍存在且在功能上较为保守的一类生物分子，近年来已被广泛应用于分子进化与分子系统学的研究中。目前，越来越多的昆虫热激蛋白家族成员被不断鉴定出来，我们将赤拟谷盗T.castaneum、家蚕B.mori、马铃薯甲虫L.decemlineata、大红斑蝶Danaus plexippus、山松甲虫D.ponderosae等多种昆虫纲的HSPs进行多序列比对后，采用最大邻接法(Neighbor-Joining，NJ)，重复1000次，构建Bootstrap验证的系统进化树，图中圆点为莲草直胸跳甲的HSPs，结果表明，如图7所示所有热激蛋白家族都能各自聚类，同时也进一步表明我们前面对热激蛋白的鉴定和分类是正确的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包在本发明范围内。

序列表

<110> 山西农业大学

<120> 莲草直胸跳甲热激蛋白基因的系统筛选及克隆鉴定方法

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2485

<212> DNA

<213> Hsp90

<400> 1

atttcgacta gaatgttcga gaggattcta aatcgcagta gggtataaaa gtcactgtct 60

gtagcggttt ccgtcagaat tacgtcaact gcgaaagcgt gttctactgg ggagtgatat 120

tccaaagtga ttttataaag agtttttaca aattataact caagatgcct gaagatacac 180

aaaacggaga tgtcgagacc ttcgcctttc aggctgaaat cgcccagctg atgagtctga 240

ttatcaatac attctactct aacaaagaaa tctttcttag agaattgatc tcaaactcct 300

cagatgcttt ggataagatc cgctatcaat cgctcacaaa tcctgcttgt ctagactctg 360

gaagagaatt ggaaatcaag cttgttccaa acaggaatga cggcacctta actatctttg 420

atagtggagt cggtatgacc aaagctgatc tagtgaacaa cttgggtacc attgccaagt 480

ctggaactaa ggcattcatg gaagcccttc aagctggagc tgatatcagt atgattggtc 540

agtttggtgt tggtttctat tccgcatact tagttgctga tagagtagtc gttgtatcaa 600

agcacaatga tgatgagcaa tacatctggg aatcatctgc aggaggtagt tttaccattc 660

gccctgacca tggggaacca ttgggtcgtg gtactaagat cattttacac attaaagaag 720

atcagactga attcttagaa gaaaacaaaa ttaaagagat tgttaagaaa cattctcaat 780

ttattggcta cccaatcaaa ttattagttg agaaggaaag ggaaaaggag ttaagtgatg 840

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aggaattaaa caaatccatt aaccctgacg aagccgttgc ttatggtgcc gccgtccagg 1320

ctgccatttt gcacggtgac aagtctgagg aagtacaaga tctgcttctg cttgatgtca 1380

ctcccttatc acttggtatt gaaactgccg gtggtgtcat gactgccctt ataaagagaa 1440

acacaaccat tccaaccaaa caaactcaga ccttcaccac ctactctgac aaccaacctg 1500

gtgtgctcat ccaagtgtac gaaggtgaac gtgcaatgac caaggacaac aaccttttgg 1560

gtaaattcga actcactggt atcccaccag cacctcgtgg cgtgccccaa atcgaagtca 1620

ccttcgatat tgacgccaac ggtatcttaa acgttaccgc catcgagaag tccaccaaca 1680

aggagaacaa gatcaccatt actaacgata agggacgtct tagcaaggaa gatattgaaa 1740

gaatggttaa cgatgctgag aagtacagga atgaagatga gaagcagaag caaaccatct 1800

ctgctaagaa tcttttggaa agctattgtt tcaacatcaa gagcaccatg gaggacgaga 1860

aaatcaagga taagatctca gagagcgata agaacacggt catggagaaa tgcaatgagg 1920

tcatcgcttg gttagatgct aaccagttgg cagagaagga agaatatgaa cacaaacaga 1980

aagaattgga gaacatatgc aatccaataa ttaccaagtt gtatcaagga gctggtggtg 2040

ccccaggtgg tatgccagga ttccccggtg gagcacccac cccaggagca ggtggagctg 2100

ccgcacctgg tggtgctgga ccaaccatcg aagaagttga ttaaggtgtt tagttttgtt 2160

tactcattcc gaatattttg ttggtttcat caagatgtat tgtttaattt ttttgccagt 2220

attacttgca gacatagctt ttttaattgt acttttttta caatcgtttc gattcaatgt 2280

ttaaattact acagttgtaa cttcaaaaaa taaaaaagtc aaatccaaaa aaaaaaa 2337

<210> 8

<211> 2313

<212> DNA

<213> Hsp60

<400> 8

gttctagaac atttcatatc tcgattccaa aggtcggatc gtgcgtaacg taggaccggt 60

tcattttcaa gaattttttg taaaagagtt tgataaatta ataattaaga tgtatcgttt 120

accaacaagt gtacgcacat tagctctacg aaaagctcac caggtccaaa ggtggtatgc 180

aaaagatgtt agatttggct ctgaagtaag ggccctcatg cttcaaggcg ttgacgtctt 240

ggcagatgca gtggcagtta caatgggccc aaagggccga aatgtgatca tcgaacaatc 300

ttggggttca ccaaaaatca ctaaagatgg tgtaactgta gccaaaggcg tagagcttaa 360

agataaattc caaaatattg gagccagatt ggtacaggat gtggctaaca acaccaatga 420

agaagctgga gatggtacca ctacagctac agtcttggca cgttcaattg ctaaagaagg 480

atttgataat ctagggaaag gcgcaaaccc agtagaaatt cgcaaaggta ttattatggc 540

cgttgaaaaa attacacaaa ctcttaaaac tctttccaaa cctgtgacaa cccctgaaga 600

gatctgtcaa gtagccacaa tatccgcaaa cggagataaa tctgtgggca acttaattgc 660

ggatgctatg aaaagagttg gcaaagaggg tgttatcact gttaaagacg gaaagacctt 720

aaatgatgag cttgaaatca ttgagggcat gaaatttgac aggggataca tctcaccata 780

ttttgtaaat accactaaag gagcaaaggt tgaataccaa gacgctctta tcctgctaag 840

tgaaaaaaaa atatcgtcag tccaaagcat tgtacctatt ttggaattgg caaatgcgca 900

aagaaaaccc ctgatcatta ttgcagaaga tgttgacgga gaagctttga ccaccttagt 960

tgtgaacaga cttcgaattg gcctccaaat agctgcagtg aaagccccag gttttggcga 1020

caaccgaaaa gcaacacttc aggatattgc tattgccact ggcggtatcg tattcggcga 1080

tgacgctaat attgtcaaat tggaagatgt gaaactttcc gactttggac aaatcggcga 1140

aattgtaatt accaaagatg atactcttct tcttaaaggt aaaggaaaga aagatgatat 1200

tgacaggcgt gctgagcaaa tccgggacca aatccaagac accacttctg aatatgagaa 1260

agaaaaattg caagaacgtc tagctagatt ggcatctgga gtagctgtat tgaaagttgg 1320

tggcagcagt gaggttgaag tcaacgaaaa aaaagacaga gtaactgatg ccttaaatgc 1380

taccagggca gctattgaag agggcattgt acccggaggt ggtactgctt tgttgagatg 1440

cagtgacagt ctagattctg tgaaagcaga aaataatgac caaaatgttg gtattcaaat 1500

tgtgaaaaga gctcttaaag tgccatgtat gacaattgcc agcaatgctg gagtagatgg 1560

ggccaccgtt gttgctaaaa tagaacaaaa agatggtgat tatgggtacg atgccctcaa 1620

taacgaatac gtcaacatgt ttgaaagagg tatcatagat ccaaccaagg ttgtaaggac 1680

agctattgta gatgcgtctg gtgtagcctc acttctcaca acagcagaag ccgtcatcac 1740

agaaatacct aaagaagaac ccgcaattcc agccagcatg ggcggaatgg gtggtatggg 1800

aggcatgggt ggaatgatgt aaacttctct gcgcttcgca acagactgaa gagcaattgt 1860

acccgtaggc ttgccactgt aaattataaa tttcagctta gcagcttcta aaataccgtc 1920

aataattttt actgcctttg aaaattactg gtgatcgcct acgtttataa attgctgttt 1980

atcttaaatt gagtgatgca aatctgtcaa aaaaattcca ttttcgtctt tgacagagaa 2040

actttttgtg ttttgttatt aagttctcaa taaatccatt cgtgtatagt ttctattata 2100

ttgcgacacg aattaaaatt ttgtgtgaat aagaagttta aatttttcgt ataagtgcca 2160

aagaaagttt ctcagctaat gggagccagg gcatatgctg aaaaacttat tttgctcact 2220

gaactgatct gcatttagct ccaggtgaat agtctttaaa tgaatctgaa gagatggtat 2280

attgttgtaa atatattgtt atttttaaaa aaa 2313

<210> 9

<211> 1931

<212> DNA

<213> Hsp40-1

<400> 9

ggtgcgtgtt ggtacttaat gataataata tattaatgat ttttgttatt attagtcata 60

aatagaataa tttttaaaaa ttgatcatct tatattttag tttatcgtgc ccaatcatta 120

gttcacgtgt gtagttgcaa ataaaatgaa gatttaggac gaaaagtttt ggcctagtcg 180

ttatcttttc caaaccattt caaaataatt tttagatatt tattcaaaac ctggggtata 240

gaacacactt ggcaccacca tggtggacta ttacagagtc ctcgaggtgt caaagacagc 300

ttccacagct gaaataaaaa aagcttaccg aaaactagca ttaaaatggc atcctgacaa 360

aaaccccgac aacctggaag atgcaaccaa gaaatttaaa gagatttctg ctgcctatga 420

agtattatct gacgatacta aaagaaaaat ttacgatagt cgcaacaaca ggagtagttc 480

tgcaaagtcg aggtcccaca gaagccattt ctttgacggt cacaatcctt tttcgcagag 540

acattttgag aaaaagaggc gtgtatacga tcaatatggc aaagatggct taatcaacgg 600

taacagccgc acgcgttgtc gtcatgaaga tgattttgat ttgggcgact tcagcttctt 660

cagctttaga gatcctgagg atgttttcag ggatttcttt gggggttcgg tattcgattt 720

atttgaacca atggattcaa gaagaagaca cagacattca cacccgcaac aaaatgtctt 780

aagcaattca tctttgttct catttggtct actaatggat gactttttca ctggtagctc 840

acattcaagt ggatttaact cattaaatgt acatagttct gaactttttc ctagtaactc 900

aaacgttaaa agaacgtcta cgtctaccaa gtttatcaat ggaaagaaga taaccacgaa 960

gaaaatatat gaaaacggaa aggaaactgt gatgtcctac gagaacgacg ttttaaaatc 1020

aaagactgta aacggagttt ctcaaagtat aacttacagt taaatgattt catcaactat 1080

ctctttattt acttatagct taattgtagt acttacacaa ccttcattga tgtacatgtg 1140

attttaatgt aggaatactt gtaaaagctc aatgctccta ggtttgtaag caggaacttt 1200

ttttttaatt attcaagagc tgatgttgct gcataaagac caaaattctt taattacatg 1260

aatgtattat atgtcattat atttgtcgaa agggatgatg tgttttcagt ctttcaatct 1320

ttagttttaa gtaataacgg agaagcactg acgatattgg aaccgctggg ctttgctgac 1380

attcacgata aactaatgct gtaattgcaa agtttaattt tatctgctta tatttcttca 1440

atatgaatac tgctgaaggt attaactaaa atatgtataa agtaaatagt tttccagctt 1500

ttttgctttt gtcgacatgc tttacaaata tgagtttctg tatccttacg tgttatgttt 1560

ttgtagtgac tccatacctc tttcatcata cgatctcttc tgcctcgtgt cgtatgaata 1620

actcacatgc ctagtaaata atattgcatg taggtttttt agctgttgtt ttttccgtag 1680

cattaactat tcatcttcaa tataagcggt gttcttagcg tttattaaat gtatagtctt 1740

cataggaaat gtgtctaata taattcattt cacacatttc tggcggtttt aggtattcca 1800

tacaattctt aggactttta tgactgatta catacatttc tgttaatata tatttataca 1860

agcaacaata aataaaacat taattattaa ttcataagta atatttaaat attggatgaa 1920

atatagacag a 1931

<210> 10

<211> 778

<212> DNA

<213> Hsp40-2

<400> 10

ttaggaaaag acaaaattat acttttccat gaaaattaat aaaacaatat ttatttaaga 60

aactgctatg actgattatt accagatttt aaaggtttca aacaatgcta ctacagatga 120

aattaaaaaa gcctacaaaa aactcgcttt aaaatggcat ccagataaga acctgaacaa 180

caaagaggaa gccactaaaa ggtttcgtga aatttcagaa gcatatgaaa ttctttcaga 240

cagcaccaag agaagaagtt atgacaccta tgggactgca gacccacagg cgcacgcttc 300

gtttgatcaa gaagactttt tcggttttgg agcagctttt catttcaatt ttagagaccc 360

agaagaagtt tttagagagt ttttcggcag cagcgtgttc gatttttttg ccgaagattt 420

tccaacgcca catgcgggtc atagaggtca tagaaacagg tacagtagac gtactggaaa 480

tcgccgacgt aacgaggtct ccattttttc accgctaggt gccggatttt ttgaaggatt 540

tttctcctct ccaagggaga tgcatagctc cttcagtgtt cataacaatg ctcctacaag 600

ttcatatgca aggaaggtgt caacttctac aaaagtgatg aatggaaaaa aaattacaac 660

gaaacgaatc gtcgaaaacg gacaagaaac tgtcatgaat tttgaaaatg acgtcctaaa 720

atcgaaaaca gttaatggag tcccccaatc tattgagtat cattaaagaa aacgggcg 778

<210> 11

<211> 1287

<212> DNA

<213> Hsp40-3

<400> 11

aagaataaat catggttacg ttaaatattt gacaattatc ggtgaacaat tgacacagtt 60

gagtggttgt ggtttttatg tttaaaacgt ggcggttcat ttgttacttc taaatagtta 120

tcgtaaaata tgttaactta ttttaatact atcgtttgct taattttaat aacagaagct 180

tcagttaacg cacaattgtt ggaaggacta tattgtggta aagaaaattg ctatgatgta 240

ttagaagtaa caagagaatc cactaaacat gaaatcgcta aaaactacag aaagcttgct 300

agacaatacc acccagatct ccatagaact ctagaagcta agaaaactgc tgaggaacga 360

tttaaagtaa tagctactgc ttatgaaatt ttaaaagatg aagaagcacg agctgattat 420

gattatatgt tagacaatcc agatgaatat tatgctcact attatcgata ttatagaaga 480

agagtagcac ctaaagttga tgtaagactc gttcttattg ttactatttc tataatctca 540

gcaatacaat actatagtgg atggcagaga tatgatagtg ctatcaagta cttcatgaca 600

gtgccaaaat atagaaataa agctttagaa attgcaagag atgatggctt gttagttgaa 660

gacaaaaaat ttaagaaaaa caaaaaagaa ctgaaagaag agactgaaca agttataaga 720

aaagtaatag aagataaaat ggacataaaa ggggcatacg caaagcccag tgttactgat 780

attttatgga ttcagctcat tatattacca tatactgtat gtaaatatat ttattggtat 840

gtgtcttggt tttggaaaca tacaatttta aaacagccat ataatgaaga agaaaaattc 900

tatatcatcc ggaaatacat gaaaatgaat gagcatcaat ttaaaagcca agatgactat 960

aaacttgaag aatttttaaa acaggaatta tggattaggg aaaattttga tgaatggttt 1020

aaattagaag aggaaaaagc taaaaagcaa ctagcagaga gcaataaata caaacaatac 1080

cgaaggtata ttaaaaatca tggtatagga agaatgacct ttgatgattc ataatatgtt 1140

atatcaattt aggagactta cgtgatcatt tggtaatttt atttatttta aagtattgtt 1200

tactttgtca atgttttata tgaagaatac ttttgttaac tgtttaacta aattgttctc 1260

cgattaaaat aattaaactt tgagcag 1287

<210> 12

<211> 698

<212> DNA

<213> Hsp40-4

<400> 12

gtcatttcca acatattttg atattttacc tgaaacctgt caatcaatta attgtgaaaa 60

gcattaccct catggggaga gactattacc agatattggg tattagaaaa aatgctacag 120

acgatgaaat taagaaggcc tacagaaaac tcgccttact gtaccacccc gataaaaaca 180

agacaccaga agctgaagag aagttcaaag cagtagctga ggcctatgaa gtcctttcag 240

ataaaaagaa gcgagatata tacgacgctc acggtgagga aggtcttaag tgtggagtcc 300

ctaacggtgc tgggtacgat gggcctagct acacatatac ctttcatggt gacccaagag 360

caacttttgc tcagtttttc ggtaacatcg atccatttca agatttcttt ggttttcatg 420

atcattttca aaggggcgga gtgggtccac atcattatca cagtgaccct tttgggcagt 480

ttgcttatta tggaggacaa aaccatctgc aagcacagca acaagatcct cccatagaac 540

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<210> 13

<211> 1396

<212> DNA

<213> Hsp40-5

<400> 13

aagaattttc attggtgtgt aaattgatag tttcttcgcg ttaagctgac attcgtagta 60

gaaaatgtgg tgttggtcat aaatttgctg ccactttaaa aacaaaactg tgataaaatg 120

tactaatctt aatatttccg tagaattata gtgttaaata actctttcgc catgaacata 180

atagttttac agacgttctt actgctgatt atccagttca ctgctattgt tttagcagga 240

agagacttct atagaatttt aggtgtatca aagtctgcaa gtttacatga agtcaaaaaa 300

gcctacagga aattagccaa agaactgcat ccagataaaa atcagggtga tccagaagca 360

gcacagaaat tccaagattt gggagcagct tatgaagtac tttctgacga agaaaagcga 420

aagaaatatg atagatgtgg ggaagattgt cttcaaaaag atggtatgat ggacggaggt 480

atggacccct ttgctagctt cttcggagac tttggctttc attttggtgg tggtgaacaa 540

aaacatgaaa cacctagagg agctgattta gtcatggata tatttgtcac attagaagat 600

ttatatactg ggacattcat cgaaattact cggaataaac cagtattaaa acctactagg 660

ggtacaagaa agtgtaattg caggcaagag atgattacaa aaagtctagg acctggaaga 720

ttccaaatga tgcagcaaac tgtatgtgac gaatgtccta atgttaaact tgttaatgaa 780

gagagattgt tggaaatgga agttgaacag ggcatggtag atggacaaga aactaagttt 840

gtagccgaag gcgaaccaca tttggatggt gatccaggag atttaatttt aaaaataaaa 900

acacaaccac ataagtattt tgaaaggcga ggggatgatt tatacacaaa tgtcacaata 960

agtttacagg atgctttgac tggtttcaca atggagatac cgcatttaga tggacacaga 1020

gtcagtatag ttagagataa aataacctgg cctggagctc gtatcagaaa gaagggtgaa 1080

ggtatgccaa actatgacaa caacaactta catggtattc tgtatattac ctttgatgtt 1140

gaatttccca aacaagagtt cactgaagaa gaaagagaag gtatcaaaaa aatactaaat 1200

cagaactcaa ttaacaaggt atataatgga ctacgaggat attaagtgtc gtatgaatag 1260

aaatagttct acaatttttt tgtaaaaact gttcattctt agttcaatta tttattttgt 1320

tcctatttat tattacacca tttttgtaca taaacaaccg atttctaaat atatgtgtac 1380

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<210> 14

<211> 636

<212> DNA

<213> sHsp-1

<400> 14

caggcaagct gtgccggtga gtgaagttga agtttgattt gactactgtg aattgtgcgc 60

gttttaaata aagtgaagga aagataaata cataatttaa aatggctttg ttcagacatt 120

tattagatga tccctattgc attcgaccat caagaatgtt taatcatcgt tttggcgatc 180

tacttgaaga tgaggacttc gttttaccct tacttgctag gaagatgcgt ttacaaagac 240

cagcaaaata tattcgtcat aagacacctc tgtctctgaa aaagaactct gattccacat 300

tggaatacgg aaaagataga tttaatgcca atatagacgt ccaacatttc catcctgaag 360

agattacagt taaagttaca aatgacaatg ttataacgat tgaaggtaaa cacgaagaaa 420

aagaagatga acatggagaa atttatagac actttgttag aacaattaca gttccaaaac 480

aatatgatat gagtaaaatc gaatccaaat tatccacaga tggtgtgctg tcagtcacag 540

ctcccagaaa cggagctacc caaacataca aaaacattcc aattacccaa actggagaac 600

cagctaaatc ggttgagaag aaagaagaag gggaag 636

<210> 15

<211> 775

<212> DNA

<213> sHsp-2

<400> 15

ttttacaaat ggcaaatgtt cactcatcta tttataaaac atttaaatca tagcaatcga 60

gtttgtttgt agtcaagtaa acaacgggca ttcgaaaaaa taattttgct gtgtcaataa 120

agatagtcca gcttaaatta accgaaaatg tcccttttac cgtatctatt ggatgatgcc 180

cctttcattc ggccatcaag gctattagac caacacttcg gcatgatgct agatccagaa 240

gacatgtttc aaccaacggt aaacttccca agactatttt tgcgcagccc tacaggatat 300

atgcgtaatt ggaaatcaac agcgtctcag agagacaccg gttctacagt tgattttggt 360

aaggaccagt ttgttgctaa tctggatgtt cagcagttca aaccagaaga gattactgta 420

aaaaccacag gtgataatac tgttacgatt gaaggtaaac atgaagaaag agaggatgaa 480

catggacaaa tatacagaca ttttatgaga acctataagt tgccaaagca atacgatatg 540

accaaaattg agtcaaaact gtctacagat ggagtgctgt cgattgttgc accaagaatt 600

gatgcggagc acattcaata taaagatatc cccgttatac agactggggc accggctaaa 660

aaggctgttg agaagacagg agatggcgac aaaaactagt gcttttttgt caaattccat 720

cacaattttg gtaatttttg tccaatattt tttgtataat atgttttaat ggtgc 775

<210> 16

<211> 773

<212> DNA

<213> sHsp-3

<400> 16

cgccggcaaa caactgatta aagtcaacga aagtgcaagc gcgatacttg tcaaacgaag 60

tgttatcgag tattttacct gaaaaaatgt ctctcatccc atttttattc gacgattctc 120

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gaattgaatc caagttgtct tctgatggtg tattgtcaat ttctgctcct aaaattgatg 540

ccgatcaaat acaacacaaa tctattccca ttacgcagac tggtgaaccg gcgaaaagag 600

ctgagatcaa aggggaagtt gaaaagaaag gagaaggcga aaagtaatta ttttgtattt 660

ttgtgtatta ttttgtagta ttttcgtatt tacgttaact gcatttattt gagactgagt 720

tataccaata tcataatgtg ttcacattaa tgtaaattgt gtgtccaata aat 773

<210> 17

<211> 652

<212> DNA

<213> sHsp-4

<400> 17

gtcaatttag ttctgttctt gacacaagta taatattaat aaagtaaagt gttattttaa 60

aagttgtaaa agaggataca taaaaaatgt ctctcattcc atttttgctc gacgattcct 120

attttctgcg accatccagg attttggatc aacattttgg cgatatcttg aatgcagacg 180

atttggttca accagttaac gttcccagga tgctgtttcg ttgcccagcc ggatatattc 240

gaaactggaa atctgggtct tcagctcacg atgctggctc tactgtcgat tatggtaaag 300

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gacatattta tagacatttt gtgagaagat attctctacc gaagcaatat gatgtcagta 480

agatccaatc gaaattatct tcggatggtg tattatcaat ttcggctccc agaattgatg 540

cagatcaaat tcagtataag agcataccca ttacccacac aggagagcct gccaaagttg 600

ctgagaaaaa ataattattt tcttttttat taatgctaat ttttaagact gg 652

<210> 18

<211> 709

<212> DNA

<213> sHsp-5

<400> 18

ggtgaatcta caagttgtac gtggagcgtt ataaagtaat ttttggtgat ccttaatcta 60

aaaaaatgtc gttacttcca ttaatactta gcgattccta cttcagacgc ccatccagaa 120

tcttggatca acgttttgga gatattctgg aatcagatga tttgctgcaa cccgttaatg 180

ttccgagaat gatgttgcgc tatccatctg gttacctacg aaattggaaa tctgcatctt 240

catcccgtga tgttggttca acagtagatt atggaaaaga tgaatttttg gcgagtctgg 300

atgttcaaca gtttaaacct gaagagcttt ctgtgaaact cacaggtgag aattcaatta 360

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ctgatggggt gttgtcgatt acggctccaa gaattattga agaagatcaa gtgcatttca 540

aaactattcc tataacacaa actggagaac cggctaaact agctgagaaa aaagaaggcg 600

agaagaagtc gattgaaaag aaagataaat agaaaaatac atttttttct tgtttcatat 660

attatagttt aagactgatt gatttttttt gtatctttta cttcggccg 709

<210> 19

<211> 609

<212> DNA

<213> sHsp-6

<400> 19

ttcagtcagt ttttaaaaag tcgtagacat tgtcaaatcg ggctataata ttgcacaact 60

tttcgtaaaa ttacaggata aaatgtcgca tattcctatt atttttcgag agtttcttcg 120

tcctttgaga atgatggaat atcaaatgag acaagctgaa gaactgcttc gcccctcatt 180

aaatcatttc aattttccaa gagttcggct ggagtatcct gatgaagcat ttaaagaaga 240

atctgttgta gacgacaagg ataaatttca aataaaaatg aatctgccag atttcaagcc 300

tgaagacatt gccattaaaa gcttagatgg gaatacactt caaatagaag caaagcatga 360

actcaaaaat gatgatcaaa acggttatat tctgaggcaa gtacttagaa agtttgtgtt 420

gccaaaagga catgatatta aaaatgcata ttccactttt tctcctgaag gaatacttac 480

ggttactaca cctaagaaga tgcaggaaat tgaggagaag cctattccaa ttacccatga 540

gagtacaagt caagaatcca aataatctag ttatgagttg tagttacgat ttgtttaaat 600

ttcttgaat 609

<210> 20

<211> 658

<212> DNA

<213> sHsp-7

<400> 20

gagtatatat accggggaaa atttaagtaa gccgttatta taaacaagtg aattaaacgc 60

gaagttgtca attgtggcat ttgatttaat aatctctcaa acagtattgc gtgctaatta 120

gtgctgtaaa atctgataaa atgtctcttt taccactatt gtttgacgac agatactggg 180

gagtcccaaa ccaacgccga attgtacctc accagaacta ttggagcgac atactagaac 240

cgttatctct agtaaatagc ctcatacaat cgcctgagta tacagaactc caaagccgag 300

gctccacatc cattgacaaa gacaaattcc aagcgaactt cgatgtccag catttcaaac 360

cgaatgaaat agtggttaaa gttggtgaag ataacagtgt aactattgaa gctaaacatg 420

aggaaaaaca ggacgagcat gggcatatct tcagacattt tgtcaggagg tacgtgttac 480

ctaagaattg tgacgtaagt agattggagt ccaagttgtc ttctgatggg gttctgagca 540

ttactgcccc tactatagat aataaaaata gtgaagaacg cacgattccg atttcccata 600

ctggtatgcc agcaatgaag gagcagaagc cagaatagaa gaaggaaact gtcatgag 658

<210> 21

<211> 463

<212> DNA

<213> sHsp-8

<400> 21

caaaataaaa gtcaccttaa attaaaaatt gatctttata aaaatgtctt aaaatgacat 60

gggcctggaa atcaaccaaa ttacaagtac caataaagca atgcctctct ttcatggaag 120

ataagtgttt tcacaatgca ttagccaccc tcaaagaatt cggtgtcgac tggtcagaca 180

tagccatatg caagcgaaaa gattcttcag acaaaaaaat ggacgcagta ttctttcaca 240

aagaccgatt cgaacttttg gtagacgcaa gagggttcac tccaaacaat atcaaatgca 300

aaatgacgcc cacttttatc gaaattctag gacatagggt cgaagagcct cttaatggaa 360

gtaagagcat gtctttggca cggaaatacc aattaccaca agctgtgaaa ccagaagaag 420

gcaactgctg cttttcaacg gaaggcatcc tactagtgac ggc 463

<210> 22

<211> 556

<212> DNA

<213> sHsp-9

<400> 22

tgtttactta gctgtcaaca ttatagcagt aaatctttcc ttgaatgtac ccaaaaatta 60

tagcaactaa aaaatgtcga ttttgccaga aaacaagaag gtttgtaaag aatgcggaag 120

accagccaat tctttttggg aggaaatgct gagcccttgg ccaacagata ttctgatgag 180

aaacttcttt tcacacagtc caatgccgct agacaactca atcacttacg acaataatca 240

ttttcgagcg aattttgatg tgcaacattt caaacctgaa gaaatttctg ttaaagtgat 300

acctaaaaac aatactgtta ctatcgaggc taaacatgaa gagagacgaa ataaccatgg 360

ccatatttat aggcattttg tacaaagata tactttgcct aagaactgtg atgtacagaa 420

attacagtct aggctaacat ctgatggggt tttgagcatt tgtgctccaa cggaaaatgg 480

ttgcagcgaa actgttattc cagtttgtgc aacgaaccag ccaccaaaca ttgctgctag 540

gaaaaatcat catgag 556

<210> 23

<211> 845

<212> DNA

<213> sHsp-10

<400> 23

ccgaaaacgc cgcgaattat ctggaaggag tatagctttg tatataagcg gtcttctcac 60

agagctacct cagtttgaaa ttttcgatag cgcagaaagt tgtcaatagt aattgagtga 120

taagtgattt attgtcaaag tcaagctaaa aactcagaaa aaaaatgtcg atgattccat 180

ttttgttggg tgattcctat tttaaccgcc catccagaat attggatcaa catttcgggg 240

acatccttga actacaagat ctactggagc ccgtaaatgt cccaagaatg ctattgcggt 300

atccagctgg ttatgtgcgc aactggaaat cggcatcatc ggcacgggat gttggttcaa 360

ccgtagatta tggaaaagat caatttttgg ctaacttaga tgtccaacag tttaaacctg 420

aagagatttc tgtgaagctt acaggtgacc attcaattac gatcgagggc aaacatgagg 480

aaaaagcaga cgaacatggg cttatttaca gacattttaa aagaacttac tctttaccta 540

aagagtacga tgtaagtaaa attgaatcaa aaatgtcttt agatggggta ttaacaattt 600

cggctccaag aattaatgaa gatcaaatac agtacaagac aattcccatt actcaaactg 660

gcgaaccggc taaagtagct gaaaagaaag aagagaaaaa agaaatcgag aagaaaaaag 720

aaatggaaaa gaaaaaataa gcaaagttaa aagtacctac ctatgtacta attattaaaa 780

cagtttaaga ctgaagtttg gtttttgtat tttttatttt gataaataaa ttttaagttc 840

ccgaa 845

<210> 24

<211> 1084

<212> DNA

<213> sHsp-11

<400> 24

caacgcggcg acttctctct ttatccatct cgatttcgtt gattgtgtat ggaggtgtat 60

acaagaatcg agaattgcgc aagcacctcg tcggcggcat cggttcccct cgaggacgga 120

catttctatt taaaaccatc catccctggc ggtcgcgtaa gttattcatc cgcagacttc 180

gagcgctagt aacccaagtg actttctgtc ctcttcattc gtgtgcagtg acgttcaaag 240

aaaagtgcaa ttttcatcat gtccgaaggc aacaaacgca acattcccat taaaatgggc 300

gacttcagtg ttattgacac agaattcagc agcatcagag agcgcttcga tgcagaaatg 360

cgaaaaatgg aagaggaaat gagcaaattc cgttctgaat tgatgaatag ggaatccaat 420

aatttcttta ggagcacgac aagtaccaca acacaatcca gcacaggagg tacagatgta 480

gcgccccgac ctccagcagc tgatgtcagg acatggtatg acgatttaaa ttcaccctta 540

atccaagaag atggaaataa caaatgtctc aagctgaggt ttgacgtaag ccagtacgct 600

cctgaggaaa ttgtcgttaa aaccgtagac aacaaattgt tggtgcatgc caagcacgaa 660

gaaaaaacag aatcaaaatc cgtttatagg gaatacaaca gggaattcct gttacccaaa 720

ggaaccaacc ccgaaaatat taaaagctcc ttgagcaaag atggtgttct aactgtggaa 780

gctcctctgc ctgctcttac atctggagaa aaattaatac cgatacaaca ttgatcaatc 840

attgtgtaaa ctatttttta attaaataaa aaaatcttaa caactgttta atgttcacgg 900

ggctttatca tgcaaaaatg aaattgtttc gcaaacaaaa cagaattcat tgttaataac 960

ttatttttct ggaaaaaaaa actgatatgc taattgatat tttgttaaat ttttttgaag 1020

gtctatcggt gtttaaataa ccagcaagaa attatcaccg tagtataaca aattgtatcg 1080

ttcg 1084

<210> 25

<211> 657

<212> DNA

<213> sHsp-12

<400> 25

agctggaata ctgttgcaac tgactaattt acacaatcct gtgtatatat tctccgctcc 60

acttgaacaa atccagtttt atcagtggtt cagaaagtga aactggaaga tcctattgtc 120

ggaataatat atcaagatgt cagtagtacc acttcttttc cgtgactggt gggatgaaga 180

agacctcatc cgtccatctc gccttctgga tcagcacttc ggtgtcggtc ttcgcagaga 240

tgaactcatc aactccctca gctcttggcc caggaggtca cgtttgagca actacgtcag 300

gccctggtcc accactggaa cagagcttca aagacaagac tctggatcca ctattactca 360

ggacaaagat aaatttcagg taatcttaga tgtccagcaa ttctctccaa atgaaattac 420

tgtcaaagta aacggaaaca gcatcgtcgt cgaaggtaaa cacgaagaaa aacaggatga 480

acacggtttc atcatgagac acttcgtccg aagatatgta ctcccctgta cgcacgatgt 540

caacggtgta gtatcttcat tgtcttcaga tggtgtcttg acagtaagcg cccctaaaaa 600

gaatgaatca cttccaaaca ctgaacgtgt ggtgcctata actaaaacag gccctgc 657

<210> 26

<211> 590

<212> DNA

<213> sHsp-13

<400> 26

cacaagtcca aactgttatt tttattaaaa aactatttgc ttagagaatg aacgtttttc 60

ccaccattct tcgagaattt gccaagccat taaaattaat tgagaaacac atgaaactag 120

gagatgactt ctttcgtccc aaggtgaatc tggagttcct ggacaaaaat gagtttatcc 180

aagatagaga tatggtgcaa gtaagattac ctgtaccgga atttaagcca tcggaaataa 240

ctgttaaaac tgtagatggt aatgcaattc aagttgaagc tagacaaaag gaagaaatta 300

acaacggtga ctttgtagga aaatatttta tacgcaggtt tgtagtgcca tttggcacgg 360

aattaaaaaa tgcaaaatcc agtctttccg aagatggtgt cctggttata actgctccga 420

gaaatatcaa agatttagaa gaaagaataa ttcccatagt tgctgatacc acgattgagt 480

taaagaagat ctccagtcct taatcttctt gggcgatagt tctagtgcgt tcttagtact 540

aattatttta caggtagata ctgttagata aagaaataat tatattgggc 590

<210> 27

<211> 1183

<212> DNA

<213> sHsp-14

<400> 27

attttaaatt tcaattaggt ttgaaaaata cataagtttt tgaaactaag atgccaatcc 60

cagaagaaat aaaaaaagtt tatattacag aaaacagagc cattcgtgtt taaaaatgtc 120

ttaaaatgga acatattaga ctggaaacta gataattgga aagcagcttt tcaggattgt 180

agctttgaat ttagatgtgg taagaattta ccatcgcaaa atcctcagtg ggaaagagat 240

actcaaacag taacaggtga ttttagcttt tttttacaga aagctgaaaa caaagaaaac 300

tggttatatt ttgattataa acacttaaat gcgtggttga caaatatcaa ggatctaaga 360

gagggtatag attggagccc cttgggtttc ccagaagtga aaccagagga ttgtacaatt 420

tggataggta caagtggagc tcatacgccg tgccatatgg attgttatgg ttttaattta 480

attcatcaaa tatatggcaa aaaaatgtgg ctgctatttc ccccagaaga gaatttaatg 540

cctaccagag taccatatga agagtcaagt gtatattcca gattaaattt ttttagcccc 600

aaaatagaaa attttaaagg tctcagcagt aaatgtagaa aagtggaact atctcctggt 660

gatgtgcttt ttgtgcctca taaatggtgg cactttgttg aaaatttaaa cactagcata 720

gccattaatg tctggctacc ctcagtgcat gatgataaag aaaggctaaa agaatcgata 780

gtacagtaca ctgttaaaca aattactgat ttatcaacag agaaaactaa gaaaattatt 840

ttaaacccta atatggataa gttactgtta aaaaatgatg tcacacaatt ttttaacaca 900

ataaacacgt gtaaaaggat ttgcaagcga tctccacaca aaaagcagac caatgaagac 960

agttcgatat ttaatacaaa aatagttgac ttgggcattg aagttcccgt actatcaaga 1020

gatgaattta tgaaattaat gaaccagcaa attagtagat ttggtgaaaa aaaagtacct 1080

gaagaaacac atggagacga ttttgttaaa ttagtgcgag cttttactaa tcctgaagtt 1140

ataaatttaa taacacataa tttaataagt gatcaataaa att 1183

Claims (3)

1.莲草直胸跳甲热激蛋白基因的系统筛选及克隆鉴定方法，其特征在于：按照以下步骤进行，

a、莲草直胸跳甲各虫态的样品处理与制备

所取材料为25℃标准饲养的莲草直胸跳甲各虫态，具体为：卵为24h内所产，1～3龄幼虫进行24h饥饿处理，蛹为2～6日龄，成虫为1日内刚羽化；将以上处理样品收集在液氮中冻存，用于后续试验，各虫态RNA样品的制备均使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen，Valencia,CA,USA)，然后1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA是否降解和有污染，NanoDrop ND-1000 spectrophotometer(NanoDrop Technologies,Rockland，DE，USA)测定RNA样品的浓度及纯度，Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies，CA,USA)再次精确检测RNA样品的完整性，最后将各虫态的总RNA混合用于文库构建及上机测序；

b、文库构建和SMRT测序

使用SMARTer^TMPCR cDNA Synthesis Kit合成mRNA的全长cDNA；使用BluePippin筛选全长cDNA片段，构建不同大小的cDNA文库；再次PCR扩增放大筛选的全长cDNA；对全长cDNA进行末端修复；连接SMRT哑铃型接头；进行核酸外切酶消化；使用BluePippin进行二次筛选，获得测序文库；文库构建完成后，使用Qubit2.0进行准确定量，使用Agilent 2100对文库大小进行检测，文库质量检测结果达到要求后进行上机测序，使用PacBio RS II进行全长转录组测序；

c、热激蛋白基因的筛选及克隆鉴定

使用BLAST软件version 2.2.26将得到的非冗余转录本序列与NR、Swissprot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG数据库比对，获得转录本的注释信息并筛选出所有热激蛋白基因，然后对每一条热激蛋白的EST序列群使用Vector NTI软件进行拼接组装，进而获得最完整的基因序列，最后根据完整序列利用Primer3设计引物、克隆测序。

2.根据权利要求1所述的莲草直胸跳甲热激蛋白基因的系统筛选及克隆鉴定方法，其特征在于：所述步骤c中，在获取热激蛋白基因时，

第一、总RNA的提取

1)将各虫态样品在液氮中充分研磨后加入到1.5ml RNase-free的EP管中，样品总量为60mg，

2)向RNase-free EP管中加入1ml Trizon，10μlβ-巯基乙醇，用移液器吹打混匀后，室温静置10min，4℃下12000g，离心10min，

3)取上清液，转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，室温静置5min，加入200μl氯仿，剧烈震动约2～3min，室温静置3min，4℃下12000g离心15min，

4)吸取上清液转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，加入200μl氯仿，剧烈震动，室温静置3min，4℃下12000g离心15min，

5)吸取上清液转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，加入-20℃预冷等体积异丙醇和50μl3M醋酸钠，上下颠倒混匀，置于-20℃保存1h左右，

6)4℃下12000g离心10min，

7)弃上清，向沉淀中加入75％乙醇，颠倒冲洗，室温7500g离心10min，重复2～3次，

8)弃上清，置于室温干燥5min左右，待乙醇挥发完全后加入100μl RNase-free的水溶解，然后琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，核酸蛋白检测仪测定其浓度和纯度，然后-80℃保存备用；

第二、RNA的纯化

1)在微量离心管中配制下列反应液体系

2)将提取的RAN在37℃反应20～30min，

3)加入50μlRNase free water，再加入100μl苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)后混匀，

4)12000g常温离心5min后吸取上清，

5)加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混匀，

6)12000g常温离心5min后吸取上清，

7)通过上述抽提将DNase I失活，然后加入10μl 3M醋酸钠和250μl预冷的75％乙醇，充分混匀后置于-20℃保存1h，

8)12000g，4℃离心10min，弃上清，室温干燥5min，

9)加入RNase-free的水溶解，然后电泳检测基因组DNA是否去除干净，如没有完全去除可以增加DNase I的量和反应的时间直至完全去除，然后-80℃保存备用；

第三、RNA反转录

1)在微量离心管中配制下列模板RNA/Oligo(dT)混合液

2)70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2min左右，

3)离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部，

4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，

5)42℃保温1小时，

6)70℃保温15分钟后冰上急冷，然后-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的莲草直胸跳甲热激蛋白基因的系统筛选及克隆鉴定方法，其特征在于：所述步骤c中，在热激蛋白基因的克隆、测序时，根据理论预测筛选的27条热激蛋白基因序列，设计引物，由于序列尚未提交GenBank，所以基因名称暂以“Hsp+家族+序号”方式命名，PCR扩增后，产物割胶回收纯化后连接到T-Vector pMDTM 20，并转化至大肠杆菌DH5α感受态中，经蓝白斑筛选后的阳性克隆送上海生工测序；

其中PCR扩增使用的引物序列如下：

第一、PCR扩增

PCR扩增反应体系：

PCR扩增反应参数：

第二、PCR产物回收

1)在长波紫外灯下，用干净的刀片将所需的DNA条带切下，

2)切下的含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管中，称重，

3)加入3倍体积溶胶液DD，

4)56℃水浴放置10分钟，每2～3分钟漩涡震荡一次，

5)上述溶液中加入到吸附柱EC管中，吸附柱放入收集管中，室温放置1min，12000g离心30～60s，弃离心管中的废液，

6)加入500μl漂洗液WB，12000g离心30～60s，弃离心管中的废液，

7)加入500μl漂洗液WB，12000g离心30～60s，弃离心管中的废液，

8)将吸附柱EC放回空收集管中，12000g离心2min，尽量除去漂洗液，

9)取出吸附柱EC，放入到一个干净的离心管中，在吸附膜中间部位加入50μl洗脱液冲洗EB，65℃水浴5min，室温放置2min，12000g离心1min；

第三、转化

在微量离心管中配制如下反应液，

2)向以上的DNA溶液中加入等体积(5μl)Solution I，充分混匀，

3)16℃温育30min，

4)取10μl加入至100μl E.coli感受态细胞中，轻柔混合，然后冰中放置30min。

5)42℃水浴加热1min后，迅速转入冰中放置2min，

6)加入890μl SOC培养基，预先在37℃保温，，37℃振荡培养1h，

7)取100μl转化液涂在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上37℃过夜培养，

8)挑选白色菌落，进行菌液PCR验证，

最后向上述PCR菌液鉴定阳性的克隆加入甘油使其终浓度为15％，分装于1.5ml的离心管置于-80℃冰箱保存，剩余菌液送上海生工测序。