CN111280165A - 一种莲草直胸跳甲卵的低温保藏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种莲草直胸跳甲卵的低温保藏方法，包括以下步骤：取莲草直胸跳甲当天在喜旱莲子草上产下的卵，连叶子采下，放置在培养皿中，底部用蒸馏水湿滤纸或1％(m/v)琼脂培养基进行保湿，顶部用保鲜膜封口，并扎上小孔进行通风，在保藏温度为15℃下，保藏莲草直胸跳甲卵至不影响各阶段的存活率、成虫繁殖力及种群增长的保藏时间5～7天。本发明解决了现有莲草直胸跳甲卵低温保藏后，无法确定对莲草直胸跳甲后续发育阶段、种群甚至下一代影响的问题。本发明能够在不影响其后续发育阶段、种群甚至下一代的情况下，使莲草直胸跳甲卵达到最长保藏时间。

Description

一种莲草直胸跳甲卵的低温保藏方法
技术领域
本发明涉及一种昆虫卵的低温保藏方法，具体涉及一种莲草直胸跳甲卵的低温保藏方法。
背景技术
伴随着全球一体化进程的飞速发展，入侵生物明显增多，威胁全球生态安全与生物安全。中国是遭受外来生物入侵危害最严重的国家之一，在已确定的600多种外来入侵物种中，入侵植物占近一半。这已经成为制约我国经济发展的重要因素之一。喜旱莲子草Alternanthera philoxeroides是全球性的恶性杂草，上世纪30年代传入我国，现已扩散到全国20多个省、市、自治区，对农田种植、淡水养殖、水利事业、航运事业及景观生态等造成严重威胁，每年造成的经济损失高达6亿元人民币。我国国家环保总局与中国科学院联合公布的16种重要外来入侵种中喜旱莲子草名列三甲。
莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila为喜旱莲子草的专食性天敌昆虫，由于其良好的防治效果，先后被美国、澳大利亚、新西兰、泰国等国家引进。我国于1986年从美国佛罗里达引进该天敌对喜旱莲子草进行生物防治，已经在重庆、长沙、广西、福建等地建立种群，并取得良好的防治效果。虽然莲草直胸跳甲是喜旱莲子草的最有效天敌，但是喜旱莲子草的分布普遍大于其天敌分布的面积，高纬度地区喜旱莲子草的控制是世界性的难题。在高纬地区冬季到来时，喜旱莲子草生长衰弱，而且此虫无滞育现象，造成了莲草直胸跳甲大量死亡，且种群建立也受早春低温的影响。因此，低温限制了莲草直胸跳甲的分布北界和在高纬度地区的控草效果。在低纬度地区，莲草直胸跳甲种群随季节变化，消长明显。特别在夏季，正值喜旱莲子草的生长高峰期，但高温却对莲草直胸跳甲的种群有明显的抑制作用。因此，在这些地区和季节，对莲草直胸跳甲进行低温保藏，优化大量生产条件，待条件合适时大量释放是维持生物防治效果的关键，具有重要的研究价值和实践意义。
目前国内外关于莲草直胸跳甲的低温保藏研究有6篇文献进行报道。第一篇文献(Stewart et al.Temperature effects on the alligator weed flea-beetle,Agasicles hygrophila (Coleoptera:Chrysomelidae):implications for biologicalcontrol in New Zealand. University of Cape Town,Stellenbosch,South Africa,1996)研究表明，莲草直胸跳甲成虫在10℃下冷藏4周后仅有8％的个体存活，7周后无存活；第二篇文献(Stewart et al. Influence of temperature on adult longevity,oviposition and fertility of Agasicles hygrophila Selman&Vogt(Coleoptera:Chrysomelidae).New Zealand Journal of Zoology, 1999,26(3):191-197)研究表明，成虫在15℃冷藏1周后卵的孵化率为31％，冷藏4周后降至2％；第三篇文献(傅建炜等.温度对莲草直胸跳甲成虫繁殖特性和卵孵化的影响.生物安全学报,2011,20(2),119-123)研究表明莲草直胸跳甲卵在15℃冷藏10天卵的孵化率不受影响；第四篇文献(Guo etal.Performance of Agasicles hygrophila(Coleoptera: Chrysomelidae),abiological control agent of invasive alligator weed,at low non-freezingtemperatures.Biological Invasions,14:1597-1608)研究表明，莲草直胸跳甲成虫在4℃恒温条件下可存活10天，12℃可存活1个月以上，在4-10℃的温度下冷藏10 天，成虫不产卵，在12℃恒温冷藏后，成虫的平均产卵量是对照条件25℃下的1/10；第五篇文献(曹雪等.天敌莲草直胸跳甲保藏方法初探.山西农业科学,2013,41(7):738-741,744) 研究表明，莲草直胸跳甲卵和成虫这两个虫态更适宜低温保藏，且在5–10℃下保藏较好，卵在10℃下冷藏4天对其孵化没有影响；第六篇文献(Liu et al.Response to short-term coldstorage for eggs of Agasicles hygrophila(Coleoptera:Chrysomelidae),abiological control agent of alligator weed Alternanthera philoxeroides(Caryophyllales: Amaranthaceae))研究表明，15℃是莲草直胸跳甲卵的适宜保藏温度，该温度下处理5天跳甲的年龄阶段特异性存活率不受影响，种群增长率增加、寿命延长、繁殖能力增强。关于莲草直胸跳甲卵低温保藏不同时间后，对跳甲后续发育阶段、种群甚至下一代的影响未见报道。
发明内容
为了克服现有莲草直胸跳甲卵低温保藏后，无法确定对莲草直胸跳甲后续发育阶段、种群甚至下一代影响的缺陷，本发明提供了一种能够在不影响其后续发育阶段、种群甚至下一代的情况下，使莲草直胸跳甲卵达到最长保藏时间的低温保藏方法。
本发明为了达到上述目的所采用的技术方案是：
一种莲草直胸跳甲卵的低温保藏方法，包括以下步骤：取莲草直胸跳甲当天在喜旱莲子草上产下的卵，连叶子采下，放置在培养皿中，底部用蒸馏水湿滤纸或1％(m/v)琼脂培养基进行保湿，顶部用保鲜膜封口，并扎上小孔进行通风，在保藏温度15℃下，保藏莲草直胸跳甲卵至不影响各阶段存活率、发育时间、寿命、繁殖力、种群参数以及F1代卵的孵化率和卵历期的保藏时间为5～7天。
优选的，所述蒸馏水湿滤纸保藏低于5天，1％(m/v)琼脂培养基保藏超过5天。
优选的，所述保藏时间为7天。
本发明提供了莲草直胸跳甲卵的低温保藏的关键影响因子(温度和保湿介质)，确定了莲草直胸跳甲卵期低温保藏的时间。本发明通过莲草直胸跳甲卵经过不同保藏条件后各阶段 (卵、幼虫、蛹、成虫)的存活率、发育时间、繁殖力和寿命等生命参数，内禀增长率、周限增长率、净繁殖率、平均世代时间等种群参数，以及F1代卵的孵化率和卵历期，与25℃未经冷藏下的参数进行对比，发育时间延长，其它参数没有显著差异的，可以用于实际生产。
附图说明
现在参考附图对本发明作进一步描述，其中：
图1不同保湿介质保湿下15℃保藏不同时间后莲草直胸跳甲卵的历期；
图2莲草直胸跳甲卵在15℃保藏不同时间后年龄-阶段特异性存活率sxj；
(A)卵在25℃饲养的对照组(B)卵在15℃保藏5天(C)卵在15℃保藏7天(D)卵在15℃保藏10天(E)卵在15℃保藏15天(F)卵在15℃保藏18天。每天记录幼虫、蛹和成虫的存活数直至所有个体都死亡；
图3莲草直胸跳甲卵在15℃保藏不同时间后年龄特异性存活率lx、雌性年龄-阶段特异性繁殖力fx4、年龄特异性繁殖力mx和年龄特异性净繁殖力lxmx；
(A)卵在25℃饲养的对照组(B)卵在15℃保藏5天(C)卵在15℃保藏7天(D)卵在15℃保藏10天(E)卵在15℃保藏15天(F)卵在15℃保藏18天。每天记录幼虫、蛹和成虫的存活数直至所有个体都死亡。
具体实施方式
实施例1
本实施例的莲草直胸跳甲卵的低温保藏方法，包括以下步骤：取莲草直胸跳甲当天在喜旱莲子草上产下的卵，连叶子采下，放置在培养皿中，底部用蒸馏水湿滤纸进行保湿，顶部用保鲜膜封口，并扎上小孔进行通风，在保藏温度15℃下，保藏莲草直胸跳甲卵至不影响各阶段存活率、发育时间、寿命、繁殖力、种群参数以及F1代卵的孵化率和卵历期的保藏时间为5天。
实施例2
本实施例的莲草直胸跳甲卵的低温保藏方法，包括以下步骤：取莲草直胸跳甲当天在喜旱莲子草上产下的卵，连叶子采下，放置在培养皿中，底部用1％(m/v)琼脂培养基进行保湿，顶部用保鲜膜封口，并扎上小孔进行通风，在保藏温度15℃下，保藏莲草直胸跳甲卵至不影响各阶段存活率、发育时间、寿命、繁殖力、种群参数以及F1代卵的孵化率和卵历期的保藏时间为7天。
为了对本发明中的关键影响因子进行验证，本发明提供了如下实验过程及结果。
【试验材料】
供试昆虫为长期饲养在山西农业大学农学院养虫室(25±1℃，L:D＝14:10，RH＝85±5％) 的莲草直胸跳甲(最初采自华南农业大学)，供试植物为种植在山西农业大学生物安全与生物防治研究基地温室中的喜旱莲子草(最初采自浙江省玉环县)。
【试验方法】
中长期冷藏过程中保湿介质的实验
在保藏温度15℃下，进行中长期(长于5天)保藏时，用常规的蒸馏水湿滤纸保湿时，莲草直胸跳甲卵所在的叶片出现萎蔫皱缩，影响孵化。因此本研究设置了三种保湿介质(1) 蒸馏水湿滤纸保湿：将每个培养皿(直径15cm)底部铺一片滤纸，滤纸上放一个棉球，棉球上注射8.5mL已灭菌的蒸馏水，让其完全浸湿滤纸，之后将承载卵的叶片放在滤纸上；(2)甘油湿滤纸保湿：根据雷喜红(2012)的不同温度下维持不同湿度所需甘油和水的配方(见表1)，按照20℃下90％的目标湿度，所需的甘油含量为13.8％(40mL甘油和250mL蒸馏水充分混匀)，将棉球上注射8.5mL已灭菌的13.8％甘油，让其完全浸湿滤纸，之后将承载卵的叶片放在滤纸上；(3)1％琼脂培养基保湿：将直径为15cm的培养皿中倒入已灭菌的1％的琼脂培养基150mL，待其完全冷却凝固后，将承载卵的叶片平铺其上。每种保湿介质保湿下每个保藏时间包括4个重复，每个培养皿为一个重复，每个培养皿中放置3个承载卵的叶片。置于光照培养箱中于15℃下分别保藏5、7、10、15、18天(预实验发现莲草直胸跳甲的卵在15℃下发育历期为18天)，以不同保湿介质下置于25℃下的卵为对照。每天观察直至卵孵化，记录卵历期和孵化数。莲草直胸跳甲卵历期和孵化率在分析前用Shapiro–Wilk test检测其正态性，之后用IBM SPSS Statistics 20.0中的Tukey’s HSD test进行单因素方差分析。因为蒸馏水湿滤纸保湿下卵冷藏18天承载卵的叶片完全萎蔫皱缩，卵不能孵化，所以卵在15℃下保藏18天只用甘油湿滤纸和1％琼脂培养基保湿，这两种保湿介质保湿下莲草直胸跳甲卵历期和孵化率之间的差异用独立样本t检验进行比较。确定最佳保湿介质。
表1不同湿度下甘油和水的配比
Figure BDA0002399996940000041
注：参考雷喜红.2012.苹果园桃小食心虫无公害治理生态基础研究.博士学位论文.北京: 中国农业大学
莲草直胸跳甲卵期保藏时间的实验
在保藏温度为15℃和保湿介质为1％琼脂培养基下进行中长期保藏，在保证卵孵化率和种群增长的同时，尽可能延长保藏期。共设置了15℃-5d，15℃-7d，15℃-10d，15℃-15d，15℃ -18d和CK(一直在25℃下未冷藏)6个测试组。将以上5冷藏组在15℃保藏相应的天数后，再置于25℃养虫室中饲养，每个测试组供试卵量为90粒左右，放置在玻璃培养皿中(底部以1％琼脂培养基保湿)，用保鲜膜封口，其上扎上小洞进行通风。每天观察直至卵孵化，记录卵的发育时间和存活数。之后每天提供新鲜的喜旱莲子草叶片，每天观察和记录幼虫的数量。当老熟幼虫将要化蛹时，将其分别放入化蛹管中，每个化蛹管中放入一根喜旱莲子草茎秆，用棉花包裹喜旱莲子草的茎秆底部，并注入适量清水。之后每天定时观察化蛹情况，以老熟幼虫钻入茎秆记为蛹期开始，羽化为成虫钻出茎秆记为蛹期结束，成虫期开始。羽化后鉴别和记录雌雄后分别放入养虫罐饲养，用于交配和产卵。每天为各养虫罐更换新鲜的喜旱莲子草，并观察和记录雌雄虫的存活，在显微镜下记录其产卵量，直至所有成虫死亡。选择不同时间保藏处理组成虫在产卵高峰期所产的卵，即F1代卵，观察记录卵历期和孵化率。每天选择排列整齐、饱满的卵块3–4块(70–120粒卵)置于一个培养皿中，每个处理连续取 3–6天的卵，即3–6个重复。每天观察直至卵孵化，自孵化之日起连续记录3天内的孵化数，从而计算F1代卵的孵化率，以3天内卵孵化时间的加权平均数作为F1代卵的历期。莲草直胸跳甲的存活、发育和产卵的原始数据采用以年龄-阶段两性生命表的理论和方法为基础的 TWOSEX-MS Chart软件(http://140.120.197.173/Ecology/Download/TWOSEXMSChart.rar) 进行分析，分析不同时间保藏后莲草直胸跳甲各年龄阶段的存活率、繁殖力、发育时间和寿命等生命参数及种群参数，本研究涉及的生命参数包括年龄-阶段特异性存活率sxj，年龄特异性存活率lx，雌性年龄特异性繁殖力fx4(成虫是第四个阶段)，年龄特异性繁殖力mx和年龄特异性净繁殖力lxmx；种群参数包括内禀增长率r，周限增长率λ，净繁殖率R0和平均世代时间T等。所有数据用Bootstrap法经100,000次抽样估计各处理种群参数的标准误，然后用paired bootstrap test(B＝100,000)，基于95％置信区间来分析不同时间保藏后的差异显著性。不同时间保藏后F1代卵的历期和孵化率数据在分析前用Shapiro–Wilk test检测其正态性，之后用IBM SPSS Statistics 20.0中的Tukey’s HSD test进行单因素方差分析，得出最长保藏时间。
【试验结果】
不同保湿介质对莲草直胸跳甲卵孵化及发育的影响
不同保湿介质对未经保藏的莲草直胸跳甲卵的孵化有显著影响。蒸馏水湿滤纸和琼脂培养基保湿下莲草直胸跳甲卵的孵化率无差异，显著高于甘油湿滤纸保湿下卵的孵化率。不同保湿介质对15℃下保藏5和7天莲草直胸跳甲卵的孵化率没有影响，对保藏10天以上莲草直胸跳甲卵的孵化率有显著影响。15℃下保藏10和15天时，蒸馏水湿滤纸和琼脂培养基保湿下卵的孵化率均较高，显著高于甘油湿滤纸保湿下卵的孵化率；15℃下保藏18天时，琼脂培养基保湿下卵的孵化率显著高于甘油湿滤纸保湿下卵的孵化率，保藏18天时蒸馏水湿滤纸保湿下承载卵的叶片完全萎蔫皱缩，卵不能孵化(表2)。蒸馏水湿滤纸保湿下经过不同冷藏时间后，莲草直胸跳甲卵的孵化率显著不同，冷藏7天以内不影响卵的孵化率，保藏10和 15天显著降低卵的孵化率；甘油湿滤纸保湿下经过不同冷藏时间后，莲草直胸跳甲卵的孵化率也显著不同，冷藏10天以内不影响卵的孵化率，冷藏15天及以上极大地影响其孵化率，且冷藏时间越长，孵化率越低；琼脂培养基保湿时，不同冷藏时间对莲草直胸跳甲卵的孵化率没有影响，冷藏18天之内跳甲卵的孵化率基本不变。
表2不同保湿介质保湿下15℃保藏不同时间后莲草直胸跳甲卵的孵化率
Figure BDA0002399996940000061
注：同一列中不同小写字母表示不同保藏时间后跳甲卵的孵化率有显著差异，同一行中不同大写字母表示不同保湿方式下跳甲卵的孵化率之间有显著差异(Tukey检验，P<0.05)。
不同保湿介质对未保藏和15℃下保藏5、7、10、18天莲草直胸跳甲卵的发育历期没有影响，发育时间均随着保藏时间的增加而延长。但是15℃下保藏15天时，蒸馏水湿滤纸和琼脂培养基保湿下卵的发育时间都显著长于甘油湿滤纸保湿下卵的发育时间(图1)。
因此，莲草直胸跳甲的卵在15℃下保藏5天以上，1％琼脂培养基是比较适宜的保湿介质。
不同保藏时间对莲草直胸跳甲生长发育、种群及F1代的影响
以琼脂培养基作为保湿介质，将莲草直胸跳甲的卵在15℃下保藏5、7、10、15和18天，以25℃未冷藏的卵为对照。15℃下保藏不同时间不影响卵的孵化率。25℃下莲草直胸跳甲卵的孵化率为92.6％，15℃下保藏5、7、10、15和18天后，卵的孵化率分别为91.9％、93.9％、92.5％、94.7％和88.31％。与对照组相比，15℃下保藏5、7和15天的跳甲的年龄-阶段特异性存活率lx与对照组相近，保藏10天的跳甲蛹期的存活率有明显下降，保藏18天的跳甲的各年龄-阶段特异性存活率都有所下降(图2)。15℃下保藏5、7、10和15天的处理组分别有70.84％、74.24％、70％、69.1％的个体活到成虫，与对照组76.8％类似；保藏18天处理组有 61.0％的个体活到成虫期，略低于对照组。
15℃下保藏5、7、10、15和18天的年龄特异性存活率lx与25℃对照组没有明显差异，只是15℃-18d处理组的孵化率稍低于其他处理和对照，导致年龄特异性存活率在第一次下降时降低的趋势更明显。与对照组相比，15℃保藏5天后产卵前的历期没有改变，同为31天。 15℃保藏7、10、15和18天的处理组产卵前的历期分别比对照延长了3、6、10和12天，它们的fx4、mx和lxmx曲线也相应后移。15℃保藏5、7和10天的处理组fx4与对照组相似，大多处于20～40粒之间，15℃保藏15和18天的处理组都会有几个产卵高峰，超出40粒。卵在 15℃保藏15天的fx4曲线分别在第75天出现一个异常高峰，是由于雌虫数减少但产卵数增加。mx表示年龄特异性繁殖力，在雌虫和雄虫比例接近一比一的情况下应为fx4的一半。卵在15℃保藏5、7、10、18天后，雄成虫的寿命较雌成虫短，在雄虫全部死亡后，fx4后半段与mx重合。对于年龄特异性净繁殖力lxmx，15℃保藏5、7、10和15天处理组均与对照组的曲线较为接近，而保藏18天的处理组在各个时期与对照相比均有下降(图3)。
表3显示了卵在15℃不同时间保藏下莲草直胸跳甲的平均发育历期、成虫期、总寿命、产卵期、繁殖力、群体中的雌虫比例和雄雌比例。莲草直胸跳甲卵在15℃下保藏长于7天，均可显著延长发育时间，且发育时间随保藏时间的增加而延长，可延长2.5～12.1天。保藏5 天后雌成虫期显著延长，保藏15天后雌成虫期显著缩短，保藏7、10和18天的处理组与对照组相比，雌成虫期没有显著变化。同样保藏5和15天后雄成虫期显著延长，保藏7、10和18天的处理组与对照组相比，雄成虫期没有显著变化。由于雌成虫期延长，所以保藏5天显著延长雌虫总寿命，而保藏7、10、15和18天的雌虫总寿命与对照组无显著差异。雄虫总寿命在保藏5、15和18天后显著增加，而保藏7和10天的雄虫总寿命与对照没有差异。保藏 5天后，莲草直胸跳甲的产卵天数和繁殖力比对照显著增加；保藏15天后，产卵天数比对照显著缩短，繁殖力与对照相似；其余处理组与对照组的产卵天数和繁殖力均无显著差异。各保藏处理组的雌性比例和雄雌比例与对照组均没有显著差异。
表3不同时间保藏下莲草直胸跳甲的生命参数
Figure BDA0002399996940000081
注：同行不同字母表示不同处理之间存在显著差异(paired bootstrap test,B＝100,000,P<0.05)
表4显示了莲草直胸跳甲卵经15℃不同时间保藏后种群的内禀增长率r、周限增长率λ、净繁殖率R0和平均世代时间T。保藏5和7天种群的内禀增长率和周限增长率与对照组没有显著差异，而保藏10、15和18天种群的内禀增长率和周限增长率都显著降低，并随保藏时间延长而降低。与25℃对照相比，在15℃下保藏5、7、10和15天种群的净繁殖率没有显著差异，保藏18天后种群的净繁殖率显著下降。随低温保藏时间的延长，平均世代时间显著延长，延长4-13天。综上分析，对于低温敏感型的莲草直胸跳甲来说，不适宜进行超过1个月的长期保藏，在不影响各阶段的存活率、成虫繁殖力及种群增长的情况下，在15℃下最长可保藏7天。
表4不同时间保藏下莲草直胸跳甲的种群参数
Figure BDA0002399996940000082
注：同行不同字母表示不同处理之间存在显著差异(paired bootstrap test,B＝100,000,P<0.05)
低温保藏对莲草直胸跳甲F1代卵的影响
莲草直胸跳甲的卵在15℃下保藏不同时间后对其F1代卵的孵化率没有显著影响，与对照组之间均没有显著差异。不同保藏时间处理对莲草直胸跳甲F1代卵的卵历期也没有显著影响，与对照组的卵历期没有显著差异，为5.7-6.0天(表5)。因此，将莲草直胸跳甲的卵在15℃下最长保藏7天不影响当代卵的孵化率、后续各阶段的存活率、成虫繁殖力、种群增长率，甚至对F1代卵的孵化率和卵历期都没有影响。
表5卵经15℃保藏不同时间后F1代卵的孵化率和卵历期
Figure BDA0002399996940000091
注：同行不同字母表示不同处理之间存在显著差异(Tukey检验，P<0.05)。

Claims (3)

1.一种莲草直胸跳甲卵的低温保藏方法，其特征在于，取莲草直胸跳甲当天在喜旱莲子草上产下的卵，连叶子采下，放置在培养皿中，底部用蒸馏水湿滤纸或1％(m/v)琼脂培养基进行保湿，顶部用保鲜膜封口，并扎上小孔进行通风，在保藏温度15℃下，保藏莲草直胸跳甲卵至不影响各阶段存活率、发育时间、寿命、繁殖力、种群参数以及F1代卵的孵化率和卵历期的保藏时间为5～7天。
2.根据权利要求1所述的莲草直胸跳甲卵的低温保藏方法，其特征在于，所述蒸馏水湿滤纸保藏低于5天，1％(m/v)琼脂培养基保藏超过5天。
3.根据权利要求1所述的莲草直胸跳甲卵的低温保藏方法，其特征在于，所述保藏时间为7天。
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