CN110042167A - 热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法，属于生物安全与生物防治技术领域，具体包括首先调查了不同高温和时间条件下，莲草直胸跳甲不同发育阶段，如卵，1龄，2龄，3龄幼虫，蛹及成虫的存活率，通过其耐热性差异比较，选取耐热性最差的虫态进行了短时高温下整个种群在各发育阶段的存活、寿命、繁殖力等生命参数的观察；通过明确莲草直胸跳甲高温耐受性最差的虫态和影响的关键温度,然后系统鉴定莲草直胸跳甲所有热激蛋白家族基因。最后通过实时荧光定量PCR分析热激蛋白基因与温度适应性的关系，探讨热激蛋白基因诱导表达的最大值是否可以作为一种生物指示剂来指示物种对温度的耐受极限。本发明能够准确了解引进昆虫对温度的耐受性，大大缩短昆虫引进周期。

Description

热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法

技术领域

本发明涉及一种热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法，属于生物安全与生物防治技术领域。

背景技术

热激蛋白(Heat shock proteins，HSPs)是细胞或生物体受到热激或其它应激原作用下新合成或含量增加的一类遗传上高度保守的蛋白，在生物体中普遍存在，在细胞生长、发育、分化、基因转录等功能方面发挥重要的作用。根据分子量的大小和氨基酸同源性的差异，热激蛋白可以划分为几个家族：Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40以及小分子Hsp(sHsp)。

由于热激蛋白基因响应各种生物与非生物胁迫，且反应灵敏，因此可以作为指示各种胁迫的分子标记物。当生物体受到胁迫时，HSPs往往会迅速做出应激反应，因此使用HSPs的检测比传统的基于生长速率，死亡率、繁殖率等测试更加超前、灵敏和迅速。例如当生物体受到环境污染时，便可以提前预警预报，从而对生态环境做出准确的评估。目前已有研究通过检测生物体内HSPs的变化来对土壤污染、大气污染等进行检测评估(Kohler等.Validation of hsp70stress gene expression as a marker of metal effects inDeroceras reticulatum(Pulmonata):correlation with demographic parameters，Environnental Toxicology and Chemistry，1998；17(11):2246-2253.Webb和Gagnon.Thevalue of stress protein70as an environmental biomarker of fish health underconditions,2008，DOI 10.1002/tox)，因此热激蛋白是一种很有潜力的环境污染分子标记物。热激蛋白作为莲草直胸跳甲温度耐受的分子标记物目前研究很少。

莲草直胸跳甲是世界性恶性杂草—喜旱莲子草的天敌昆虫，该天敌昆虫温度适应性较差，温度的变化直接影响其地理分布及控草效果。本发明对温度胁迫下莲草直胸跳甲的生命参数和热激蛋白基因的表达模式进行研究。探讨热激蛋白基因作为一种分子标记物应用于昆虫温度耐受性检测评估的可行性，为开发热激蛋白基因在昆虫领域的应用奠定理论基础。

发明内容

为解决现有技术存在的技术问题，本发明提供了一种能够准确了解引进昆虫对温度的耐受性，大大缩短昆虫引进周期的热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法，其特征在于：按照以下步骤进行，

a、昆虫样品的高温处理

收集莲草直胸跳甲12h内所产的卵，按照6个不同的发育阶段卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹、成虫，将卵分为6组，各组卵均置于25℃、相对湿度85±5％、光照周期14L:10D的养虫室中饲养，处理温度为32.5℃，35℃，37.5℃，40℃，42.5℃，45(±0.5℃)，处理时间为1h，3h，5h，每个处理为5个重复，每个重复供试虫量100～150头，热处理结束后，将热暴露后的莲草直胸跳甲转移至25℃养虫室继续饲养；

b、短时高温对莲草直胸跳甲种群的影响

对经过短时高温处理的各虫态的存活率数据进行分析，选取关键的热敏感虫态、温度及时间处理组合进行生命表观察和数据记录，然后对生命表数据分析，最终明确高温对莲草直胸跳甲种群的影响；

在进行生命表数据分析时，根据年龄-阶段两性生命表的理论和方法，利用http://140.120.197.173/Ecology/Download/TWOSEXMSChart.rar所提供的计算机程序TWOSEX-MSChart，分析了莲草直胸跳甲不同发育阶段的存活率、寿命和繁殖力等所有原始数据；因为莲草直胸跳甲是群体饲养的，所以记录了在每个阶段，存活至年龄为x的个体的数量；其中涉及的生命参数包括特定年龄-阶段特异性存活率，计算如下：其中n₀₁是在生命表试验开始时卵的数量，s_xj，表示新孵化个体存活至第x天和第j阶段的比率，n_xj是存活到第x天和第j阶段的跳甲数量；

雌性年龄-阶段特异性繁殖力f_x4计算公式如下：其中E_x表示所有雌性成虫(第4阶段)在x天时产卵的总数，n_x4是雌性成虫存活到第x天的数量；

根据Chi和Liu(Bulletin of the Institute of Zoology Academia Sinica,24(2):225-240)，净生殖率R₀表示一个体在其生命期内可以产生的后代的总数，计算公式为：其中m是生命阶段的数目,lx是年龄特异性存活率(新产的卵存活到第x天的概率)，mx是年龄特异性繁殖力(第x天个体的平均繁殖力)；

l_x和m_x的计算如下：

用迭代对分法和Euler-Lotka方程，估算了年龄指数从0开始的内禀增长率r，公式如下：

周限增长率λ，平均世代周期T等，计算如下：λ＝e^r，

用Bootstrap法估计各处理种群参数的标准误，该方法需要每个个体的寿命和雌成虫的日繁殖力，每个个体的寿命和性别可以根据个体的存活状态来计算；雌虫的平均繁殖力可以根据每头雌虫每天产卵的数量来估算；根据Chi(Environmental Entomology,17(1):26-34)证明的R₀和F之间的关系，该方法不会影响l_x或m_x，因此，也不会影响群体参数；由于雌性寿命不同，这种方法仍然可以揭示其对雌性繁殖力的影响，对于发育时间，寿命，繁殖力和种群参数的方差和标准差估算，均采用采用Bootstrap方法，进行100,000次抽样，处理间的差异用配对Paired Bootstrap方法进行检验(B＝100,000)，基于95％置信区间进行比较；

c、实时荧光定量PCR分析热激蛋白基因与温度适应性的关系

鉴定完莲草直胸跳甲所有热激蛋白家族基因后，提取热敏感虫态(卵)不同温度条件下的总RNA，提取完成后，利用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，核酸蛋白检测仪测定其浓度和纯度，然后-80℃保存备用；然后再对RNA进行纯化处理，处理完成后，利用电泳检测基因组DNA是否去除干净，如没有完全去除，增加DNase I的量和反应的时间直至完全去除，然后-80℃保存备用；最后在再对RNA进行反转录和实时荧光定量PCR；

在进行实时荧光定量PCR时，设计27个HSP基因和内参基因β-actin的PCR引物，实时荧光定量PCR的反应总体系为20μL，其中包括10μL的2× Select Master Mix(Applied Biosystems)，2μM的基因特异性引物和2μL的莲草直胸跳甲cDNA模板，整个反应在ABI 7500上进行，相对定量的数据使用ABI 7500SDS v2.2.6软件生成，每个样品3次技术重复，β-actin作为内参基因，热激蛋白基因mRNA的相对表达量数据采用2^-△△CT法处理计算；相关热循环参数设置如下：

优选的，所述步骤c中在进行RNA的提取时，

1)将各温度处理虫卵样品在液氮中充分研磨后加入到1.5ml RNase-free的EP管中，样品总量为60mg；

2)向RNase-free EP管中加入1ml Trizon，10μlβ-巯基乙醇，用移液器吹打混匀后，室温静置10min，在4℃下12000g，离心10min；

3)取上清液，转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，室温静置5min，加入200μl氯仿，剧烈震动2～3min，室温静置3min，在4℃下12000g，离心15min；

4)吸取上清液转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，加入200μl氯仿，剧烈震动，室温静置3min，4℃下12000g离心15min；

5)吸取上清液转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，加入-20℃预冷等体积异丙醇和50μl 3M醋酸钠，上下颠倒混匀，置于-20℃保存1h左右；

6)4℃下12000g离心10min；

7)弃上清，向沉淀中加入75％乙醇，颠倒冲洗，室温7500g离心10min；重复2～3次。

8)弃上清，置于室温干燥5min左右，待乙醇挥发完全后加入100μl RNase-free的水溶解。

优选的，所述步骤c中在进行RNA的纯化时，

1)在微量离心管中配制下列反应液体系；

2)将提取的RAN在37℃反应20～30min；

3)加入50μl RNase free water，再加入100μl苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)后混匀；

4)12000g常温离心5min后吸取上清；

5)加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混匀；

6)12000g常温离心5min后吸取上清；

7)通过上述抽提将DNase I失活，然后加入10μl 3M醋酸钠和250μl预冷的75％乙醇，充分混匀后置于-20℃保存1h；

8)12000g，4℃离心10min，弃上清，室温干燥5min。

优选的，所述步骤c中在进行RNA反转录时，

1)在微量离心管中配制下列模板RNA/Oligo(dT)混合液，

2)70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2min左右，

3)离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。

4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，

。

优选的，所述步骤c中27个HSP基因和内参基因β-actin的PCR引物如下：

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：本发明利用热激蛋白基因检测某一新引进昆虫对被引进地区的温度适应能力，可以准确预测引进昆虫的地理分布范围及适应性，不仅简便、快速、降低引进昆虫传统试验方法的人工试验强度和研究经费，而且大大缩短了昆虫的引进周期，在生物防治等领域具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明中对照组25℃和处理组35℃和37.5℃高温处理1h，莲草直胸跳甲的年龄-阶段特异性存活率(s_xj)示意图。

图2为本发明中对照组25℃和处理组35℃和37.5℃高温处理1h下莲草直胸跳甲生殖能力的分析与比较：在不同温度处理条件下莲草直胸跳甲的年龄特异性存活率(l_x)，雌性年龄-阶段特异性繁殖力(f_x4)，年龄特异性繁殖力(m_x)和年龄特异性净繁殖力(l_xm_x)的示意图。

图3为本发明中HSP基因在莲草直胸跳甲卵期不同温度条件下的表达。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一、热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法，按照以下步骤进行，

a、昆虫样品的高温处理

收集莲草直胸跳甲12h内所产的卵，按照6个不同的发育阶段卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹、成虫，将卵分为6组，各组卵均置于25℃、相对湿度85±5％、光照周期14L:10D的养虫室中饲养，处理温度为32.5℃，35℃，37.5℃，40℃，42.5℃，45(±0.5℃)，处理时间为1h，3h，5h，每个处理为5个重复，每个重复供试虫量100～150头。各虫态的对照组均在25℃±1℃饲养。热处理结束后，将热暴露后的莲草直胸跳甲转移至25℃养虫室继续饲养。需要特别指出，因为莲草直胸跳甲的化蛹是在喜旱莲子草的茎秆中完成的，所以蛹的高温处理是将茎秆和蛹一起处理完成的。统计各处理组和对照组莲草直胸跳甲的存活率，卵和蛹的存活率判断标准为孵化率和羽化率，幼虫和成虫的存活率判断标准为，用毛笔触碰6h恢复的幼虫和成虫的身体和足，如不动则认为死亡。整个试验中用HOBO(Pro V2Temp/RHDate Logger U23-001，Onset.，USA)记录温湿度，其中养虫室的温度波动范围为±1℃，处理温度波动范围为±0.5℃。

其中，莲草直胸跳甲：采集于华南农业大学(中国，广州)，后饲养于山西农业大学养虫室(山西，太谷)，标准化条件(25℃±1℃，L:D＝14:10，RH＝85±5％)下多代饲养，使之成为遗传背景较一致的试验种群。

喜旱莲子草：采自浙江省玉环县，现种植于山西农业大学生物安全与生物防治研究基地温室中。

b、短时高温对莲草直胸跳甲种群的影响

对经过短时高温处理的各虫态的存活率数据进行分析，选取关键的热敏感虫态、温度及时间处理组合进行生命表观察和数据记录，然后对生命表数据分析，最终明确高温对莲草直胸跳甲种群的影响；

各虫态存活率数据分析：试验数据均采用SPSS 21.0(IBM USA)软件进行统计分析。各虫态的存活率数据经反正弦转换后再进行one-way ANOVA方差分析，其中将处理温度和时间组合作为因素，并用Tukey’s HSD进行多重比较。差异显著性标准为P<0.05。

生命表观察和数据记录：根据存活率的数据分析，选取关键的热敏感虫态、温度及时间处理组合，本研究所选取的虫态为卵，处理温度和时间为37.5℃，1h。为了更可靠的评估卵期短时高温对莲草直胸跳甲种群的影响，我们也记录了卵在35℃处理1h的生命表数据，对照为25℃。将以上共三个测试组的卵置于25℃、相对湿度85±5％、光照周期14L:10D的养虫室中饲养。每天观察和记录卵、幼虫、蛹、成虫和成虫产卵的数量。卵和幼虫使用培养皿饲养(直径150mm，高25mm)，每天提供新鲜的喜旱莲子草叶片。由于莲草直胸跳甲的蛹期需要老熟幼虫钻入喜旱莲子草的茎秆中完成，所以将喜旱莲子草水培于玻璃管中(直径为25mm，高为400mm)，然后接入老熟幼虫以完成化蛹。当以上处理和对照的成虫羽化后，鉴别和统计雌雄后分别放于养虫罐瓶中(直径150mm，高200mm)饲养，用于交配和产卵。每天为各养虫罐瓶更换新鲜的喜旱莲子草，并观察和记录雌雄虫的存活和产卵量，直至所有成虫死亡。

生命表数据：根据年龄-阶段两性生命表的理论和方法，利用http://140.120.197.173/Ecology/Download/TWOSEXMSChart.rar所提供的计算机程序TWOSEX-MSChart，分析了莲草直胸跳甲不同发育阶段的存活率、寿命和繁殖力等所有原始数据；因为莲草直胸跳甲是群体饲养的，所以记录了在每个阶段，存活至年龄为x的个体的数量；其中涉及的生命参数包括特定年龄-阶段特异性存活率，计算如下：其中n₀₁是在生命表试验开始时卵的数量，s_xj，表示新孵化个体存活至第x天和第j阶段的比率，n_xj是存活到第x天和第j阶段的跳甲数量；

雌性年龄-阶段特异性繁殖力f_x4计算公式如下：其中E_x表示所有雌性成虫(第4阶段)在x天时产卵的总数，n_x4是雌性成虫存活到第x天的数量；

根据Chi和Liu(Bulletin of the Institute of Zoology Academia Sinica,24(2):225-240)，净生殖率R₀表示一个体在其生命期内可以产生的后代的总数，计算公式为：其中m是生命阶段的数目，lx是年龄特异性存活率(新产的卵存活到第x天的概率)，mx是年龄特异性繁殖力(第x天个体的平均繁殖力)；

l_x和m_x的计算如下：

用迭代对分法和Euler-Lotka方程，估算了年龄指数从0开始的内禀增长率r，公式如下：

周限增长率λ，平均世代周期T等，计算如下：λ＝e^r，

用Bootstrap法估计各处理种群参数的标准误，该方法需要每个个体的寿命和雌成虫的日繁殖力，每个个体的寿命和性别可以根据个体的存活状态来计算；雌虫的平均繁殖力可以根据每头雌虫每天产卵的数量来估算；根据Chi(Environmental Entomology,17(1):26-34)证明的R₀和F之间的关系，该方法不会影响l_x或m_x，因此，也不会影响群体参数；由于雌性寿命不同，这种方法仍然可以揭示其对雌性繁殖力的影响，对于发育时间，寿命，繁殖力和种群参数的方差和标准差估算，均采用采用Bootstrap方法，进行100,000次抽样，处理间的差异用配对Paired Bootstrap方法进行检验(B＝100,000)，基于95％置信区间进行比较。

c、实时荧光定量PCR分析热激蛋白基因与温度适应性的关系

鉴定完莲草直胸跳甲所有热激蛋白家族基因后，提取热敏感虫态(卵)不同温度条件下的总RNA，提取完成后，利用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，核酸蛋白检测仪测定其浓度和纯度，然后-80℃保存备用；然后再对RNA进行纯化处理，处理完成后，利用电泳检测基因组DNA是否去除干净，如没有完全去除，增加DNase I的量和反应的时间直至完全去除，然后-80℃保存备用；最后在再对RNA进行反转录和实时荧光定量PCR；

RNA的提取：

1)将各温度处理虫卵样品在液氮中充分研磨后加入到1.5ml RNase-free的EP管中，样品总量为60mg；

2)向RNase-free EP管中加入1ml Trizon，10μlβ-巯基乙醇，用移液器吹打混匀后，室温静置10min，在4℃下12000g，离心10min；

3)取上清液，转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，室温静置5min，加入200μl氯仿，剧烈震动2～3min，室温静置3min，在4℃下12000g，离心15min；

4)吸取上清液转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，加入200μl氯仿，剧烈震动，室温静置3min，4℃下12000g离心15min；

5)吸取上清液转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，加入-20℃预冷等体积异丙醇和50μl 3M醋酸钠，上下颠倒混匀，置于-20℃保存1h左右；

6)4℃下12000g离心10min；

7)弃上清，向沉淀中加入75％乙醇，颠倒冲洗，室温7500g离心10min；重复2～3次。

8)弃上清，置于室温干燥5min左右，待乙醇挥发完全后加入100μl RNase-free的水溶解。

c、然后再对RAN进行钝化处理，处理完成后，利用电泳检测基因组DNA是否去除干净，如没有完全去除，增加DNase I的量和反应的时间直至完全去除，然后-80℃保存备用。

RNA的纯化：

1)在微量离心管中配制下列反应液体系；

2)将提取的RAN在37℃反应20～30min；

3)加入50μl RNase free water，再加入100μl苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)后混匀；

4)12000g常温离心5min后吸取上清；

5)加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混匀；

6)12000g常温离心5min后吸取上清；

7)通过上述抽提将DNase I失活，然后加入10μl 3M醋酸钠和250μl预冷的75％乙醇，充分混匀后置于-20℃保存1h；

8)12000g，4℃离心10min，弃上清，室温干燥5min。

RNA反转录：

1)在微量离心管中配制下列模板RNA/Oligo(dT)混合液，

2)70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2min左右，

3)离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。

4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，

实时荧光定量PCR：

设计27个HSP基因和内参基因β-actin的PCR引物，实时荧光定量PCR的反应总体系为20μL，其中包括10μL的2× Select Master Mix(Applied Biosystems)，2μM的基因特异性引物和2μL的莲草直胸跳甲cDNA模板，整个反应在ABI 7500上进行，相对定量的数据使用ABI 7500SDS v2.2.6软件生成，每个样品3次技术重复，β-actin作为内参基因，热激蛋白基因mRNA的相对表达量数据采用2^-△△CT法处理计算；相关热循环参数设置如下：

其中，27个HSP基因和内参基因β-actin的PCR引物如下：

二、数据统计分析方法：将每个基因不同温度处理的最低表达量值作为1(本试验为25℃)，其他温度处理的表达量依此计算表达倍数。试验结果以3个生物学重复的平均值±标准误(mean±SE)表示，采用SPSS 21.0(IBM USA)软件进行统计分析，差异显著性分析使用Tukey’s HSD算法，差异显著性标准为P<0.05。

三、试验结果

1、短时高温暴露各虫态的存活率：莲草直胸跳甲不同虫态经过高温后，其存活率均受到明显的影响如下表所示。

表1短时高温对莲草直胸跳甲不同发育阶段存活率的影响

表中数据为平均数±标准误；每列数据后不同小写字母表示差异显著(HSD，P<0.05)；“—”表示存活率为0

从上表可知，卵在25～37.5℃范围内处理后均能孵化，25～35℃处理5h卵的孵化率没有显著差异，但37.5℃处理1h，3h后，孵化率分别仅为24％和6％，显著低于对照25℃的92％(F_8，36＝1834.101，P<0.0001P<0.0001)。37.5℃处理5h至45℃连续观察10天均未发现卵孵化。结果表明，短时高温对卵孵化率影响的起始关键温度为37.5℃。

莲草直胸跳甲1、2、3龄幼虫在40℃高温之前存活率均无显著差异。40℃高温处理1h以上，存活率显著下降，40℃处理1h，3h后幼虫的存活率下降至88％和36％(F11，48＝121.451，P<0.0001)。当40℃处理5h后，1龄幼虫无法存活。2龄幼虫在40℃处理3h后存活率显著下降，存活率为52％(F_11,48＝68.549，P<0.0001)。当40℃处理5h后，2龄幼虫亦无法存活。3龄幼虫在25℃至40℃处理3h范围内存活率均不受影响，但当40℃处理5h后，3龄幼虫的存活率仅为5％(F_12，52＝898.441,P<0.0001)，可见40℃持续5h的高温对莲草直胸跳甲3龄幼虫是致命的。

莲草直胸跳甲蛹羽化率随温度升高和处理时间的延长显著下降(F18,76＝140.489,P<0.0001)。25～42.5℃处理5h存活率无显著差异，45℃处理1，3h和5h后蛹的羽化率分别为72％，53％和38％，存活率显著降低。成虫在42.5℃高温处理3h以上，存活率显著下降，42.5℃处理3h，5h后成虫的存活率下降至90％和36％，45℃处理1h后存活率下降至49％(F_16,68＝800.175,P<0.0001)。

综上，莲草直胸跳甲卵的耐热性最差，是夏季高温种群骤减的主要原因，影响的关键温度为37.5℃。

2.生命表和种群参数：

表2不同温度处理条件下莲草直胸跳甲的种群参数

在年龄-阶段-性别的种群结构分析中，每天记录其一生中不同发育阶段的存活率(s_xj)，并确定成虫的性别。在对照组25℃和35℃高温处理组表现出较高的孵化率，如图1中A和B；37.5℃高温处理组卵的孵化率显著降低，且卵的发育期也明显延长2天以上，如图1C；但三个测试组的幼虫期和蛹期几乎一致。高温处理与对照组的性别比在羽化后也基本相同。同时，37.5℃处理组的寿命(卵到成虫死亡)整体显著短于对照和35℃处理组，如图1C。

莲草直胸跳甲不同阶段的存活率S_xj合并起来即为age-specific survival rate(l_x)，l_x简要概述了整个种群的生存史。雌性特定年龄阶段的繁殖力(f_x4：雌性成虫是第四阶段)，特定年龄繁殖力(m_x)和特定年龄净繁殖力(l_xm_x)均在图2中显示，每天记录多种参数直到所有的个体都死亡。当处理组和对照组之间的数据相比较时，三组数据都表现出动态的下降，其中37.5℃组下降最为明显(Fig.2C)。尽管m_x的值普遍低于f_x4，但m_x和f_x4的曲线有着相似的动态变化规律。莲草直胸跳甲m_x和f_x4的数据显示，25℃和35℃处理组之间有着相似的变化趋势(图2A和B)，但在37.5℃处理组观察到了不同的产卵模式(Fig.2C)。在25℃和35℃组，繁殖力的峰值出现在年龄40～50天左右，之后在整个衰老过程中繁殖力逐渐下降，繁殖期在年龄为100天左右结束。而在37.5℃组，繁殖力开始保持连续的上升趋势，峰值出现在年龄60天左右，繁殖期在75天结束。在三个测试组中，莲草直胸跳甲的特定年龄净繁殖力(l_xm_x)在25℃和35℃组较高(Fig.2A and B)，但在37.5℃组该值始终保持很低，只能观察到有限的后代数量，繁殖期与m_x和f_x4一致，也明显缩短(图2C)。

莲草直胸跳甲的种群参数在表3列出。用于测量种群繁殖力的最重要的种群参数之一是净生殖率(R₀)，代表其生命期间个体可以产生后代的总数。数据表明，37.5℃组的净生殖率(R₀＝43.7)显著低于25℃(R₀＝198.6)，25℃和35℃(R₀＝213.0)组没有显著差异。此外，也计算了内禀增长率(r)，周限增长率(λ)，这些值表示在稳定的年龄阶段下莲草直胸跳甲种群的理论增长率。在37.5℃组r值为0.0899day-1，该值显著低于25℃(r＝0.1323day-1)。相似的，λ的值也从对照25℃的1.1414day-1下降到37.5℃组的1.0942day-1。而35℃组的r值(r＝0.1327day-1)和λ值(λ＝0.1420day-1)与25℃没有显著差异。尽管在37.5℃组的r和λ的值是最低的，但是其平均世代时间T(41.28)天，与对照25℃(39.94)和35℃(40.29)无显著差异。

3.HSP基因表达与莲草直胸跳甲高温耐受性的关系

利用qPCR对热激蛋白基因在莲草直胸跳甲卵期不同温度处理的表达进行了分析。如图3结果显示：Hsp90家族(只有1个)在25～37.5℃范围内随着温度升高其表达量有逐渐增加的趋势，但是在27.5～35℃范围内趋于稳定，差异不显著(P>0.05)，在37.5℃时开始大量表达，表达量较25℃增加到123倍，但当温度高于37.5℃时，Hsp90表达反而受到抑制，在42.5℃是表达倍数降低为13。

Hsp70家族在25-35℃范围内表达量逐渐增加，但也基本趋于稳定，差异不显著(P>0.05)，在37.5℃时开始大量表达，之后又回落至初始水平。特殊的是Hsp70-5，该基因在37.5℃时开始大量表达，表达倍数增加至2886，到40℃时表达倍数增加到最大为8877，之后又开始显著降低。Hsp60家族(只有1个)同前两个家族的表达情况基本类似，在37.5℃时达到最大表达倍数为38。Hsp40家族也均在37.5℃时达到最大表达倍数，表达倍数范围在23-50之间，其余温度基本差异不显著。

sHsps家族大部分基因在25-37.5℃范围内随着温度升高其表达量有逐渐增加的趋势。其中sHsp-1、sHsp-3、sHsp-12、sHsp-13、sHsp-14基因在37.5℃时表达倍数达到最大，范围在23至91之间。sHsp-11在不同温度条件下基本没有太大规律，与对照25℃相比，表达量范围在1.5至2.85之间，尽管差异也显著，但与其他基因相比变化较小。sHsp-9基因在37.5℃时大量表达，但表达倍数最大出现在40℃。sHsp-10基因随着温度升高表达倍数逐渐增加，在37.5℃和40℃时表达倍数增加至1103和1115，达到最大。sHsp-4、sHsp-5和sHsp-7基因随着温度升高表达倍数逐渐增加，需要注意的是这三个基因在37.5℃达到最大，且表达倍数非常高，分别为35286、6402和3962，并且在40℃时尽管与37.5℃相比显著降低，但与其他温度相比仍然很高，在42.5℃时逐渐回落。sHsp-2基因在37.5℃开始大量表达，但最大表达倍数出现在42.5℃。sHsp-6基因在37.5℃开始大量表达，表达倍数达到1720，但最大表达倍数出现在40℃，达到4494。sHsp-8基因仅在37.5℃时表达量增加，其余温度没有显著变化。

整体而言，27个热激蛋白基因具有明显的表达特征：27个基因中有22个基因的最大诱导表达温度为37.5℃，3个基因为40℃，1个基因为42.5℃，但这4个基因在37.5℃时也已经开始大量诱导表达。因此，莲草直胸跳甲热激蛋白基因的Tpeak可以代表其耐受极限温度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包在本发明范围内。

序列表

<110> 山西农业大学

<120> 热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2485

<212> DNA

<213> Hsp90

<400> 1

atttcgacta gaatgttcga gaggattcta aatcgcagta gggtataaaa gtcactgtct 60

gtagcggttt ccgtcagaat tacgtcaact gcgaaagcgt gttctactgg ggagtgatat 120

tccaaagtga ttttataaag agtttttaca aattataact caagatgcct gaagatacac 180

aaaacggaga tgtcgagacc ttcgcctttc aggctgaaat cgcccagctg atgagtctga 240

ttatcaatac attctactct aacaaagaaa tctttcttag agaattgatc tcaaactcct 300

cagatgcttt ggataagatc cgctatcaat cgctcacaaa tcctgcttgt ctagactctg 360

gaagagaatt ggaaatcaag cttgttccaa acaggaatga cggcacctta actatctttg 420

atagtggagt cggtatgacc aaagctgatc tagtgaacaa cttgggtacc attgccaagt 480

ctggaactaa ggcattcatg gaagcccttc aagctggagc tgatatcagt atgattggtc 540

agtttggtgt tggtttctat tccgcatact tagttgctga tagagtagtc gttgtatcaa 600

agcacaatga tgatgagcaa tacatctggg aatcatctgc aggaggtagt tttaccattc 660

gccctgacca tggggaacca ttgggtcgtg gtactaagat cattttacac attaaagaag 720

atcagactga attcttagaa gaaaacaaaa ttaaagagat tgttaagaaa cattctcaat 780

ttattggcta cccaatcaaa ttattagttg agaaggaaag ggaaaaggag ttaagtgatg 840

atgaagcaga agaggagaaa aaagaggaag aatctgatga accaaaaatt gaagacgtag 900

gagaggatga agatgaagac aaaaaggatg agaaaaagaa aaagaagaaa atcaaagaaa 960

aatataccga agatgaagaa ttaaacaaga ccaaaccaat ctggacaaga aatgctgatg 1020

atattactca agaagagtat ggtgaattct ataaatcact ttccaatgac tgggaagacc 1080

atttagctgt taaacacttt agtgttgaag gtcaactcga atttagagct ctcttatttg 1140

tacctcgccg tgtacctttt gatctttttg aaaacaagaa aaagaagaat aacattaaat 1200

tgtatgtcag aagagttttt atcatggaca attgtgaaga tctgattcca gaatacctta 1260

actttattaa aggtgtagta gactctgaag atttaccatt aaacatttcc agagaaactc 1320

ttcaacaaaa caaaatattg aaagttatca gaaagaattt ggttaagaaa tgtctggaat 1380

tattcgaaga actcacagag gacaaggatg gcttcaagaa attctatgaa caattctcaa 1440

agaacataaa gttgggtatt catgaggact ctcaaaacag agctaaactg gcagatttgc 1500

tccgttacca cacctctgct agtggagatg aggcttgctc ccttaaagaa tatgttagcc 1560

gtatgaagga aaaccagaaa catatcttct acattactgg agagaacaag gatcaagtag 1620

ctcactcagc atttgttgaa agagttaaga aacgtgggtt tgaagttgtt tacatgactg 1680

acccaattga tgaatacgta gtccaacaac ttaaagaata tgatggaaag acccttgttt 1740

ctgtaacaaa agaaggtttg gagttgccag aagatgaaga ggaaaagaaa aaacgcgaag 1800

aagacaaagc caaatttgaa ggactttgca aagtaatgaa gagcattctt gacaacaaag 1860

ttgaaaaggt cgttgtttcc aaccgtctag tcgaatcccc ctgctgtatt gtaacatctc 1920

aatatggatg gactgcaaac atggagagaa ttatgaaagc acaagctttg cgtgactcct 1980

ctacaatggg ttatatggca gccaagaaac acctagaaat caaccctgac cactcaatta 2040

ttgaaaattt gagacagaag actgaagttg ataagaatga caaagcagtc aaagatttag 2100

taatcctact cttcgaaact gctcttctta gctctggctt cactcttgat gaacctcaag 2160

tccatgcttc cagaatctat agaatgatca aattaggttt aggtattgat gaagaagaga 2220

gcatgttgac tgatgatgtg ccatctggag atgcacccgt agccgaatct ggtgatggtg 2280

aagatgcgtc ccgtatggaa gaagttgatt aagcatttga tttttcctgt ctaattaatg 2340

ggcatatgtt ctaatatgtt tttttcaaga gttttcattc cttatttttg tacatacttt 2400

tcgaagttac aatttttttg tactttttag tattactccg agatttgtct ctaggctgtg 2460

tagacattac ccaacgatcg gccgc 2485

<210> 2

<211> 2094

<212> DNA

<213> Hsp70-1

<400> 2

aatttttata atccagtcac gtgtttttat tacatttcac ctttaatctt ctcatttttg 60

tataaattca tgtttaacat taattcattt atttaaaagc aaatggccac agctaaacct 120

cctaaatatt cagtgggtat tgatttagga actacttact catgtgtggg tgtattcaga 180

aatggcactg ttgacattat ttccaatgat caaggaaatc gtacaacccc tagctatgtt 240

gccttcacag attttgaacg gctagtcgga gaagctgctc agaatcaagt ggccatgaat 300

cctgggaata ctatttacga tgccaaacga ttaattggca gaaaattcga tgatccaatt 360

gtacagcaag atataaaaca atggccattt gaagtggtaa atgaaaaagg aaagataaaa 420

attaaagtta aatacaaaaa agaagttaaa agcttttttc ctgaagaaat ttcctcaatg 480

atattggcaa aaatgaaaga aaccgctgaa gcttttttgg gagataatat atcaaaggca 540

gtcataactg taccagccta ttttaacgac tcacaaaggc aagcaacgaa ggatgcaggg 600

accattgccg gcctggatgt ccaaaggatt attaatgaac ccacagcagc cgcaatcgct 660

tacggattgg acaaaaaaga aaatgaaagc gacaggttcg ttttgatttt cgatttggga 720

ggaggcacgt tcgatgtttc cattctgctc atctctggag ggattttcga ggttaaatcc 780

accgccggcg atacgcattt aggtggcgaa gatatagaca acagaatggt tcaatatttt 840

accgaggatt ttaaaaaaaa gaacaagacc gatattaaag aaaataaacg tgcaataaga 900

cgacttaaaa ctgcatgtga acgagcaaaa agaactcttt catcaacaac acaggcgaca 960

atagaaattg actcgttagc ggaaggaatt gatttttact ctgaaatttc aagagctaaa 1020

tttgaagaga taaatcatga cttatttatg cgaacccttg agcctgttga aaaagccatt 1080

aaagatgcta aagtgaacaa aaagcaaatt caagaaattg tccttgttgg gggtagtaca 1140

agaattccaa aggtacagtc attactgtct caggcgttta acggcaaaga attaaataaa 1200

tccattaatc cagatgaagc tgtagcttat ggagcttcaa ttcaggctgc tgttttggca 1260

ggagatacac atgatgcagt acaagatgtt ctcttgctgg atgttacgcc actgtctctt 1320

ggtattgaga cagcaggtgg tataatgact acccttatta aacgaaacag cacaattcca 1380

accaaacaaa ctcagatttt ttcaacttat tctgataatc agcctggtgt tttaattcaa 1440

gtattcgaag gggagaggtc aatgactagc gacaataatc ttttggggaa gtttgagctg 1500

tcaggcatac ctccggctcc tcgtggtatt cctcaaatag aagtgacttt cgacttggat 1560

gcgaatggaa tcctaactgt cagtgccagc gaaacagcaa ctggaaaaaa aagtaatatt 1620

attattacca acgacaaagg caggttatca aaagaacaaa tcgataagat ggttagggat 1680

gcggataact accgggaaca tgatcaagaa aaaagggctg ctattgctgc aaaaaatgaa 1740

ttggaatcat atgttcatca agttaaattg cttacaacgg aacacaatat atcaagcact 1800

ctaagtccta cggacgttac caaaattaat actttgtgcg atgaaactag acagtggtta 1860

gtagaacaag aacacagaac tgaaagggat tacgtattaa aaaagcaaga attggaaaat 1920

atttgtaaac caattattgt ttcaatgtat tcaaatgcgt ccggaattac accaaaccag 1980

gaacaagcat ttagacgttt ttcagaaggg tcgtcccgca gagaaagcgg tacagatgac 2040

aatgcaggac ccgttataga cgaagttgat taaaatagta gtaacacata aacg 2094

<210> 3

<211> 2170

<212> DNA

<213> Hsp70-2

<400> 3

tttatgtgtt tctatatcta ggcagtgatt caaaatacgc tcagtttatt cacaacgacg 60

cgtcgtgaag tttctgcggt aacagtgcca cttaacacaa ggtaactgac caaaatgggc 120

aagactcctg ctataggaat tgatcttgga accacttatt cctgtgtggg agtgtggcaa 180

catggaaaag tggaaataat tgctaacgat caaggaaaca gaaccactcc aagttatgtt 240

gcatttactg acagcgaaag actcatcggg gatgctgcta agaaccaggt ggctatgaac 300

ccaaagaaca cagtgttcga tgccaagcgc ctcatcggca ggcgttacga tgaccccaag 360

attcaagaag acatcaaaca ctggtcgttc caagtattta acgattgtgg aaaacccaaa 420

atagaggtgg aatacaaagg agaggtaaag cgattcgccc ccgaagaaat cagctctatg 480

gtgctcacaa aaatgaggga gatagctgag acgttcctcg gaggaaaagt tactgacgct 540

gtggtaaccg taccagcgta tttcaatgac tctcagcgac aggccaccaa agatgctggt 600

gccattgctg gtctaaatgt gttgaggatt attaatgaac caacagcagc agcgctagct 660

tatgggttgg ataagaattt aaaaggagag aagaatgtgc ttattttcga tctggggggt 720

ggaacttttg atgtttctat attagctata gatgaaggat ctttgtttga agttaaatcg 780

actgctggag atacgcattt aggtggtgaa gactttgata atcgtttagt aaattatttc 840

gttgaagaat tcaagagaaa acacaaaaaa gacttgagta gaaacactag agctttgaga 900

cgccttagaa cagcttgtga acgtgctaag cgaacattgt cgtccagtac tgaagccagt 960

atagagatag atgccttgca cgaaggtgtg gatttttatt caaaaataac tagagctaga 1020

tttgaagaac tatgcatgga tctttttaga tctaccctgg aaccagtgga aaaagctctt 1080

actgatgcta aattggacaa aggaacgatc catgatgttg ttttggttgg tggatccact 1140

agaataccaa aaatacaaaa aatgctgcaa gatttcttct gtggcaaagc tttgaatcta 1200

agtatcaacc ccgacgaagc tgttgcttac ggtgcagccg ttcaagccgc catacttagc 1260

ggagatacaa gctcccaaat tcaagatgtt ctcttagtcg acgtggctcc tttatcttta 1320

ggtatcgaaa ctgctggagg agtaatgacg aaaattgtag agcgcaactc cagaattcca 1380

tgcaagcaac aacagacctt taccacgtac gctgataatc aaaacgctgt cacaattcag 1440

gtatttgaag gcgaaagagc gatgaccaaa gacaataatc tattgggcac tttcaacctt 1500

aatgggattc ctccagctcc tcgaggagta ccaaaaattg aggtcacctt cgatttgaat 1560

gccgatggta tattgaatgt atcggctaaa gatagcagca ctggaaaatc tgaacagatt 1620

accatcacca atgataaagg aagattgtca aaggctgata ttgataaaat gcttaatgag 1680

gctgagaaat atgctgctga agatgaacag cagaggcagc gaatcactgc tagaaatcag 1740

ttggaggggt acatctttag tgccaagcag gctgctgaag atgccccagc agataaactg 1800

acaccagaag acaagaaatt ggtgcaagat aagtgttcca gcgtgctagc ttggttagat 1860

gccaaccagc tggctgagaa agacgaatac gagcacaaac ttaaagaact tcagcaagag 1920

tgttcgcctg tcatgatgaa attgcatcaa ggagctcaag gtcaaggtgg tcaaggacca 1980

aaggtcgaag aagtagatta agatgtacca ctgatgtata aacactttgc caagatattt 2040

tataacaatt ttaagcttgc ttcaacagct tttgattttt ttttaaataa atgcatttgg 2100

tggatatatt tatgatagac gagacctaca ttaatttcat taaaaaaaaa gggttaaaaa 2160

acacagggaa 2170

<210> 4

<211> 2482

<212> DNA

<213> Hsp70-3

<400> 4

gtaacgctcc tcaacagaat tcagtctgtc aaagaacttg gaacgagtgt aatactaaga 60

aattgtttgt gcagggtgtt tttttcctaa ataagttaat taattgttat ttgctattgg 120

agtaacccaa actatgaggt tatatttggg attaggtgtg atcttattcc tggccggcgt 180

tttgggggcc aaggatgata aaaaggaaaa ggaagatgta ggcacagtta ttggaattga 240

tctgggaaca acctactctt gtgttggtgt ttacaaaaat ggaagagtag aaatcattgc 300

taatgaccaa ggtaaccgta tcaccccatc ttatgttgct ttcacagcag aaggtgaacg 360

tttgattggt gatgctgcta agaatcagct aacaacaaat cctgaaaata cagtttttga 420

tgccaaacgt ctcattggac gtgactttac agatcaaact gtccaacatg atttgaaact 480

cttcccattc aaggttattg agaaaaacca gaaaccccat atccaagtag aaaccagtca 540

aggaaacaaa gtgtttgctc ctgaagaaat ttctgctatg gtattgggca aaatgaggga 600

gactgctgaa gcctatttag gtaagaaagt tacccatgct gtagtcacag tacctgccta 660

tttcaatgat gctcaacgtc aagctaccaa agacgctggt actattgctg gtctgaatgt 720

catgaggatc attaatgaac caactgccgc tgctatcgcc tatggtctcg acaaaaaaga 780

aggagagaag aatgtacttg tatttgatct tggaggtggt acctttgatg tatctctttt 840

aaccattgat aatggtgtat tcgaagtagt tgctactaat ggtgacacgc atcttggagg 900

tgaagatttt gatcaaaggg tcatggatca cttcattaaa ttgtacaaga aaaagaaggg 960

taaggatatc agaaaagata acagagcagt gcagaaactt aggagagaag tggaaaaggc 1020

caaaagagca ttgtcgtcaa gtcatcaagt caggattgaa attgaatcat tctttgaagg 1080

agatgatttc tcagaaactc tcaccagagc caaatttgaa gaattgaaca tggatctttt 1140

ccgttccaca atgaaaccag tccagaaagt attagaagat gctgacatga acaaaaaaga 1200

tgttgatgag atcgttttgg ttggtggttc aacacgtatt cccaaagttc aacaacttgt 1260

taaagaattc tttggtggta aagaaccatc aagaggaata aatccagatg aagctgttgc 1320

ttatggtgct gctgtgcaag ctggagtctt gtctggagag gaagctactg atgctattgt 1380

gttattggac gtcaatcctt tgactatggg aattgaaact gttggtggtg taatgaccaa 1440

acttatccct cgtaatactg ttatcccaac aaagaaatcc caaatattct ccacagcatc 1500

tgacaaccaa cacactgtta ctatccaagt gtatgaagga gaacgtccaa tgaccaagga 1560

caaccacttg ttgggtaaat tcgatttgac tggtatccca ccagcaccca gaggagttcc 1620

acaaattgaa gtaacttttg aaattgatgc taacggtatc ttgcaagtat ctgctgagga 1680

caaaggcact ggtaacagag aaaaaatcgt cattaccaac gaccaaaata ggctaacccc 1740

tgatgatatt gatagaatga ttagagatgc agaaaagttt gctgatgaag acaaaaaact 1800

taaagaaagg gttgaagcca gaaatgaatt ggaaagctat gcttattctc taaagaacca 1860

aatcaatgat aaagataagt tgggagctaa attgtcagat gatgaaaaga cgaaaatgga 1920

agaagctatt gatgaaaaga tcaagtggtt ggaagaaaat caagacacag aggccgaaga 1980

atacaaaaag caaaagaaag aattggaaga tgttgtgcaa cccataattg ccaaactgta 2040

ccaaggtgca ggtggagttc caccaacgcc ttcaggcgat gatgatgatg agttaaagga 2100

cgaattgtga ggtgaactgt aggccaataa agactgaaaa aactgtatgc ttctgagtgt 2160

gaatggcatg tgtgatattt actttgtgga ttaatttcct tgtatttaat tttgtaattt 2220

ttgtacatta tttgtttcta gttgaaccaa ttagggtatg aaaatttcca aaatacgtat 2280

tccatgtaag aacttttttg tacaactagg attttgtaat tgtgaaagtt tggtctcaag 2340

gaggccaaga gtatttattt attttcttgt cagttacagg tgtatgactg gtaaacatgc 2400

tactttttaa tattttaagt gaatattttt ggtattgtac tcctgtattt gacttttgtt 2460

ttcccgtaat ttttcaataa aa 2482

<210> 5

<211> 2216

<212> DNA

<213> Hsp70-4

<400> 5

cgccatttcg aggcaaattc aaagttttca aaagtgtcag ttttagcagt gcatataaat 60

tttcgaggaa aaaaatggta aaagcgcccg ccgttggtat cgatttgggt accacgtact 120

cctgtgtggg agtatggcaa ggtggtaaag tggaaataat agccaatgat caaggaaata 180

gaacgactcc tagttatgtc gctttcacgg aaactgagag gctgattggg gatgctgcca 240

agaaccaagt ggctatgaac ccctataaca ctgttttcga tgctaaaagg ttgattggaa 300

gaagattcga cgaccaaaag atccaacagg atctgaagca ctggcccttc aaagtggtga 360

acgatggggg caaaccgaaa atccaagtgg aattcaaagg ggaggcgaag aggttctccc 420

ctgaagaaat cagctcgatg gtgctgacca aaatgaagga agtcgccagc gcctatttgg 480

gcaagtcgat caaggacgct gtgattactg tgcctgctta ttttaacgat tcccaaagac 540

aggccaccaa ggacgccgga attattgcag gaatcaacgt aatgcgaata atcaacgaac 600

ccacagcagc agctctggct tacggactgg acaagaatct gaagggtgaa agaaaagtgt 660

tgatcttcga ccttggaggt gggactttcg acgtgtccat attgaccata gatgaaggtt 720

ctctgttcga agttaagtcc acggcggggg atacccattt gggcggagag gacttcgaca 780

acagattagt caattacttc gtagatgagt tcaagaggaa gtacaagagg gacgtatccg 840

cgaaccccag agccctgaga aggctgagga cagccgctga gagggccaaa cgcactctaa 900

gctctagcac agaagcctcc ttggaaatcg acgcacttta cgaaggcatt gacttctact 960

ccaaaatatc ccgagctcga ttcgaagaaa tgaactcaga tctgtttcga ggcacgctcc 1020

aaccagtaga gaaagcctta aacgacgcca agctctccaa aggagacatt gacgatgttg 1080

tgctggttgg aggctccacc cgcattccaa aaatccagag tctccttcag agcttcttca 1140

acggaaaaac actgaacctc agcatcaatc ctgacgaagc tgttgcttac ggagctgcga 1200

tacaagccgc tattctcagt ggggattcca gttcgaagat ccaagatgtt ctgttggtcg 1260

atgtcactcc actgtctttg ggcattgaaa ctgccggagg tgttatgtcc aagattatag 1320

atcggaactc gaggatacct tgcaagcaaa cgcagacctt tactacgtac tctgataacc 1380

agcctgctgt gactatttgc gtgtttgaag gggagcgagc catgaccaaa gataataata 1440

ctttaggtac cttcgacttg tgtgggatcc ccccagctcc caggggagtc ccaaaaatcg 1500

acgtaacctt cgacttggac gcaaacggca tcctaaacgt gtctgctaca gaaaacagca 1560

ctggaaaatc gaaaaagatc accatcaaga acgacaaggg caggctgtcc caaagggaca 1620

ttgagcgcat gctcgctgaa gctgagcggt acaaagacga agatgataga cagagagaga 1680

aagtcggagc tagaaatcag ttggaaagct atgttttcag cttgaaacag gccgtttcag 1740

atgctgggaa caagttgaag cctgaggaaa agaagaaagt gaactctgaa tgtgatgcat 1800

gcgttaaatg gttggacatg aaccaacaag ccgataagga cgaatacgat tacaagttca 1860

aggaattgca aaagacttgt ggtcctgtaa tggtcaaact gcaccgtggc ggaacccccg 1920

gagggggcac tggtggagac caggatggtc ccaccattga agaagttgat taaatccagc 1980

aattttagca ccaaacgcta aacactaatt ttgacagaca gttgacgtat tttaggaaat 2040

tattttgtca gattttgtta acgtttttat atgtttgttt aatcactcat tccgaaggtt 2100

atttaaatgg tttaggaccc cttaggctca gattctactg tttttgaaga tgctacactg 2160

ctaaattttt tggtttattt acttgtaaca aaatttaata aaatttacaa cacgag 2216

<210> 6

<211> 2074

<212> DNA

<213> Hsp70-5

<400> 6

gcgtttgtca gttcattcat aacaagcaag cagtaaacgt gaaaagtaaa gtgcgtttag 60

aaaaaagttt tcaaagcgag tttattgaga aactgttaca ttgttattta tcgattatta 120

tccaatattt ttgtgaagta ttaaacttgg aaaataatgg ttaaagttcc agcaattggt 180

attgacttgg gcaccacata ttcctgtgtg ggtgtgtggc agcatggaaa agtggaaatt 240

attgccaacg accaaggtaa cagaacaaca cccagctatg tggcgttcac cgacaccgag 300

cgccttcttg gtgatgctgc aaagaaccag gtagcaatga atcccagtaa tactgtcttc 360

gatgcaaaac gtcttattgg tcgaaagttc gatgatccaa aaattcaaca agatatgaag 420

cattggccat tcaaagtagt caacgtgagt ggtaagccaa agttacaagt tcaattcaaa 480

gatgaaacca aagtatttgc gcctgaagaa ataagttcta tggttcttac aaaaatgaag 540

gaaacagctg aggcctacct aggaaccact gtcaaagatg ccgttatcac agttccagct 600

tatttcaatg actctcagag gcaagcaacg aaggatgctg gtgttattgc aggtctaaat 660

gttttaagaa taatcaatga accaacagca gcggcattag cttatggact ggacaaaaat 720

ttgaagggag aaagaaatgt tttaattttc gacttgggag gtggcacatt tgatgtttcc 780

atcctaacca ttgacgaagg ctcattgttc gaagttaagg ccacagctgg tgacacacat 840

cttggcggag aagattttga taataggctg gtgaatcatt ttgctgaaga atttaaaaga 900

aaatacagaa aagatttacg aacaaatcca agagctcttc gtaggttaag gactgctgcc 960

gaaagagcta aacgaacttt gtcatccagt acagaagcgt ctcttgagat tgatgctctt 1020

tttgaaggaa ttgatttcta tactaaaata agccgagcca gatttgaaga aatgtgttct 1080

gatttgttta gaggaaccct agaaccagtc gaaaaagctc ttagagatgc caagatggac 1140

aaaggacaaa tccatgatgt tgttcttgtt ggtggttcaa ctagaattcc aaaaatacag 1200

tcacttttgc agaattactt taatggaaaa tctcttaatc tgtcaattaa tcccgacgaa 1260

gctgtggctt atggagctgc cgttcaagct gctgttttaa caggagaatc agattccaaa 1320

attcaagatg tgttgttggt agatgtgaca ccactttcac tgggaattga gacagcagga 1380

ggagttatga ccaaaataat cgaaagaaat gccagaattc catgtaagca aacacagaca 1440

tttacaacat acgcagataa tcaacctgca gtcaccatcc aagtatttga aggtgagagg 1500

gccatgacca aagacaataa tctacttgga aactttgatt taactggaat acctcctgcg 1560

cctcgtggtg taccaaagat tgaagtaaca tttgacatgg atgccaacgg aatattaaat 1620

gtatctgcta aagacacaag ttctggaaaa ttcagaaata tcacaattaa gaatgacaaa 1680

ggcagacttt ctcaagcaga tatcgacaaa atggtagccg atgcggataa atataaagaa 1740

gaagatgaac gccagaggca gaaagttgct gcaagaaacc atcttgaggc atacgtcttc 1800

caattaaaac aggctttaca agataacgga agtaagcttt ctcctgaaga caagaacacc 1860

gttgaaaacg aatgtgagaa ttgcttgagg tggctagaca gtaataccct tgccgaaaaa 1920

gatgaatatg aagacaaaca gaaacaatta acgtcgatat gcagtccaat tatggctaaa 1980

ttatatcaaa gtcaaaatgg tcagtacaat ggtgaaatgc caggacagag ctgtggtcag 2040

caagctgggg gatttggtgg aaagtccaga ggcc 2074

<210> 7

<211> 2337

<212> DNA

<213> Hsp70-6

<400> 7

aatcgtagta ggaagatacc atggcaatgt atttgtgatt ggttgaaatt tggagttcta 60

gaatgttctt tgatgttctt ataaaaccag ccattgctac tttttcactg atttgatagc 120

agtcattgct gtagtctaca cataatttaa gtatttattg aagtattgtc tgcaactaga 180

ataattttaa gatggcaaaa gctccagcag taggtattga tttgggtaca acctactcat 240

gtgtaggtgt gttccaacat ggtaaagttg aaatcattgc caatgaccaa ggtaaccgca 300

caacaccatc atatgttgcc ttcacagaca ctgagcgtct tattggagat gccgccaaaa 360

accaggtcgc catgaacccc aataacacaa tttttgatgc caaacgtctt attgggcgaa 420

gattcgatga tggcgctgta caatcagata tgaaacactg gccttttgag gtagtaaatg 480

acagtggaaa accaaaaatc aaagtagcat acaagggtga agataaatca ttctatccag 540

aagaagtgag ttcaatggtc ttaaccaaaa tgaaggaaac cgcagaagct tacttaggaa 600

agacagtaac aaatgccgtc atcacagtac ctgcatattt caacgattcc caacgtcaag 660

ccaccaaaga cgctggtacc attgccggtt tacaagtttt acgtattatc aatgagccca 720

ctgcagctgc cattgcttac ggtttggaca aaaagggaca aggcgagagg aacgttctta 780

tcttcgattt gggaggtggt accttcgatg tgtcgatctt gaccattgaa gatggtatct 840

ttgaagtaaa atccaccgct ggagacacac atttgggagg tgaggacttt gacaacagaa 900

tggtaaatca tttcgtccaa gagttcaaac gtaaatacaa aaaggacctt accagcaaca 960

aacgtgcact ccgtcgattg agaactagct gtgaaagggc gaagcgtact ctgtcatctt 1020

ctacccaagc tagcatcgaa atcgattccc tctttgaagg tattgatttc tacacctcaa 1080

ttaccagggc tagattcgaa gaacttaacg ccgatctctt caggtctacc atggagcctg 1140

tcgagaaggc catcagggat gccaagatgg ataaggctca ggttcatgat atcgttttgg 1200

ttggaggatc tacacgtatt ccaaaggtcc aaaaattgct gcaagatttc ttcaatggca 1260

aggaattaaa caaatccatt aaccctgacg aagccgttgc ttatggtgcc gccgtccagg 1320

ctgccatttt gcacggtgac aagtctgagg aagtacaaga tctgcttctg cttgatgtca 1380

ctcccttatc acttggtatt gaaactgccg gtggtgtcat gactgccctt ataaagagaa 1440

acacaaccat tccaaccaaa caaactcaga ccttcaccac ctactctgac aaccaacctg 1500

gtgtgctcat ccaagtgtac gaaggtgaac gtgcaatgac caaggacaac aaccttttgg 1560

gtaaattcga actcactggt atcccaccag cacctcgtgg cgtgccccaa atcgaagtca 1620

ccttcgatat tgacgccaac ggtatcttaa acgttaccgc catcgagaag tccaccaaca 1680

aggagaacaa gatcaccatt actaacgata agggacgtct tagcaaggaa gatattgaaa 1740

gaatggttaa cgatgctgag aagtacagga atgaagatga gaagcagaag caaaccatct 1800

ctgctaagaa tcttttggaa agctattgtt tcaacatcaa gagcaccatg gaggacgaga 1860

aaatcaagga taagatctca gagagcgata agaacacggt catggagaaa tgcaatgagg 1920

tcatcgcttg gttagatgct aaccagttgg cagagaagga agaatatgaa cacaaacaga 1980

aagaattgga gaacatatgc aatccaataa ttaccaagtt gtatcaagga gctggtggtg 2040

ccccaggtgg tatgccagga ttccccggtg gagcacccac cccaggagca ggtggagctg 2100

ccgcacctgg tggtgctgga ccaaccatcg aagaagttga ttaaggtgtt tagttttgtt 2160

tactcattcc gaatattttg ttggtttcat caagatgtat tgtttaattt ttttgccagt 2220

attacttgca gacatagctt ttttaattgt acttttttta caatcgtttc gattcaatgt 2280

ttaaattact acagttgtaa cttcaaaaaa taaaaaagtc aaatccaaaa aaaaaaa 2337

<210> 8

<211> 2313

<212> DNA

<213> Hsp60

<400> 8

gttctagaac atttcatatc tcgattccaa aggtcggatc gtgcgtaacg taggaccggt 60

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aaaagatgtt agatttggct ctgaagtaag ggccctcatg cttcaaggcg ttgacgtctt 240

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ttggggttca ccaaaaatca ctaaagatgg tgtaactgta gccaaaggcg tagagcttaa 360

agataaattc caaaatattg gagccagatt ggtacaggat gtggctaaca acaccaatga 420

agaagctgga gatggtacca ctacagctac agtcttggca cgttcaattg ctaaagaagg 480

atttgataat ctagggaaag gcgcaaaccc agtagaaatt cgcaaaggta ttattatggc 540

cgttgaaaaa attacacaaa ctcttaaaac tctttccaaa cctgtgacaa cccctgaaga 600

gatctgtcaa gtagccacaa tatccgcaaa cggagataaa tctgtgggca acttaattgc 660

ggatgctatg aaaagagttg gcaaagaggg tgttatcact gttaaagacg gaaagacctt 720

aaatgatgag cttgaaatca ttgagggcat gaaatttgac aggggataca tctcaccata 780

ttttgtaaat accactaaag gagcaaaggt tgaataccaa gacgctctta tcctgctaag 840

tgaaaaaaaa atatcgtcag tccaaagcat tgtacctatt ttggaattgg caaatgcgca 900

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caaccgaaaa gcaacacttc aggatattgc tattgccact ggcggtatcg tattcggcga 1080

tgacgctaat attgtcaaat tggaagatgt gaaactttcc gactttggac aaatcggcga 1140

aattgtaatt accaaagatg atactcttct tcttaaaggt aaaggaaaga aagatgatat 1200

tgacaggcgt gctgagcaaa tccgggacca aatccaagac accacttctg aatatgagaa 1260

agaaaaattg caagaacgtc tagctagatt ggcatctgga gtagctgtat tgaaagttgg 1320

tggcagcagt gaggttgaag tcaacgaaaa aaaagacaga gtaactgatg ccttaaatgc 1380

taccagggca gctattgaag agggcattgt acccggaggt ggtactgctt tgttgagatg 1440

cagtgacagt ctagattctg tgaaagcaga aaataatgac caaaatgttg gtattcaaat 1500

tgtgaaaaga gctcttaaag tgccatgtat gacaattgcc agcaatgctg gagtagatgg 1560

ggccaccgtt gttgctaaaa tagaacaaaa agatggtgat tatgggtacg atgccctcaa 1620

taacgaatac gtcaacatgt ttgaaagagg tatcatagat ccaaccaagg ttgtaaggac 1680

agctattgta gatgcgtctg gtgtagcctc acttctcaca acagcagaag ccgtcatcac 1740

agaaatacct aaagaagaac ccgcaattcc agccagcatg ggcggaatgg gtggtatggg 1800

aggcatgggt ggaatgatgt aaacttctct gcgcttcgca acagactgaa gagcaattgt 1860

acccgtaggc ttgccactgt aaattataaa tttcagctta gcagcttcta aaataccgtc 1920

aataattttt actgcctttg aaaattactg gtgatcgcct acgtttataa attgctgttt 1980

atcttaaatt gagtgatgca aatctgtcaa aaaaattcca ttttcgtctt tgacagagaa 2040

actttttgtg ttttgttatt aagttctcaa taaatccatt cgtgtatagt ttctattata 2100

ttgcgacacg aattaaaatt ttgtgtgaat aagaagttta aatttttcgt ataagtgcca 2160

aagaaagttt ctcagctaat gggagccagg gcatatgctg aaaaacttat tttgctcact 2220

gaactgatct gcatttagct ccaggtgaat agtctttaaa tgaatctgaa gagatggtat 2280

attgttgtaa atatattgtt atttttaaaa aaa 2313

<210> 9

<211> 1931

<212> DNA

<213> Hsp40-1

<400> 9

ggtgcgtgtt ggtacttaat gataataata tattaatgat ttttgttatt attagtcata 60

aatagaataa tttttaaaaa ttgatcatct tatattttag tttatcgtgc ccaatcatta 120

gttcacgtgt gtagttgcaa ataaaatgaa gatttaggac gaaaagtttt ggcctagtcg 180

ttatcttttc caaaccattt caaaataatt tttagatatt tattcaaaac ctggggtata 240

gaacacactt ggcaccacca tggtggacta ttacagagtc ctcgaggtgt caaagacagc 300

ttccacagct gaaataaaaa aagcttaccg aaaactagca ttaaaatggc atcctgacaa 360

aaaccccgac aacctggaag atgcaaccaa gaaatttaaa gagatttctg ctgcctatga 420

agtattatct gacgatacta aaagaaaaat ttacgatagt cgcaacaaca ggagtagttc 480

tgcaaagtcg aggtcccaca gaagccattt ctttgacggt cacaatcctt tttcgcagag 540

acattttgag aaaaagaggc gtgtatacga tcaatatggc aaagatggct taatcaacgg 600

taacagccgc acgcgttgtc gtcatgaaga tgattttgat ttgggcgact tcagcttctt 660

cagctttaga gatcctgagg atgttttcag ggatttcttt gggggttcgg tattcgattt 720

atttgaacca atggattcaa gaagaagaca cagacattca cacccgcaac aaaatgtctt 780

aagcaattca tctttgttct catttggtct actaatggat gactttttca ctggtagctc 840

acattcaagt ggatttaact cattaaatgt acatagttct gaactttttc ctagtaactc 900

aaacgttaaa agaacgtcta cgtctaccaa gtttatcaat ggaaagaaga taaccacgaa 960

gaaaatatat gaaaacggaa aggaaactgt gatgtcctac gagaacgacg ttttaaaatc 1020

aaagactgta aacggagttt ctcaaagtat aacttacagt taaatgattt catcaactat 1080

ctctttattt acttatagct taattgtagt acttacacaa ccttcattga tgtacatgtg 1140

attttaatgt aggaatactt gtaaaagctc aatgctccta ggtttgtaag caggaacttt 1200

ttttttaatt attcaagagc tgatgttgct gcataaagac caaaattctt taattacatg 1260

aatgtattat atgtcattat atttgtcgaa agggatgatg tgttttcagt ctttcaatct 1320

ttagttttaa gtaataacgg agaagcactg acgatattgg aaccgctggg ctttgctgac 1380

attcacgata aactaatgct gtaattgcaa agtttaattt tatctgctta tatttcttca 1440

atatgaatac tgctgaaggt attaactaaa atatgtataa agtaaatagt tttccagctt 1500

ttttgctttt gtcgacatgc tttacaaata tgagtttctg tatccttacg tgttatgttt 1560

ttgtagtgac tccatacctc tttcatcata cgatctcttc tgcctcgtgt cgtatgaata 1620

actcacatgc ctagtaaata atattgcatg taggtttttt agctgttgtt ttttccgtag 1680

cattaactat tcatcttcaa tataagcggt gttcttagcg tttattaaat gtatagtctt 1740

cataggaaat gtgtctaata taattcattt cacacatttc tggcggtttt aggtattcca 1800

tacaattctt aggactttta tgactgatta catacatttc tgttaatata tatttataca 1860

agcaacaata aataaaacat taattattaa ttcataagta atatttaaat attggatgaa 1920

atatagacag a 1931

<210> 10

<211> 778

<212> DNA

<213> Hsp40-2

<400> 10

ttaggaaaag acaaaattat acttttccat gaaaattaat aaaacaatat ttatttaaga 60

aactgctatg actgattatt accagatttt aaaggtttca aacaatgcta ctacagatga 120

aattaaaaaa gcctacaaaa aactcgcttt aaaatggcat ccagataaga acctgaacaa 180

caaagaggaa gccactaaaa ggtttcgtga aatttcagaa gcatatgaaa ttctttcaga 240

cagcaccaag agaagaagtt atgacaccta tgggactgca gacccacagg cgcacgcttc 300

gtttgatcaa gaagactttt tcggttttgg agcagctttt catttcaatt ttagagaccc 360

agaagaagtt tttagagagt ttttcggcag cagcgtgttc gatttttttg ccgaagattt 420

tccaacgcca catgcgggtc atagaggtca tagaaacagg tacagtagac gtactggaaa 480

tcgccgacgt aacgaggtct ccattttttc accgctaggt gccggatttt ttgaaggatt 540

tttctcctct ccaagggaga tgcatagctc cttcagtgtt cataacaatg ctcctacaag 600

ttcatatgca aggaaggtgt caacttctac aaaagtgatg aatggaaaaa aaattacaac 660

gaaacgaatc gtcgaaaacg gacaagaaac tgtcatgaat tttgaaaatg acgtcctaaa 720

atcgaaaaca gttaatggag tcccccaatc tattgagtat cattaaagaa aacgggcg 778

<210> 11

<211> 1287

<212> DNA

<213> Hsp40-3

<400> 11

aagaataaat catggttacg ttaaatattt gacaattatc ggtgaacaat tgacacagtt 60

gagtggttgt ggtttttatg tttaaaacgt ggcggttcat ttgttacttc taaatagtta 120

tcgtaaaata tgttaactta ttttaatact atcgtttgct taattttaat aacagaagct 180

tcagttaacg cacaattgtt ggaaggacta tattgtggta aagaaaattg ctatgatgta 240

ttagaagtaa caagagaatc cactaaacat gaaatcgcta aaaactacag aaagcttgct 300

agacaatacc acccagatct ccatagaact ctagaagcta agaaaactgc tgaggaacga 360

tttaaagtaa tagctactgc ttatgaaatt ttaaaagatg aagaagcacg agctgattat 420

gattatatgt tagacaatcc agatgaatat tatgctcact attatcgata ttatagaaga 480

agagtagcac ctaaagttga tgtaagactc gttcttattg ttactatttc tataatctca 540

gcaatacaat actatagtgg atggcagaga tatgatagtg ctatcaagta cttcatgaca 600

gtgccaaaat atagaaataa agctttagaa attgcaagag atgatggctt gttagttgaa 660

gacaaaaaat ttaagaaaaa caaaaaagaa ctgaaagaag agactgaaca agttataaga 720

aaagtaatag aagataaaat ggacataaaa ggggcatacg caaagcccag tgttactgat 780

attttatgga ttcagctcat tatattacca tatactgtat gtaaatatat ttattggtat 840

gtgtcttggt tttggaaaca tacaatttta aaacagccat ataatgaaga agaaaaattc 900

tatatcatcc ggaaatacat gaaaatgaat gagcatcaat ttaaaagcca agatgactat 960

aaacttgaag aatttttaaa acaggaatta tggattaggg aaaattttga tgaatggttt 1020

aaattagaag aggaaaaagc taaaaagcaa ctagcagaga gcaataaata caaacaatac 1080

cgaaggtata ttaaaaatca tggtatagga agaatgacct ttgatgattc ataatatgtt 1140

atatcaattt aggagactta cgtgatcatt tggtaatttt atttatttta aagtattgtt 1200

tactttgtca atgttttata tgaagaatac ttttgttaac tgtttaacta aattgttctc 1260

cgattaaaat aattaaactt tgagcag 1287

<210> 12

<211> 698

<212> DNA

<213> Hsp40-4

<400> 12

gtcatttcca acatattttg atattttacc tgaaacctgt caatcaatta attgtgaaaa 60

gcattaccct catggggaga gactattacc agatattggg tattagaaaa aatgctacag 120

acgatgaaat taagaaggcc tacagaaaac tcgccttact gtaccacccc gataaaaaca 180

agacaccaga agctgaagag aagttcaaag cagtagctga ggcctatgaa gtcctttcag 240

ataaaaagaa gcgagatata tacgacgctc acggtgagga aggtcttaag tgtggagtcc 300

ctaacggtgc tgggtacgat gggcctagct acacatatac ctttcatggt gacccaagag 360

caacttttgc tcagtttttc ggtaacatcg atccatttca agatttcttt ggttttcatg 420

atcattttca aaggggcgga gtgggtccac atcattatca cagtgaccct tttgggcagt 480

ttgcttatta tggaggacaa aaccatctgc aagcacagca acaagatcct cccatagaac 540

atgagctgta tgtatcgcta gaggatattt tgacaggttg tacaaaacac atgaaaatta 600

acagaaaagt aatcagacac aatgctgtgg aacgagagga caaagtcctg agcataaacg 660

tcaaaccagg ttggaaagca ggcaccaaag tcactttc 698

<210> 13

<211> 1396

<212> DNA

<213> Hsp40-5

<400> 13

aagaattttc attggtgtgt aaattgatag tttcttcgcg ttaagctgac attcgtagta 60

gaaaatgtgg tgttggtcat aaatttgctg ccactttaaa aacaaaactg tgataaaatg 120

tactaatctt aatatttccg tagaattata gtgttaaata actctttcgc catgaacata 180

atagttttac agacgttctt actgctgatt atccagttca ctgctattgt tttagcagga 240

agagacttct atagaatttt aggtgtatca aagtctgcaa gtttacatga agtcaaaaaa 300

gcctacagga aattagccaa agaactgcat ccagataaaa atcagggtga tccagaagca 360

gcacagaaat tccaagattt gggagcagct tatgaagtac tttctgacga agaaaagcga 420

aagaaatatg atagatgtgg ggaagattgt cttcaaaaag atggtatgat ggacggaggt 480

atggacccct ttgctagctt cttcggagac tttggctttc attttggtgg tggtgaacaa 540

aaacatgaaa cacctagagg agctgattta gtcatggata tatttgtcac attagaagat 600

ttatatactg ggacattcat cgaaattact cggaataaac cagtattaaa acctactagg 660

ggtacaagaa agtgtaattg caggcaagag atgattacaa aaagtctagg acctggaaga 720

ttccaaatga tgcagcaaac tgtatgtgac gaatgtccta atgttaaact tgttaatgaa 780

gagagattgt tggaaatgga agttgaacag ggcatggtag atggacaaga aactaagttt 840

gtagccgaag gcgaaccaca tttggatggt gatccaggag atttaatttt aaaaataaaa 900

acacaaccac ataagtattt tgaaaggcga ggggatgatt tatacacaaa tgtcacaata 960

agtttacagg atgctttgac tggtttcaca atggagatac cgcatttaga tggacacaga 1020

gtcagtatag ttagagataa aataacctgg cctggagctc gtatcagaaa gaagggtgaa 1080

ggtatgccaa actatgacaa caacaactta catggtattc tgtatattac ctttgatgtt 1140

gaatttccca aacaagagtt cactgaagaa gaaagagaag gtatcaaaaa aatactaaat 1200

cagaactcaa ttaacaaggt atataatgga ctacgaggat attaagtgtc gtatgaatag 1260

aaatagttct acaatttttt tgtaaaaact gttcattctt agttcaatta tttattttgt 1320

tcctatttat tattacacca tttttgtaca taaacaaccg atttctaaat atatgtgtac 1380

agtaaatgta gcacag 1396

<210> 14

<211> 636

<212> DNA

<213> sHsp-1

<400> 14

caggcaagct gtgccggtga gtgaagttga agtttgattt gactactgtg aattgtgcgc 60

gttttaaata aagtgaagga aagataaata cataatttaa aatggctttg ttcagacatt 120

tattagatga tccctattgc attcgaccat caagaatgtt taatcatcgt tttggcgatc 180

tacttgaaga tgaggacttc gttttaccct tacttgctag gaagatgcgt ttacaaagac 240

cagcaaaata tattcgtcat aagacacctc tgtctctgaa aaagaactct gattccacat 300

tggaatacgg aaaagataga tttaatgcca atatagacgt ccaacatttc catcctgaag 360

agattacagt taaagttaca aatgacaatg ttataacgat tgaaggtaaa cacgaagaaa 420

aagaagatga acatggagaa atttatagac actttgttag aacaattaca gttccaaaac 480

aatatgatat gagtaaaatc gaatccaaat tatccacaga tggtgtgctg tcagtcacag 540

ctcccagaaa cggagctacc caaacataca aaaacattcc aattacccaa actggagaac 600

cagctaaatc ggttgagaag aaagaagaag gggaag 636

<210> 15

<211> 775

<212> DNA

<213> sHsp-2

<400> 15

ttttacaaat ggcaaatgtt cactcatcta tttataaaac atttaaatca tagcaatcga 60

gtttgtttgt agtcaagtaa acaacgggca ttcgaaaaaa taattttgct gtgtcaataa 120

agatagtcca gcttaaatta accgaaaatg tcccttttac cgtatctatt ggatgatgcc 180

cctttcattc ggccatcaag gctattagac caacacttcg gcatgatgct agatccagaa 240

gacatgtttc aaccaacggt aaacttccca agactatttt tgcgcagccc tacaggatat 300

atgcgtaatt ggaaatcaac agcgtctcag agagacaccg gttctacagt tgattttggt 360

aaggaccagt ttgttgctaa tctggatgtt cagcagttca aaccagaaga gattactgta 420

aaaaccacag gtgataatac tgttacgatt gaaggtaaac atgaagaaag agaggatgaa 480

catggacaaa tatacagaca ttttatgaga acctataagt tgccaaagca atacgatatg 540

accaaaattg agtcaaaact gtctacagat ggagtgctgt cgattgttgc accaagaatt 600

gatgcggagc acattcaata taaagatatc cccgttatac agactggggc accggctaaa 660

aaggctgttg agaagacagg agatggcgac aaaaactagt gcttttttgt caaattccat 720

cacaattttg gtaatttttg tccaatattt tttgtataat atgttttaat ggtgc 775

<210> 16

<211> 773

<212> DNA

<213> sHsp-3

<400> 16

cgccggcaaa caactgatta aagtcaacga aagtgcaagc gcgatacttg tcaaacgaag 60

tgttatcgag tattttacct gaaaaaatgt ctctcatccc atttttattc gacgattctc 120

actttatacg accatccagg attttagatc agcattttgg cgatatcctg ggtgtagaag 180

atttgctaca accggtcaac gtaccaagag tgcatttacg ttgtcctgca ggttatgtcc 240

gcaattggaa gtctgcttca tcatctcaag atgccggttc gacagtagat tttgggaaag 300

atcagttttt ggccaattta gatgttcaac aatttaaacc tgaagaaatt tctgtaaaag 360

taacgggtga gaattccatt acaattgagg gtaaacacga agaaaaggag gatgaacatg 420

ggcatattta cagacatttt gtaagaagat ataccatacc gaaacagtat gacatgagta 480

gaattgaatc caagttgtct tctgatggtg tattgtcaat ttctgctcct aaaattgatg 540

ccgatcaaat acaacacaaa tctattccca ttacgcagac tggtgaaccg gcgaaaagag 600

ctgagatcaa aggggaagtt gaaaagaaag gagaaggcga aaagtaatta ttttgtattt 660

ttgtgtatta ttttgtagta ttttcgtatt tacgttaact gcatttattt gagactgagt 720

tataccaata tcataatgtg ttcacattaa tgtaaattgt gtgtccaata aat 773

<210> 17

<211> 652

<212> DNA

<213> sHsp-4

<400> 17

gtcaatttag ttctgttctt gacacaagta taatattaat aaagtaaagt gttattttaa 60

aagttgtaaa agaggataca taaaaaatgt ctctcattcc atttttgctc gacgattcct 120

attttctgcg accatccagg attttggatc aacattttgg cgatatcttg aatgcagacg 180

atttggttca accagttaac gttcccagga tgctgtttcg ttgcccagcc ggatatattc 240

gaaactggaa atctgggtct tcagctcacg atgctggctc tactgtcgat tatggtaaag 300

atcagttttt ggcaaatttg gatgttcaac agttcaagcc tgaagagatt tcggtgaaac 360

ttacaggtga aaattcaatt acaatcgaag gcaaacatga ggaaaaggaa gatgaacatg 420

gacatattta tagacatttt gtgagaagat attctctacc gaagcaatat gatgtcagta 480

agatccaatc gaaattatct tcggatggtg tattatcaat ttcggctccc agaattgatg 540

cagatcaaat tcagtataag agcataccca ttacccacac aggagagcct gccaaagttg 600

ctgagaaaaa ataattattt tcttttttat taatgctaat ttttaagact gg 652

<210> 18

<211> 709

<212> DNA

<213> sHsp-5

<400> 18

ggtgaatcta caagttgtac gtggagcgtt ataaagtaat ttttggtgat ccttaatcta 60

aaaaaatgtc gttacttcca ttaatactta gcgattccta cttcagacgc ccatccagaa 120

tcttggatca acgttttgga gatattctgg aatcagatga tttgctgcaa cccgttaatg 180

ttccgagaat gatgttgcgc tatccatctg gttacctacg aaattggaaa tctgcatctt 240

catcccgtga tgttggttca acagtagatt atggaaaaga tgaatttttg gcgagtctgg 300

atgttcaaca gtttaaacct gaagagcttt ctgtgaaact cacaggtgag aattcaatta 360

ccatcgaagg aaaacatgaa gaaaaagaag atgaacatgg ccatatctac agacattttg 420

taaggactta tattataccg aagcagtatg atgttagtag agttggatcg aaattgtctt 480

ctgatggggt gttgtcgatt acggctccaa gaattattga agaagatcaa gtgcatttca 540

aaactattcc tataacacaa actggagaac cggctaaact agctgagaaa aaagaaggcg 600

agaagaagtc gattgaaaag aaagataaat agaaaaatac atttttttct tgtttcatat 660

attatagttt aagactgatt gatttttttt gtatctttta cttcggccg 709

<210> 19

<211> 609

<212> DNA

<213> sHsp-6

<400> 19

ttcagtcagt ttttaaaaag tcgtagacat tgtcaaatcg ggctataata ttgcacaact 60

tttcgtaaaa ttacaggata aaatgtcgca tattcctatt atttttcgag agtttcttcg 120

tcctttgaga atgatggaat atcaaatgag acaagctgaa gaactgcttc gcccctcatt 180

aaatcatttc aattttccaa gagttcggct ggagtatcct gatgaagcat ttaaagaaga 240

atctgttgta gacgacaagg ataaatttca aataaaaatg aatctgccag atttcaagcc 300

tgaagacatt gccattaaaa gcttagatgg gaatacactt caaatagaag caaagcatga 360

actcaaaaat gatgatcaaa acggttatat tctgaggcaa gtacttagaa agtttgtgtt 420

gccaaaagga catgatatta aaaatgcata ttccactttt tctcctgaag gaatacttac 480

ggttactaca cctaagaaga tgcaggaaat tgaggagaag cctattccaa ttacccatga 540

gagtacaagt caagaatcca aataatctag ttatgagttg tagttacgat ttgtttaaat 600

ttcttgaat 609

<210> 20

<211> 658

<212> DNA

<213> sHsp-7

<400> 20

gagtatatat accggggaaa atttaagtaa gccgttatta taaacaagtg aattaaacgc 60

gaagttgtca attgtggcat ttgatttaat aatctctcaa acagtattgc gtgctaatta 120

gtgctgtaaa atctgataaa atgtctcttt taccactatt gtttgacgac agatactggg 180

gagtcccaaa ccaacgccga attgtacctc accagaacta ttggagcgac atactagaac 240

cgttatctct agtaaatagc ctcatacaat cgcctgagta tacagaactc caaagccgag 300

gctccacatc cattgacaaa gacaaattcc aagcgaactt cgatgtccag catttcaaac 360

cgaatgaaat agtggttaaa gttggtgaag ataacagtgt aactattgaa gctaaacatg 420

aggaaaaaca ggacgagcat gggcatatct tcagacattt tgtcaggagg tacgtgttac 480

ctaagaattg tgacgtaagt agattggagt ccaagttgtc ttctgatggg gttctgagca 540

ttactgcccc tactatagat aataaaaata gtgaagaacg cacgattccg atttcccata 600

ctggtatgcc agcaatgaag gagcagaagc cagaatagaa gaaggaaact gtcatgag 658

<210> 21

<211> 463

<212> DNA

<213> sHsp-8

<400> 21

caaaataaaa gtcaccttaa attaaaaatt gatctttata aaaatgtctt aaaatgacat 60

gggcctggaa atcaaccaaa ttacaagtac caataaagca atgcctctct ttcatggaag 120

ataagtgttt tcacaatgca ttagccaccc tcaaagaatt cggtgtcgac tggtcagaca 180

tagccatatg caagcgaaaa gattcttcag acaaaaaaat ggacgcagta ttctttcaca 240

aagaccgatt cgaacttttg gtagacgcaa gagggttcac tccaaacaat atcaaatgca 300

aaatgacgcc cacttttatc gaaattctag gacatagggt cgaagagcct cttaatggaa 360

gtaagagcat gtctttggca cggaaatacc aattaccaca agctgtgaaa ccagaagaag 420

gcaactgctg cttttcaacg gaaggcatcc tactagtgac ggc 463

<210> 22

<211> 556

<212> DNA

<213> sHsp-9

<400> 22

tgtttactta gctgtcaaca ttatagcagt aaatctttcc ttgaatgtac ccaaaaatta 60

tagcaactaa aaaatgtcga ttttgccaga aaacaagaag gtttgtaaag aatgcggaag 120

accagccaat tctttttggg aggaaatgct gagcccttgg ccaacagata ttctgatgag 180

aaacttcttt tcacacagtc caatgccgct agacaactca atcacttacg acaataatca 240

ttttcgagcg aattttgatg tgcaacattt caaacctgaa gaaatttctg ttaaagtgat 300

acctaaaaac aatactgtta ctatcgaggc taaacatgaa gagagacgaa ataaccatgg 360

ccatatttat aggcattttg tacaaagata tactttgcct aagaactgtg atgtacagaa 420

attacagtct aggctaacat ctgatggggt tttgagcatt tgtgctccaa cggaaaatgg 480

ttgcagcgaa actgttattc cagtttgtgc aacgaaccag ccaccaaaca ttgctgctag 540

gaaaaatcat catgag 556

<210> 23

<211> 845

<212> DNA

<213> sHsp-10

<400> 23

ccgaaaacgc cgcgaattat ctggaaggag tatagctttg tatataagcg gtcttctcac 60

agagctacct cagtttgaaa ttttcgatag cgcagaaagt tgtcaatagt aattgagtga 120

taagtgattt attgtcaaag tcaagctaaa aactcagaaa aaaaatgtcg atgattccat 180

ttttgttggg tgattcctat tttaaccgcc catccagaat attggatcaa catttcgggg 240

acatccttga actacaagat ctactggagc ccgtaaatgt cccaagaatg ctattgcggt 300

atccagctgg ttatgtgcgc aactggaaat cggcatcatc ggcacgggat gttggttcaa 360

ccgtagatta tggaaaagat caatttttgg ctaacttaga tgtccaacag tttaaacctg 420

aagagatttc tgtgaagctt acaggtgacc attcaattac gatcgagggc aaacatgagg 480

aaaaagcaga cgaacatggg cttatttaca gacattttaa aagaacttac tctttaccta 540

aagagtacga tgtaagtaaa attgaatcaa aaatgtcttt agatggggta ttaacaattt 600

cggctccaag aattaatgaa gatcaaatac agtacaagac aattcccatt actcaaactg 660

gcgaaccggc taaagtagct gaaaagaaag aagagaaaaa agaaatcgag aagaaaaaag 720

aaatggaaaa gaaaaaataa gcaaagttaa aagtacctac ctatgtacta attattaaaa 780

cagtttaaga ctgaagtttg gtttttgtat tttttatttt gataaataaa ttttaagttc 840

ccgaa 845

<210> 24

<211> 1084

<212> DNA

<213> sHsp-11

<400> 24

caacgcggcg acttctctct ttatccatct cgatttcgtt gattgtgtat ggaggtgtat 60

acaagaatcg agaattgcgc aagcacctcg tcggcggcat cggttcccct cgaggacgga 120

catttctatt taaaaccatc catccctggc ggtcgcgtaa gttattcatc cgcagacttc 180

gagcgctagt aacccaagtg actttctgtc ctcttcattc gtgtgcagtg acgttcaaag 240

aaaagtgcaa ttttcatcat gtccgaaggc aacaaacgca acattcccat taaaatgggc 300

gacttcagtg ttattgacac agaattcagc agcatcagag agcgcttcga tgcagaaatg 360

cgaaaaatgg aagaggaaat gagcaaattc cgttctgaat tgatgaatag ggaatccaat 420

aatttcttta ggagcacgac aagtaccaca acacaatcca gcacaggagg tacagatgta 480

gcgccccgac ctccagcagc tgatgtcagg acatggtatg acgatttaaa ttcaccctta 540

atccaagaag atggaaataa caaatgtctc aagctgaggt ttgacgtaag ccagtacgct 600

cctgaggaaa ttgtcgttaa aaccgtagac aacaaattgt tggtgcatgc caagcacgaa 660

gaaaaaacag aatcaaaatc cgtttatagg gaatacaaca gggaattcct gttacccaaa 720

ggaaccaacc ccgaaaatat taaaagctcc ttgagcaaag atggtgttct aactgtggaa 780

gctcctctgc ctgctcttac atctggagaa aaattaatac cgatacaaca ttgatcaatc 840

attgtgtaaa ctatttttta attaaataaa aaaatcttaa caactgttta atgttcacgg 900

ggctttatca tgcaaaaatg aaattgtttc gcaaacaaaa cagaattcat tgttaataac 960

ttatttttct ggaaaaaaaa actgatatgc taattgatat tttgttaaat ttttttgaag 1020

gtctatcggt gtttaaataa ccagcaagaa attatcaccg tagtataaca aattgtatcg 1080

ttcg 1084

<210> 25

<211> 657

<212> DNA

<213> sHsp-12

<400> 25

agctggaata ctgttgcaac tgactaattt acacaatcct gtgtatatat tctccgctcc 60

acttgaacaa atccagtttt atcagtggtt cagaaagtga aactggaaga tcctattgtc 120

ggaataatat atcaagatgt cagtagtacc acttcttttc cgtgactggt gggatgaaga 180

agacctcatc cgtccatctc gccttctgga tcagcacttc ggtgtcggtc ttcgcagaga 240

tgaactcatc aactccctca gctcttggcc caggaggtca cgtttgagca actacgtcag 300

gccctggtcc accactggaa cagagcttca aagacaagac tctggatcca ctattactca 360

ggacaaagat aaatttcagg taatcttaga tgtccagcaa ttctctccaa atgaaattac 420

tgtcaaagta aacggaaaca gcatcgtcgt cgaaggtaaa cacgaagaaa aacaggatga 480

acacggtttc atcatgagac acttcgtccg aagatatgta ctcccctgta cgcacgatgt 540

caacggtgta gtatcttcat tgtcttcaga tggtgtcttg acagtaagcg cccctaaaaa 600

gaatgaatca cttccaaaca ctgaacgtgt ggtgcctata actaaaacag gccctgc 657

<210> 26

<211> 590

<212> DNA

<213> sHsp-13

<400> 26

cacaagtcca aactgttatt tttattaaaa aactatttgc ttagagaatg aacgtttttc 60

ccaccattct tcgagaattt gccaagccat taaaattaat tgagaaacac atgaaactag 120

gagatgactt ctttcgtccc aaggtgaatc tggagttcct ggacaaaaat gagtttatcc 180

aagatagaga tatggtgcaa gtaagattac ctgtaccgga atttaagcca tcggaaataa 240

ctgttaaaac tgtagatggt aatgcaattc aagttgaagc tagacaaaag gaagaaatta 300

acaacggtga ctttgtagga aaatatttta tacgcaggtt tgtagtgcca tttggcacgg 360

aattaaaaaa tgcaaaatcc agtctttccg aagatggtgt cctggttata actgctccga 420

gaaatatcaa agatttagaa gaaagaataa ttcccatagt tgctgatacc acgattgagt 480

taaagaagat ctccagtcct taatcttctt gggcgatagt tctagtgcgt tcttagtact 540

aattatttta caggtagata ctgttagata aagaaataat tatattgggc 590

<210> 27

<211> 1183

<212> DNA

<213> sHsp-14

<400> 27

attttaaatt tcaattaggt ttgaaaaata cataagtttt tgaaactaag atgccaatcc 60

cagaagaaat aaaaaaagtt tatattacag aaaacagagc cattcgtgtt taaaaatgtc 120

ttaaaatgga acatattaga ctggaaacta gataattgga aagcagcttt tcaggattgt 180

agctttgaat ttagatgtgg taagaattta ccatcgcaaa atcctcagtg ggaaagagat 240

actcaaacag taacaggtga ttttagcttt tttttacaga aagctgaaaa caaagaaaac 300

tggttatatt ttgattataa acacttaaat gcgtggttga caaatatcaa ggatctaaga 360

gagggtatag attggagccc cttgggtttc ccagaagtga aaccagagga ttgtacaatt 420

tggataggta caagtggagc tcatacgccg tgccatatgg attgttatgg ttttaattta 480

attcatcaaa tatatggcaa aaaaatgtgg ctgctatttc ccccagaaga gaatttaatg 540

cctaccagag taccatatga agagtcaagt gtatattcca gattaaattt ttttagcccc 600

aaaatagaaa attttaaagg tctcagcagt aaatgtagaa aagtggaact atctcctggt 660

gatgtgcttt ttgtgcctca taaatggtgg cactttgttg aaaatttaaa cactagcata 720

gccattaatg tctggctacc ctcagtgcat gatgataaag aaaggctaaa agaatcgata 780

gtacagtaca ctgttaaaca aattactgat ttatcaacag agaaaactaa gaaaattatt 840

ttaaacccta atatggataa gttactgtta aaaaatgatg tcacacaatt ttttaacaca 900

ataaacacgt gtaaaaggat ttgcaagcga tctccacaca aaaagcagac caatgaagac 960

agttcgatat ttaatacaaa aatagttgac ttgggcattg aagttcccgt actatcaaga 1020

gatgaattta tgaaattaat gaaccagcaa attagtagat ttggtgaaaa aaaagtacct 1080

gaagaaacac atggagacga ttttgttaaa ttagtgcgag cttttactaa tcctgaagtt 1140

ataaatttaa taacacataa tttaataagt gatcaataaa att 1183

Claims (5)

1.热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法，其特征在于：按照以下步骤进行，

a、昆虫样品的高温处理

收集莲草直胸跳甲12h内所产的卵，按照6个不同的发育阶段卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹、成虫，将卵分为6组，各组卵均置于25℃、相对湿度85±5％、光照周期14L:10D的养虫室中饲养，处理温度为32.5℃，35℃，37.5℃，40℃，42.5℃，45(±0.5℃)，处理时间为1h，3h，5h，每个处理为5个重复，每个重复供试虫量100～150头，热处理结束后，将热暴露后的莲草直胸跳甲转移至25℃养虫室继续饲养；

b、短时高温对莲草直胸跳甲种群的影响

对经过短时高温处理的各虫态的存活率数据进行分析，选取关键的热敏感虫态、温度及时间处理组合进行生命表观察和数据记录，然后对生命表数据分析，最终明确高温对莲草直胸跳甲种群的影响；

在进行生命表数据分析时，根据年龄-阶段两性生命表的理论和方法，利用http://140.120.197.173/Ecology/Download/TWOSEXMSChart.rar所提供的计算机程序TWOSEX-MSChart，分析了莲草直胸跳甲不同发育阶段的存活率、寿命和繁殖力等所有原始数据；因为莲草直胸跳甲是群体饲养的，所以记录了在每个阶段，存活至年龄为x的个体的数量；其中涉及的生命参数包括特定年龄-阶段特异性存活率，计算如下：其中n₀₁是在生命表试验开始时卵的数量，s_xj，表示新孵化个体存活至第x天和第j阶段的比率，n_xj是存活到第x天和第j阶段的跳甲数量；

雌性年龄-阶段特异性繁殖力f_x4计算公式如下：其中E_x表示所有雌性成虫(第4阶段)在x天时产卵的总数，n_x4是雌性成虫存活到第x天的数量；

根据Chi和Liu(Bulletin of the Institute of Zoology Academia Sinica,24(2):225-240)，净生殖率R₀表示一个体在其生命期内可以产生的后代的总数，计算公式为：其中m是生命阶段的数目,lx是年龄特异性存活率(新产的卵存活到第x天的概率)，mx是年龄特异性繁殖力(第x天个体的平均繁殖力)；

l_x和m_x的计算如下：

用迭代对分法和Euler-Lotka方程，估算了年龄指数从0开始的内禀增长率r，公式如下：

周限增长率λ，平均世代周期T等，计算如下：λ＝e^r，

用Bootstrap法估计各处理种群参数的标准误，该方法需要每个个体的寿命和雌成虫的日繁殖力，每个个体的寿命和性别可以根据个体的存活状态来计算；雌虫的平均繁殖力可以根据每头雌虫每天产卵的数量来估算；根据Chi(Environmental Entomology,17(1):26-34)证明的R₀和F之间的关系，该方法不会影响l_x或m_x，因此，也不会影响群体参数；由于雌性寿命不同，这种方法仍然可以揭示其对雌性繁殖力的影响，对于发育时间，寿命，繁殖力和种群参数的方差和标准差估算，均采用采用Bootstrap方法，进行100,000次抽样，处理间的差异用配对Paired Bootstrap方法进行检验(B＝100,000)，基于95％置信区间进行比较；

c、实时荧光定量PCR分析热激蛋白基因与温度适应性的关系

鉴定完莲草直胸跳甲所有热激蛋白家族基因后，提取热敏感虫态(卵)不同温度条件下的总RNA，提取完成后，利用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，核酸蛋白检测仪测定其浓度和纯度，然后-80℃保存备用；然后再对RNA进行纯化处理，处理完成后，利用电泳检测基因组DNA是否去除干净，如没有完全去除，增加DNase I的量和反应的时间直至完全去除，然后-80℃保存备用；最后在再对RNA进行反转录和实时荧光定量PCR；

在进行实时荧光定量PCR时，取27个HSP基因和内参基因β-actin的PCR引物，实时荧光定量PCR的反应总体系为20μL，其中包括10μL的 Select Master Mix(AppliedBiosystems)，2μM的基因特异性引物和2μL的莲草直胸跳甲cDNA模板，整个反应在ABI 7500上进行，相对定量的数据使用ABI 7500 SDS v2.2.6软件生成，每个样品3次技术重复，β-actin作为内参基因，热激蛋白基因mRNA的相对表达量数据采用2-△△CT法处理计算；相关热循环参数设置如下：

2.根据权利要求1所述的热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法，其特征在于：所述步骤c中在进行RNA的提取时，

1)将各温度处理虫卵样品在液氮中充分研磨后加入到1.5ml RNase-free的EP管中，样品总量为60mg；

2)向RNase-free EP管中加入1ml Trizon，10μlβ-巯基乙醇，用移液器吹打混匀后，室温静置10min，在4℃下12000g，离心10min；

3)取上清液，转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，室温静置5min，加入200μl氯仿，剧烈震动2～3min，室温静置3min，在4℃下12000g，离心15min；

4)吸取上清液转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，加入200μl氯仿，剧烈震动，室温静置3min，4℃下12000g离心15min；

5)吸取上清液转移至一新的1.5ml RNase-free EP管中，加入-20℃预冷等体积异丙醇和50μl3M醋酸钠，上下颠倒混匀，置于-20℃保存1h左右；

6)4℃下12000g离心10min；

7)弃上清，向沉淀中加入75％乙醇，颠倒冲洗，室温7500g离心10min；重复2～3次；

8)弃上清，置于室温干燥5min左右，待乙醇挥发完全后加入100μl RNase-free的水溶解。

3.根据权利要求1所述的热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法，其特征在于：所述步骤c中在进行RNA的纯化时，

1)在微量离心管中配制下列反应液体系；

2)将提取的RAN在37℃反应20～30min；

3)加入50μlRNase free water，再加入100μl苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)后混匀；

4)12000g常温离心5min后吸取上清；

5)加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混匀；

6)12000g常温离心5min后吸取上清；

7)通过上述抽提将DNase I失活，然后加入10μl3M醋酸钠和250μl预冷的75％乙醇，充分混匀后置于-20℃保存1h；

8)12000g，4℃离心10min，弃上清，室温干燥5min。

4.根据权利要求1所述的热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法，其特征在于：所述步骤c中在进行RNA反转录时，

1)在微量离心管中配制下列模板RNA/Oligo(dT)混合液，

2)70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2min左右，

3)离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部；

4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，

5.根据权利要求1所述的热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法，其特征在于：所述步骤c中27个HSP基因和内参基因β-actin的PCR引物如下：