CN110669769A

CN110669769A - 砗磲免疫相关的saa基因及其在制备砗磲病理检测试剂中的应用

Info

Publication number: CN110669769A
Application number: CN201910995058.7A
Authority: CN
Inventors: 向志明; 赵泽慧; 张跃环; 肖述; 张扬; 李军; 喻子牛
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2019-10-18
Filing date: 2019-10-18
Publication date: 2020-01-10
Anticipated expiration: 2039-10-18
Also published as: CN110669769B

Abstract

本发明公开了一种砗磲免疫相关的SAA基因及其在制备砗磲病理检测试剂中的应用。本发明首次从番红砗磲中克隆得到SAA基因，并设计针对该基因在几种常见的砗磲中的通用性引物TcSAA‑F/TcSAA‑R。定量PCR实验表明，番红砗磲SAA基因在弧菌感染后显著上调，与哺乳动物极为相似，在其他病理情况下，该基因的表达也显著性上调。因此，该SAA基因也可以作为检测砗磲健康状况的金标准。本发明的SAA基因和引物TcSAA‑F/TcSAA‑R可以用来监测砗磲的健康状况，对于砗磲疾病的预防提供一个积极而准确的警戒信号，可以有效地防止灾害的扩大。该技术的应用，将进一步提升砗磲养殖种质创新的能力，支撑产业的高效可持续性发展。

Description

砗磲免疫相关的SAA基因及其在制备砗磲病理检测试剂中的应用

技术领域：

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及砗磲免疫相关的SAA基因及其在制备砗磲病理检测试剂中的应用。

背景技术：

砗磲属于软体动物门，瓣鳃纲，帘蛤目，砗磲科，分有2个属，砗磲属有9个种，而砗蚝属只有1个种。砗磲是当今最大的贝类，有的种类体形可达1米左右，重量可达到300千克以上；除了体形最大之外，砗磲还可以自养，因为其外套膜内具有共生的虫黄藻，在光照条件下可进行光合作用，为砗磲提供营养，使其在营养极度缺乏的远海可以生存，为珊瑚礁的建设提供基石。砗磲从西太平洋到印度洋以及非洲东海岸的热带海域都有分布，但是随着全球气候环境的变化以及人类的过度捕捞，该物种已经处于濒临灭绝的边缘，成为全球濒危保护的物种；砗磲在我国海域也极为罕见，其中库氏砗磲(Tridacna gigas)很少见到，基本上可能已经灭绝。为了挽救这些珍稀物种，人们投入了大量的工作，进行砗磲种群资源保护和人工繁育，在上世纪90年代初期，一些国家在砗磲的繁育、生理、生态分布和经济学方面展开了一系列的调查和研究工作，达到了历史研究的顶峰，并取得了很多科研成果。但是随后，人们对于砗磲的研究进入低谷，至今很少有相关的研究报道。近几年，本项目申报人团队通过几年的努力，在国内成功首次培育出了无鳞、鳞砗磲、番红砗磲等几种砗磲，各种砗磲每年所育成贝达到数百万个，产量达到了产业化水产的规模，攻破了砗磲繁育的难关，为砗磲种群的恢复、砗磲经济的开发以及相关科学研究奠定了坚实的基础。

血清淀粉样蛋白A属于载脂蛋白家族成员，是目前应用最为广泛的病理检测的金标准。在人类等脊椎动物中，SAA已经被开发成型的试剂盒，广泛的应用于甄别宿主的健康与否。环境胁迫、创伤以及病原菌感染均能引起SAA的急性显著性应答，这些因素使该蛋白具有广阔的应用前景。而且，该蛋白正常情况下表达水平不高，而病理情况下的表达高达正常水平的数百倍至数千倍，从而提高了仪器检验的灵敏度，检测手段的可操作性大大提高。

发明内容：

本发明的目的是为了克服现有技术中的缺陷，提供一种砗磲免疫相关的SAA基因及其在制备砗磲病理检测试剂中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：本发明在番红砗磲转录组测序的基础上，发现了一个番红砗磲的病理检测的标志性基因，即血清淀粉样蛋白A(Serumamyloid A protein，SAA)基因。通过RACE技术，获得了SAA基因的全长，该基因的cDNA全长646bp(如SEQ ID NO.1所示)，自125bp至517bp区段为其开放阅读框，编码130个氨基酸(如SEQ ID NO.2所示)，5'非编码区长124bp，3'非编码区长129bp，并含有多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和多聚腺苷酸尾巴。该SAA基因的核酸序列具有高度的物种特异性，其编码氨基酸区域(55-121aa)的核酸序列约有40-70％同源于已知其他物种的SAA基因，该基因在砗磲中属于首次发现。

本发明的第一个目的是提供一种新的砗磲免疫相关的SAA基因，所述的SAA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第125位碱基到第517位碱基所示。

本发明的第二个目的是提供一种由所述的SAA基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种含有所述的砗磲免疫相关的SAA基因的重组表达载体。

本发明依据番红砗磲SAA基因的核酸序列，作为设计定量PCR引物的模版，设计相应的引物TcSAA-F/TcSAA-R，以四种不同的砗磲外套膜cDNA为模版，对番红砗磲SAA基因定量引物的通用性进行PCR鉴定，确认引物TcSAA-F/TcSAA-R在各种砗磲中的通用性。

因此，本发明的第四个目的是提供一种所述的砗磲免疫相关的SAA基因的检测引物，所述的检测引物如下所示：

TcSAA-F：5'-GTAACTATGATGCTGCCAGACAC-3'(如SEQ ID NO.3所示)；

TcSAA-R：5'-TCCTCTGGTTTAAGTCTTTATTTCT-3'(如SEQ ID NO.4所示)。

本发明的第五个目的是提供一种所述的砗磲免疫相关的SAA基因的检测试剂盒，包括实时定量PCR反应液、DNA聚合酶和所述的检测引物。

本发明使用实时定量PCR技术分析了番红砗磲SAA基因在血细胞、消化腺、腮、外套膜、心脏、闭壳肌、触唇、性腺组织中的表达水平，检测了其在病原菌刺激后，其血细胞中的SAA的表达水平的变化。实验结果表明SAA基因在各个组织和胚胎发育阶段均有表达；在溶珊瑚弧菌感染下，该基因的的表达显著增加。因此，该SAA基因也可以作为检测砗磲健康状况的金标准。本发明的引物TcSAA-F/TcSAA-R可以用来监测砗磲的健康状况，对于砗磲疾病的预防提供一个积极而准确的警戒信号，可以有效地防止灾害的扩大。该技术的应用，将进一步提升砗磲养殖种质创新的能力，支撑产业的高效可持续性发展。

本发明的第六个目的是提供所述的检测引物或检测试剂盒在制备砗磲病理检测试剂中的应用。

所述的砗磲病理检测试剂优选为砗磲微生物感染检测试剂。

所述的砗磲优选为番红砗磲Tridacna crocea、长砗磲Tridacna maxima、磷砗磲Tridacna squamosa或无磷砗磲Tridacna derasa。

本发明通过下一代转录组测序、结合分子克隆技术，首次从番红砗磲中克隆了SAA基因。本发明采用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)的方法克隆到了基因的全长，该基因cDNA全长646bp(如SEQ ID NO.1所示)，自125bp至517bp区段为其开放阅读框，编码130个氨基酸，5'非编码区长124bp，3'非编码区长129bp并含有多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和多聚腺苷酸尾巴。为了探索该基因在病理检测中的应用，我们采用定量PCR方法，筛选通用性引物，我们以番红砗磲SAA基因为模板，设计合适的定量引物，在番红砗磲、长砗磲、磷砗磲、无磷砗磲四种砗磲中都检测到了明显的阳性结果；在微生物感染应答下，该基因的表达能够显著上调；因此，该基因在这几种砗磲病理应激反应过程发挥了重要作用，具有重要的应用价值。本发明为砗磲种群繁育提供一个准确的预警、检测的机制，包括砗磲各类传染性疾病的爆发，监测海洋环境对砗磲健康状况的影响。

本发明首次从番红砗磲中克隆得到血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid Aprotein，SAA)基因，依靠该基因的高度保守性，我们找到并验证了该基因在几种常见的砗磲中的通用性引物TcSAA-F/TcSAA-R。定量PCR实验表明，番红砗磲SAA基因在弧菌感染后显著上调，与哺乳动物极为相似，在其他病理情况下，该基因的表达也显著性上调。因此，该SAA基因也可以作为检测砗磲健康状况的金标准。本发明的SAA基因和引物TcSAA-F/TcSAA-R可以用来监测砗磲的健康状况，对于砗磲疾病的预防提供一个积极而准确的警戒信号，可以有效地防止灾害的扩大。该技术的应用，将进一步提升砗磲养殖种质创新的能力，支撑产业的高效可持续性发展。

附图说明：

图1是番红砗磲无参转录组测序流程图。

图2是番红砗磲测序资料的生物信息学分析流程图。

图3是实时定量PCR检测SAA基因mRNA在不同组织中的分布；其中A为SAA基因在砗磲各个组织中的表达情况；B为SAA基因在砗磲胚胎发育时期的表达情况；不同的小写字母表示组间差异极其显著(P<0.01)。

图4是病原菌刺激诱导SAA基因的表达；其中星号(**)指示和对照组差异极其显著(P<0.01)。

图5是番红砗磲SAA基因定量引物的通用性鉴定结果；1.番红砗磲Tridacnacrocea；2.长砗磲Tridacna maxima；3.磷砗磲Tridacna squamosa；4.无磷砗磲Tridacnaderasa。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

1.按照诺北京诺禾致源生物信息科技有限公司无参转录组测序样品送样要求，提供番红砗磲的组织样品。选取5个番红砗磲，平均壳高7±1厘米的个体，分别取外套膜、闭合肌、性腺和淋巴细胞或组织各0.1克，加Trizol(Invitrogen，USA)后，采用组织研磨器研磨，立刻放入液氮冷冻，次日采用干冰快递给该公司，分别按照各个组织样品，进行下一步实验处理，包括RNA抽提、质检、转录、建库和进行Illumina HiSeq测序，简约流程如图1。

2.文库测序完成后，进行序测序资料生物信息学分析，对于无参考基因组的转录组分析，先将测序所得的序列拼接成转录本，用Corset程序转录本进行层次聚类，以聚类后序列为参考，进行后续分析。信息分析简约流程图如图2。

3.在测序结束后，在CDS预测中，我们发现了基因编号为：Cluster-28143.90081基因序列为SAA(Serum amyloid A protein)的部分编码序列。

4.依据步骤3所得到的序列进行PCR克隆、测序，以获得的序列为模版，通过GeneRacerTM RACE Ready cDNA试剂盒(Invitrogen,USA)进行该基因的5'/3'RACE，具体操作参照说明书。得到5'/3'RACE序列后，通过拼接，获得了SAA(Serum amyloid A protein)基因的全长cDNA(如SEQ ID NO.1所示)，该基因全长646bp，自125bp至517bp区段为其开放阅读框，编码130个氨基酸(如SEQ ID NO.2所示)，5'非编码区长124bp，3'非编码区长129bp，并含有多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和多聚腺苷酸尾巴SAA。

5.样本处理

取养殖在28℃海水中正常番红砗磲50只，分2组，每组25只，一组每只注射活的溶珊瑚弧菌100微升，约1.0×10⁹个菌，另一组每只注射100微升2×PBS，作为参照组。注射后按照0、6、12、24小时的时间点取样，每组每个点分别取5个样本，每个样品提取血细胞的总RNA；为了检测目标基因SAA的组成型表达情况，我们选取了5只正常生长的砗磲，分别提各个样本的组织总RNA，包括外套膜(out mantle)、内外套膜(inner mantle)、足丝孔外套膜(pedal mantle)、足(foot)、足丝腺(byssus gland)、足丝柄(byssus stem)、闭壳肌(adductor muscle)、鳃(gill)、淋巴(hemocytes)、心脏(heart)、内脏团(digestivegland)和性腺(gonads)等组织；此外，为了研究SAA基因在发育时期的表达情况，我们分别提取了受精卵(fertilized egg)、二细胞期(2-cell)、四细胞期(4-cell)、囊胚期(blastula)、肠胚期(gastrula)、单轮幼虫(trochophore)、D形幼虫(D-larvae)等时期的总RNA；将RNA反转录成cDNA。

RNA提取及反转录合成cDNA，具体步骤如下：

a).番红砗磲细胞或组织加Trizol后，采用组织研磨器研磨，室温放置5min，使其充分裂解。

b).12,000rpm离心5min，弃沉淀。

c).按200μL氯仿/mL Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。

d).4℃12,000g离心15min。

e).吸取上层水相，至另一离心管中。

f).按0.5mL异丙醇/mL Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。

g).4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

h).按1mL 75％乙醇/mL Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

i).4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。

j).室温晾干或真空干燥5-10min。

k).可用50μL H₂O，TE buffer或0.5％SDS溶解RNA样品，55-60℃，5-10min。

l).在室温孵育15min之后，加入250μL DNase Stop Solution(DSA)，在13,000×g离心1min。

m).重复步骤a-j，加100μL无核酸酶水，然后，在13,000×g离心1min，弃离心柱，使用分光光度计测量所收集的溶液中的RNA的浓度，分装后，贮存于-80℃。

n).第一条链cDNA的合成，PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser

1)DNase I消化

按照如下组分分别将各组的RNA加入到PCR离心管中

2)用枪头轻轻吹打混匀并稍作离心；37℃，15min，消化RNA中的DNA；

3)加入1μL EDTA混匀，65℃，10min使DNase I失活；

4)按照如下组分依次加到离心管：

用枪头轻轻吹打混匀并稍作离心，放置于37℃，30min；

5)85℃，5s使反转录酶失活，然后4℃短期保存，-20℃长期保存。

6.实时定量PCR检测SAA mRNA在不同组织中的分布及病原菌刺激后SAA基因的表达

对步骤5的样品进行实时定量PCR(Real-time PCR，qRT-PCR)检测，进行实时定量PCR所使用的试剂盒为Light Cycler 480SYBR Green I(Roch)，所使用的仪器为LightCycler 480System(Roche)，所使用的模板为上述所获得的反转录产物(cDNA)，所使用的内参β-actin，所使用的引物有：

针对SAA基因：

TcSAA-F：5'-GTAACTATGATGCTGCCAGACAC-3'；

TcSAA-R：5'-TCCTCTGGTTTAAGTCTTTATTTCT-3'。

针对内参β-actin基因：

Tcβ-actin-F：5'-GCTCTTCTTGCTTACACTCTTGG-3'；

Tcβ-actin-R：5'-TGAGATTGGGATAAATGGAACA-3'。

qRT-PCR的反应体系如下：

热循环条件如下：95℃处理5min；接下来运行40个循环：95℃变性10秒，57℃退火延伸10秒，72℃退火延伸20秒。qRT-PCR运行完成后，进行溶解曲线分析以确定PCR扩增是否特异。使用2^－ΔΔCT方法对转录本进行相对定量。对于每一份样品，实验组和对照组均设置3个平行反应。

结果发现SAA基因在各个组织中均有表达，在闭合肌中的表达最低，在血细胞中表达最高(图3A)，在砗磲胚胎发育的不同时期，该基因也均有表达(图3B)；溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)病原菌刺激后，血细胞中SAA的表达显著上调(图4)。

7.番红砗磲SAA基因定量引物的通用性鉴定

为了筛选砗磲检测的通用引物，我们依据番红砗磲SAA基因的核酸序列，作为设计定量PCR引物的模版，设计相应的引物。以四种不同的砗磲(番红砗磲Tridacna crocea、长砗磲Tridacna maxima、磷砗磲Tridacna squamosa和无磷砗磲Tridacna derasa)外套膜cDNA为模版，对番红砗磲SAA基因定量引物的通用性进行PCR鉴定。实验材料和方法以及PCR的反应体系和反应条件与步骤6定量实验相同。对其PCR产物进行测序、比对和验证，确认了一对SAA定量引物(引物对TcSAA-F/TcSAA-R)，在四种砗磲中均能有特异阳性带检测出来(图5)，说明该引物在这几种砗磲中都具有使用价值。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 砗磲免疫相关的SAA基因及其在制备砗磲病理检测试剂中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 646

<212> DNA

<213> 番红砗磲(Tridacna crocea)

<400> 1

agcccagccg atggcttatc agctgttcgc agatctataa ataaacaagc aaaatcgcag 60

tcactttatt cgtattgccg aatattttct aaggagacgc agactgttcg tcaagatcaa 120

agacatgaag gtcacactga tactactcgt tgttctaact gttctgtacg tggacaagac 180

tgcggcccag aacattttta ggcgaggcta caattatgcc aggagctttg gaaggggatc 240

agctgcaatg tggagagcat atcgagacat gagacgagcc aacacaatcg gtgcggataa 300

atatttccac gctcgaggta actatgatgc tgccagacac ggtctaggag gtcgacacgc 360

ggctaggtta ataagcaata tcagagaagg gtaccaaggt gccctaagtg gacacgggcc 420

tgaggacaca gccgcagatc aagaagcaaa cagatggggc aggaatggcg gcgaccccaa 480

ccgataccgc cccaacggac tggacgatcg ttactaaaga aataaagact taaaccagag 540

gatcatgttc ttcgatccaa agacattaag tcgagactat aactttttgc tgctttgcta 600

cgtgaaaaca caattatata aaacaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 646

<210> 2

<211> 130

<212> PRT

<213> 番红砗磲(Tridacna crocea)

<400> 2

Met Lys Val Thr Leu Ile Leu Leu Val Val Leu Thr Val Leu Tyr Val

1 5 10 15

Asp Lys Thr Ala Ala Gln Asn Ile Phe Arg Arg Gly Tyr Asn Tyr Ala

20 25 30

Arg Ser Phe Gly Arg Gly Ser Ala Ala Met Trp Arg Ala Tyr Arg Asp

35 40 45

Met Arg Arg Ala Asn Thr Ile Gly Ala Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg

50 55 60

Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Arg His Gly Leu Gly Gly Arg His Ala Ala

65 70 75 80

Arg Leu Ile Ser Asn Ile Arg Glu Gly Tyr Gln Gly Ala Leu Ser Gly

85 90 95

His Gly Pro Glu Asp Thr Ala Ala Asp Gln Glu Ala Asn Arg Trp Gly

100 105 110

Arg Asn Gly Gly Asp Pro Asn Arg Tyr Arg Pro Asn Gly Leu Asp Asp

115 120 125

Arg Tyr

130

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 番红砗磲(Tridacna crocea)

<400> 3

gtaactatga tgctgccaga cac 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 番红砗磲(Tridacna crocea)

<400> 4

tcctctggtt taagtcttta tttct 25

Claims

1.一种砗磲免疫相关的SAA基因，其特征在于，所述的SAA基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1的第125位到第517位碱基所示。

2.一种由权利要求1所述的砗磲免疫相关的SAA基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种含有权利要求1所述的砗磲免疫相关的SAA基因的重组表达载体。

4.一种权利要求1所述的砗磲免疫相关的SAA基因的检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

TcSAA-F：5'-GTAACTATGATGCTGCCAGACAC-3'；

TcSAA-R：5'-TCCTCTGGTTTAAGTCTTTATTTCT-3'。

5.一种权利要求1所述的砗磲免疫相关的SAA基因的检测试剂盒，其特征在于，包括实时定量PCR反应液、DNA聚合酶和权利要求4所述的检测引物。

6.权利要求4所述的检测引物或权利要求5所述的检测试剂盒在制备砗磲病理检测试剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的砗磲病理检测试剂为砗磲微生物感染检测试剂。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述的砗磲为番红砗磲Tridacnacrocea、长砗磲Tridacna maxima、磷砗磲Tridacna squamosa或无磷砗磲Tridacnaderasa。