CN108893541A - 猪皮下脂肪相关的环状rna及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及猪皮下脂肪相关的环状RNA及其应用，具体的涉及猪皮下脂肪相关的circRNA_11897及其应用。本发明对大白猪和莱芜猪皮下脂肪组织的circRNA进行鉴定与分析，并用系统的生物信息学方法对差异表达circRNA进行功能分析，发现circRNA_11897及其相关基因ssc‑miR‑27a、ssc‑miR‑27b‑3p、SCD，验证实验表明，他们的表达量和猪皮下脂肪具有很好的相关性，本发明为猪肉质的改善及脂代谢紊乱引起的代谢性疾病的发生和预防提供新的理论基础和潜在的靶标。

Description

猪皮下脂肪相关的环状RNA及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猪皮下脂肪相关的环状RNA及其应用，更具体的涉及circRNA_11897及其应用。

背景技术

猪肉品质的好坏与人类的健康息息相关，若皮下脂肪沉积过高会增加胆固醇的含量，降低猪肉品质，消费者摄入之后易导致肥胖症的发生，故而了解脂肪沉积的分子机制有助于提高猪肉品质和人类健康。大白猪，作为典型的瘦肉型猪，有较低的皮下脂肪；而莱芜猪肉色鲜红，持水性良好，脂肪含量高，肉质优良等优点。因此，大白和莱芜猪在脂肪沉积方面的显著差异为脂肪代谢的研究提供了良好模型。

circRNA是一类由特殊选择性剪切产生的环形内源性分子，呈共价闭合的环形结构，没有5'和3'极性，不能被核糖核酸酶降解。在哺乳动物细胞中，circRNA分布广泛，含量丰富，且具有稳定性，保守性和组织特异性。研究已证实circRNA在疾病的发生和发展过程中具有重要的作用。有研究发现，cir-ITCH也可以作为miR-7，miR-17和miR-214的海绵，抑制食管鳞状细胞癌。随后，发现一些新型circRNA也能作为肿瘤标记物。但是，circRNA是否参与脂肪沉积与代谢，目前仍不清楚。

因此，本研究对大白猪和莱芜猪皮下脂肪组织的circRNA进行鉴定与分析，探究circRNA的表达模式，并用系统的生物信息学方法对差异表达circRNA进行功能分析，以探索其调控脂肪沉积的分子机制，为猪肉质的改善及脂代谢紊乱引起的代谢性疾病的发生和预防提供新的理论基础和潜在的靶标。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪皮下脂肪相关的环状RNA，命名为circRNA_11897，序列与SEQ ID NO.1具有90％以上序列同源性。

术语“同源”是主要是指序列上的同源，也就是用来说明两个或多个RNA或DNA序列具有相同的祖先。同源的序列一般有相似的功能。一般来说，当相似程度高于50％时，常推测检测序列和目标序列可能是同源序列；当相似性程度低于20％时，就难以确定其是否具有同源性。

优选的，circRNA_11897序列为SEQ ID NO.1。

环状RNA(circular RNA，circRNA)，亦称环形RNA，是最近几年研究确认的一种新型的非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)分子。根据RNA构成的不同，环状RNA可分为三类：外显子环状RNA(exon circular RNA，ecircRNA)、内含子环状RNA(circular intronic RNAs,ciRNAs)和外显子-内含子circRNA(exon-intron circRNA,EIciRNA)。

本发明的目的在于提供一种检测皮下脂肪的试剂，试剂通过测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测样品circRNA_11897的表达水平。

优选的，通过高通量测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测样品circRNA_11897的表达水平。

优选的，试剂包含检测circRNA_11897的的探针或用于荧光定量PCR的引物，更优选的，引物序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

优选的，样品为组织，优选的，样品为皮下脂肪组织，更优选的，样品为猪皮下脂肪组织。

进一步，所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。

本发明中“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明中的术语“杂交”用于指代互补核酸的配对。杂交和杂交强度受诸如以下的因素影响：核酸之间的互补程度、所涉及的条件的严格性、形成的杂交体的Tm和核酸内的G:C比率。

测序技术主要为高通量测序技术(High-throughput sequencing)，又称下一代测序技术(next generation sequencing)，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，极大提高了测序效率。高通量测序平台的代表是罗氏公司(Roche)的454测序仪(RochGSFLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。

本发明的目的在于提供下述任意一项应用：

circRNA_11897在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

circRNA_11897在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

circRNA_11897在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

上述试剂在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

上述试剂在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

上述试剂在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

本发明的目的在于提供一种检测皮下脂肪的试剂，检测circRNA_11897相关基因的表达水平，相关基因为ssc-miR-27a、ssc-miR-27b-3p或ssc-miR-27b-3p的靶基因SCD。

优选的，试剂通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测circRNA_11897相关基因的表达水平。

进一步，所述试剂包含特异性扩增ssc-miR-27a的引物；或特异性扩增ssc-miR-27b-3p的引物；或特异性扩增SCD的引物。

特异性扩增ssc-miR-27a的引物序列为SEQ ID NO.6；特异性扩增ssc-miR-27b-3p的引物序列为SEQ ID NO.7；特异性扩增SCD的引物序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。

本发明的目的在于提供下述任意一项应用：

上述试剂在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

上述试剂在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

上述试剂在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

一种检测猪皮下脂肪含量的方法，包括：(1)选取猪皮下脂肪组织；(2)检测样品中circRNA_11897和/或其相关基因的表达量。

优选的，相关基因为ssc-miR-27a、ssc-miR-27b-3p或ssc-miR-27b-3p的靶基因SCD。

附图说明

图1是皮下脂肪差异表达circRNA分类图

图2是circRNA_11897-miRNA-mRNA互作网络图

图3是荧光定量验证候选基因差异表达图

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 circRNA测序及差异表达circRNA挑选

1.1实验动物：

该试验以脂肪沉积存在明显差异的大白猪和莱芜猪为材料，饲养于莱芜市大千农牧有限公司，在相同饲养条件和环境下生长育肥，参照营养需要标准(National ResearchCouncil,NRC,1998)饲喂日粮，选择180日龄、种内体重接近的大白猪(约100kg)和莱芜猪(约35kg)各3只，且健康、体质优良。

1.2样品采集：

屠宰实验猪后，迅速将皮下脂肪组织分离。为减少RNA的降解，所有过程在冰上进行。之后用消毒剪刀将组织剪成小块，分别装入5mL冻存管，放入液氮冷冻，后转移至-80℃冰箱保存，用于提取总RNA。实验设置分为2组，分别对大白猪皮下脂肪组织(D_PX)与莱芜猪皮下脂肪组织(L_PX)中的circRNA进行鉴定及分析，每个样本设置3个生物学重复。

1.3样品总RNA的提取及质控：

取出等量低温保存的脂肪组织，使用QIAGEN抽提试剂盒提取RNA，提取的总RNA保存于-80℃冰箱。用NanoDrop 2000紫外分光光度计测定RNA样品的浓度和OD260nm/OD280nm比值，比值在1.9～2.1间，Bioanalyzer 2100检测总RNA的质量，且RIN≥7、28S/18S≥0.7，用RNase-free DNaseⅠ除去基因组DNA污染。

1.4 circRNA测序建库：

(1)Ribo-zero kit去除rRNA及RNA的片段化；(2)核糖核酸酶R去除线性RNA；(3)双链cDNA的合成与纯化；(4)末端修复，加A碱基；(5)测序接头连接；(6)DNA片段富集纯化；(7)文库的质检；(8)本试验共建立6个cDNA文库(大白猪和莱芜猪皮下脂肪组织cDNA文库)，分别为D_PX_1、D_PX_2、D_PX_3、L_PX_1、L_PX_2、L_PX_3，文库质检合格后，运用IlluminaHiSeqTM2500测序平台进行双端测序，对文库进行测序分析，下机得到的数据是原始测序数据。

1.5原始数据质控及过滤：

主要应用NGSQCToolkit进行质控并去除接头，后续的分析以clean reads为基础。具体步骤如下：

(1)首先过滤低质量的reads，质量阈值设置为20，过滤长度阈值设置为70％。

(2)然后从5’端及3’端去除低质量碱基，质量阈值设置为20。

(3)最后切除reads中含N部分序列，长度阈值设置为35bp。

表1原始数据质量控制结果

1.6 circRNA鉴定：

使用BWA软件与参考基因序列比对，生成SAM文件，对文件中的CIGAR值进行分析，并从SAM文件扫描PCC信号(paired chiastic clipping signals)。CIGAR值在junctionread的特征为xS/HyM或者xMyS/H，其中x,y代表碱基数目，M是mapping，S是soft clipping，H是hard clipping。关于双端Reads，CIRI算法考虑一对reads，其中一条mapping到circRNA上，另一条也需mapping到circRNA的区间内。关于单外显子成环，或“长外显子1-短外显子-长外显子2”成环，CIGAR值应该是xS/HyMzS/H以及(x+y)S/HzM或者xM(y+z)S/H，CIRI软件能够将这两种情况分开。关于splicing信号(GT，AG)CIRI会考虑其它弱splicing信息例如(AT-AC)。算法：从GTF/GFF文件中抽取外显子边界位置，用已知边界来过滤假阳性。

1.7 circRNA注释：

将circRNA与基因元件进行比较，获取circRNA在基因组上的位置信息。利用circRNA位置信息与已知数据库中的蛋白编码基因注释信息，对circRNA进行注释，获取序列信息，详细处理过程如下：

(1)利用intersectBed软件，根据环化位点是否落在转录本区域的数目及剪切位点之间的外显子数目，获取与circRNA在基因组位置上有最大重叠区域的蛋白编码转录本；

(2)如果circRNA的反向剪切位点落在或远离最大重叠转录本的外显子，则对相应的外显子进行相应的截断或延伸，作为circRNA的边界外显子，同时取最大重叠转录本与circRNA重叠区域的其他外显子，作为circRNA的中间外显子；在该过程中需要保证circRNA的反向剪切位点不变

(3)如果circRNA与外显子没有重叠区域，则认为该circRNA是一个单外显子circRNA，取circRNA的反向剪切位点之间的序列作为外显子序列。

1.8 circRNA分布统计：

统计各个组织中circRNA的数目情况。统计预测到的所有circRNA长度分布情况，在基因组染色体上的分布情况，circRNA外显子数目情况。

1.9 circRNA表达水平定量：

利用RPM(spliced reads per millon reads)对circRNA进行定量，其中RPM计算公式如下：RPM＝number of circular reads/number of total reads(units inmillion)其中：number of circular reads表示比对到circRNA的back-splicedjunctions区域的reads数，该数值来源于circRNA预测软件中提供的支持circRNA成环的reads数目；number of total reads(units in million)表示每个样本测序数据中(clean_data)reads数目(单位为millon)。

1.10生物学重复样品间相关性分析：

样品间circRNA表达水平相关性可以用来检验实验可靠性和样本选择合理性。相关系数越接近于1，说明样品间表达模式相似度则越高。当样本数目较多时(≥3)，circRNA的表达量情况，采用R语言中的cor函数及corrplot包，计算样本间的pearson相关系数，并绘制热图进行展示。

1.11样品组间差异circRNA筛选：

由于实验有生物学重复，运用DESeq包(Huber&Anders,2014)，是基于reads count进行差异分析的R包，用负二项分布检验的方式对reads数进行差异的显著性检验，估算转录本表达量的方式采用basemean值来估算表达量，计算差异倍数。筛选差异的条件为p<0.05且|FoldChange|>2。

在莱芜猪和大白猪皮下脂肪组织(L_PX vs D_PX)中共鉴定得到29763个circRNAs，对其进行差异表达分析(按照|fold change|≥2.0和P-value<0.05严格筛选)，在皮下脂肪组织中共鉴定得到275个差异表达circRNAs(70个上调，205个下调)。在70个上调的circRNA中，有17个intergenic circRNA，3个exonic circRNA，49个sense-overlapping circRNA和1个antisense circRNA；在205个下调的circRNA中，有7个exoniccircRNA，21个intergenic circRNA，174个sense-overlapping circRNA和3个antisensecircRNA(见图1)。其中，sense-overlapping circRNA的circRNA_11897进入我们的后续研究范围。

实施例2 circRNA深度分析

2.1差异表达circRNA功能分析：

得到差异表达circRNA之后，利用circRNA来源基因的信息，我们对差异表达circRNA进行GO富集分析。统计每个GO条目中所包括的差异circRNA个数，并用超几何分布检验方法计算每个GO条目中差异circRNA富集的显著性。KEGG是与Pathway相关的重要公共数据库，利用KEGG数据库对差异circRNA来源基因进行Pathway分析，可以找到富集差异circRNA来源基因的Pathway条目，寻找潜在的不同样品的差异circRNA可能和哪些细胞通路的改变有关。

2.2 circRNA-miRNA-mRNA互作网络图

选择在莱芜皮下脂肪组织下调的circRNA_11897进行后续的分析，结合生物学信息学分析和本实验室前期做过的大白猪和莱芜猪皮下脂肪组织miRNA和mRNA的测序结果进行整合分析，挑选出了与circRNA_11897结合的ssc-miR-27a、ssc-miR-27b-3p，且这些miRNA在大白猪和莱芜猪皮下脂肪组织差异表达，进一步分析ssc-miR-27a、ssc-miR-27b-3p调控的靶基因及其表达情况，将分析的数据进行整理，构建了circRNA-miRNA-mRNA互作网络图(见图2)。图中的其它miRNA也是circRNA_11897的潜在靶向，我们对图中miRNA调控的一些靶基因(如SCD)也进行了qRT-PCR验证，结果见实施例3。

2.3 circRNA_11897靶基因GO和KEGG富集分析

为了深入探索circRNA_11897靶基因的功能，对靶基因进行GO和KEGG pathway富集分析，结果显示，circRNA_11897靶基因富集于与脂代谢相关的生物学过程如MAPK级联反应、ERK1和ERK2级联反应等，还富集于PPAR信号通路、AMPK信号通路、非酒精性脂肪肝和阿尔兹海默症等通路中。

实施例3实时荧光定量PCR验证

选择circRNA_11897，circRNA_11897靶基因中对的2个miRNA(ssc-miR-27a、ssc-miR-27b-3p)和SCD基因，每个设置20个生物学重复(大白猪和莱芜猪各20例)，分别以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因和5S rRNA为内参，qRT-PCR方法用于验证基因的表达水平。

3.1引物设计：

circRNA_11897扩增：

正向引物：5’-TAACCCATACCGGTCCTTGC-3’(SEQ ID NO.2)

反向引物：5’-ATAACAAGCTTGCTGGCCTCT-3’(SEQ ID NO.3)

SCD扩增：

正向引物：5’-CCTTTATTCTTCTCTAACCCGT-3’(SEQ ID NO.4)

反向引物：5’-TCAGTGAGCAGAGACTTGTG-3’(SEQ ID NO.5)

ssc-miR-27a扩增：

特异引物：5’-TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC-3’(SEQ ID NO.6)

ssc-miR-27b-3p扩增：

特异引物：5’-TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC-3’(SEQ ID NO.7)

3.2反转录体系：

将下列物质加入0.5ml的离心管中：RNA 5μl；Oligo(dT)2μl；dd H2O(DEPC处理)4.5μl；

以上首先70℃孵育5min，然后迅速放在冰上。

5×Buffer 5μl；dNTP(10mM)2μl；Ribonuclease inhibitor 0.5μl；M-MLV RT 1μl；以上20μl体系42℃孵育60min，然后70℃10min。

3.3Real-time RCR反应

(1)将所得的cDNA与下列物质配成20μl体系加入0.2ml的离心管中混匀。

Real-Time PCR体系：cDNA 2μl；引物1(10pmol/μl)0.5μl；引物2(10pmol/μl)0.5μl；SYBR mix 10μl；dd H2O 7μl。

(2)Real-Time PCR程序设置：94℃预变性10min；94℃15s，60℃60s，45个循环；72℃10min。

3.4结果统计分析：

为了验证测序分析结果，选取目标分子circRNA_11897、ssc-miR-27a、ssc-miR-27b-3p和SCD，进行验证。2^-△△Ct法分析每组样本间基因的相对表达情况，用t-检验统计分析相对表达量，数据结果展示为平均数±标准差(Mean±SD)，P<0.05为差异显著。

结果显示，circRNA_11897、ssc-miR-27a、ssc-miR-27b-3p在瘦肉型猪大白猪皮下脂肪组织显著上调表达，SCD在脂肪含量较高的莱芜猪皮下脂肪组织显著上调表达，具体结果见图3。荧光定量PCR结果与测序结果一致。显示circRNA_11897、ssc-miR-27a、ssc-miR-27b-3p和SCD可以作为猪皮下脂肪含量检测的分子标志物，在预测或辅助预测猪肉品质、选育具有不同肌肉品质猪等领域具有很好的应用前景。例如，在选育瘦肉型猪的时候考虑circRNA_11897、ssc-miR-27a或ssc-miR-27b-3p表达量较高的个体或者SCD基因表达量低的个体。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 猪皮下脂肪相关的环状RNA及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35306

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 1

ctttgccctg tcagatgaag catacagatc cctaagagat caagataaag accagtgtat 60

tctgattact ggggaaagtg gagcaggaaa aacagaggcc agcaagcttg ttatgtccta 120

cgtagcggct gtttgcggaa agggagcaga agtgaatcaa gtcaaagaac agcttttaca 180

gtccaaccct gtcctggaag cttttggaaa cgccaagact gtaaggaatg acaactcttc 240

tagatttgta agtatttgta taagcataag tgttagcact aatatttagt tcatgtatat 300

ttaaacaacc catagatgta taacatttct taatacacac attgaaaaaa taagaaacac 360

catccctatt gagacatagg ccagaagttc aatgaggact ttttttgctt tctgaaattt 420

tcctttttaa ttcttcttgg aatgacaagt tgttattttt catatttgct atcacaaaat 480

tccatgagca gtttatttat aaatttttat ttatttattt tttggccacg gcatgtggca 540

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agtaggaaga agggtaaact aggcatcaag ttagtatatg ctgcagctct tgtcctttct 780

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acacacttca aaaaatattt caaatatatt aagtctgtag accataaaac tgcagagaac 1680

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gcaggtgatt tgccttttaa ggaacttgag agaaatccta ttataacaca ggtattaaga 1800

tatgagatta atacttgatt ataagctaaa tcatttcatg ccctgttttt agtcatttct 1860

ctgctttgtg atctgtgact ttgaccaggt atactcaagt ctgtgttaaa atattatagt 1920

agaactctac tctatttaaa attactactg tatatataac agggctttat gactccaggg 1980

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acccaggtca gcttcctttt cccttttctg cagtgtttat tctgctttct tcaaacctcc 3060

catccttccc tctcagctga tgatattatg cctacttcat agaaatcagc ctctccaagc 3120

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ctcttcgtgt cccacactca cctgcnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3240

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 3300

nnnnngaatc cgactagaac catgagttgc gggtccattc ctgggcttgt tcagtggggt 3360

taggatctgg cgttgccgtg agctgtggtg taggttgcag acgcgggtcg gatctggcat 3420

tcctgtggca tgggcgtagg tgggcagcta cagctctgaa tagaccccta ganctggaac 3480

ctccaattat gccacaggtg cggccctaga aaaggcagaa aagccaaaaa aaaaaaagaa 3540

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ccaggaggat gcgggtttga tccctagcct tgctcagtgg tttaaggatc tggtgtggcc 3660

atgagctacg ggtaagttgc agacacggct caggtctggc gtggctgtgg cattggccgg 3720

cagttgcagc tcccattgga accctggcct gggaaatttc acatgccaca agtgtagccc 3780

tttaaaagaa aaaaaaagta aaagtggaat acagaattgg aaaaccaaaa actgtgtgaa 3840

gtaaatggaa tgaattgatg tgccttatat gaacttctct acagaagagt tgactgggat 3900

gacaactagc atcatctgag cctttctgca aatgcatttc atggcccact ttctcataca 3960

ctctggggac ccctgcaaag cacccatgtg gttctgtgtg gcccaccaac cccttcttct 4020

ttgagaacca cgctgcttga gtaaattgtc ctaaagagta cagttttcat tccacttgcc 4080

ctttagcttc ataaatactg aacaggtatc ttcttatttt gtttctaact caagtctttc 4140

atgatctttc atgttcttgg tgaaccatgt gaggctctca gttatccttt gccagttgtg 4200

accttggcag gaagggtata gatggtggaa acagccctgg aagaaagggt ggactctgtc 4260

actcacatgc atctatttac ctgctctgca cactggtgcc ctgtgtacca gcccctctgc 4320

cctgcagtgg ggccttggca tgccgggagc tcagaccctc tctgggggga gataggggtg 4380

ggcagcaaac taacagaagg gctggaggag tatggcttgg tgagggcaca ctgtccatga 4440

ggaagggctg ctcacacaca atttatttaa aacaagcagc tgagctgagc ctctggagca 4500

agggcctgga gctggaacca ctgtcaggtt ctcaagcagc ttttttgtct gtcccaggtg 4560

gtctgtcatg taaagtctcc cattacagac caagggtagg gacttggtca gggagagatg 4620

agactgagga ggaaggctgg agttgggctg tggagtcacg tggtttctga taagggattt 4680

ttttttttgt ggtaaattat acataacatt taccctttta accttttttt ttttttttgg 4740

ccatgcctga agcaggtgga agttcccagg ccagggattg agccccagcc acagcagtga 4800

cagtgctgga tccttaacca ctgggccacc agggaactcc cttgctaacc tttttaagtg 4860

tacagttcag tggcattaag tacagtcaca ttattgtgca accatgtact cgttaaatag 4920

caacttccca ttccctcctc ccttagccct tggcagccac catctgactt tctctcctta 4980

tgaacttgac tgaactacta cctgatataa gtggagtcat acagtatttg tcctttgtga 5040

ctggcttatt tcagttagca gaatgtcctc aggtttcatc tgtgctgtag catgtgtcag 5100

aatttgcttt tttcttaagg ctaaataata ttccatcgta tgtatatgtg cagtcttatt 5160

ttgtgaataa tgctgctttg aacgtgggtg tttgagtccc tcctttcata ccctaaaagt 5220

agaattgctg ggttatatgg tgggtgactc tgtttcattt ttggaacatc tgctaaggaa 5280

tttgaatatt agcttaaaga ccctgaagag ttatagaagg gtttttgttt tgttttgttt 5340

tggtttttgc tttttaaggc tgcacccttg gcatatggaa ggtcctgggc tagtgattga 5400

atcaaagcta cagctgccag cctgcaccac agccacagca gtgcaggatc tgagctgcgt 5460

ctgcaacctg caccacagct catggcaacg ccagatcctc aatccacgag taaggccagg 5520

gatcaaaccc acatcctcat ggatcctagt caggttcgtt aaccgctgag ccatgaaggg 5580

aactcccagt tatgggaggc tttaaagcag ggcttgcctg accagactgt gatttagaaa 5640

ggcagagtgt ggcccttgga ggggggaggg agagggctga cagaggctgt ggtggcaaga 5700

gagggggaga ccacttagga ggctgttgcc ttcaaggtgg gaagtgatga aaactgagca 5760

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aatcaaggag gcaggtgggc tatgggggaa ggaagagaca ggagaggcca tggatgagaa 5880

actggatcag ttgggccttt gtgaaattta gggggagtaa gagggttttg ttttaaactt 5940

accaaagggg aaaggtgggg gtggggatgg attgggggtt tgggatcggc atgtacacac 6000

tattgtatgt ggatggtcaa caggtctacc aatattctgc gatagtctat aggggaaaag 6060

aatctgaaaa agaatggatg caggtatcta tataactgaa tcactttgtt gtacagcaga 6120

aattatcaca atgttgtaaa tcaaccatac tttgataata ctttaaaaaa tgaaagaaaa 6180

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atgataggaa acctaagttt gggacgtgta ttgagatgtt agacacaacc aagaggtagt 6300

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aagaatagag gggcagatgg ccatgcaatt tggctgaatt tgaaagtttg ggggatatta 6420

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tatatgtacc aaaatttata aaattaaaaa tgatggccag ctcattggtt ataaaaatca 6540

gatttgtaag gattctaatg aatgcgtagg gattaagact aaaacatgag ggcgttggat 6600

ttggcttaaa ttatttttgt tcctctttat cctctgattt ttttttttcc cctgtaatgc 6660

acatgtattg cttctaatca ttaaaagggt catttgaaat ttcaaaagtg gactgttttc 6720

ttatcttgcc tctcttattg gaccgtgagc ttccgaggag tgtataggga aaagtacctt 6780

gattttccag ggtgcgtccc tagcacttaa cactatgcca gggaccagca gggcccaata 6840

ctgtaaacag ttgttgaatt gaatggaaag ttaattagac tgctctcaaa aatgagattc 6900

catgctattt tgaaagatgt aggaaggaaa ttccagtttt tcacagtcac ttagcccatt 6960

atttaggtac tgaacaacat cctatagatt tggcccctct tttgccttta ttttgccatc 7020

aggatttact gaggtttatt ttattcatga aatcttgcta cattagcctt gttttcttaa 7080

gtgtgtttct catgttattc ttaaacgcat ttagcaatct ctttgggagc caaatggctc 7140

aattctgttt cctgtccttt gttgatagta ttatgttttc agaggaatgg atcaaagtgg 7200

cctgaagcct cagtcattat tctgccttct ggtcggctgt gaggaaccag ccaaccaagt 7260

atggcagctg tgagaatgtg cattattgaa tgactcagtt gtcaacctta aatttgcata 7320

cttgttttcc ttttgtgttt ctctgaatgc ctgccatgtg ccagaggctg tgtactgtgc 7380

ctttggggga ataaagatga ataagggtga ctcttgacac ctaggagctg attctccaga 7440

aaaggggctg tgatgcatac atgacccccc gtacaaggag gttaatgagg ggaaacccgt 7500

cagatgagaa ctattactgt gctaagactc ccttaaggtg ctacctctga tgtttgttgc 7560

taatgatgtt ataatagatg tgttttaaat gcccttattt aaattaccaa agtagtagat 7620

aatcttcttt ctttaagttt ccctgcaagt agcttttatg gccttgcttt ggtaagttcc 7680

tttaaattta tgtatttatt attattattt tttaagtata tttgatttag agtgttgtgt 7740

tagtttctgg tgtacagtaa catgattcag ttatacacat acgcatatat atgtacatat 7800

atgttctttt tcatattctt tttcattata gtttattaca ggatattgaa aatattcctt 7860

gtccttgttg tttatcagtt ttacatgtaa tcgtttgtag ccccaggttc cttcaaattt 7920

aaaattttgg taatgactta atattaatca cctttgattt gcgagtgttc tttcaaattc 7980

tacagaaaaa ctgaacttaa aaatgcacat taattttcat ctgtggcagt ctgagaactt 8040

ttaataactt gggggaccat cagagactgt tgttcagctt aaacaatata gtttaagtca 8100

ctattaaatt aatgattaat ttggaatagc ttttcagtgt agctgttctg atagtagtgt 8160

cgctatgcac ttcagaagga tgtgccatct ggcttagccg agtccctgtg gggctgatgg 8220

cttggggaat tggtcttgac attcccatta atatggtagg tagtttgtga tttaaagttg 8280

ggattggata gactacttat ttaaatgtta ggttacagat ggcgttctaa gatgccacag 8340

gatgtttatg tttcattttc ttttgaattt tgagggattt ttgaaatgat gcttccaatg 8400

gtttatttta tttttggctg tgtgcatagc attcggaaat tcctgggcta gggatggaac 8460

ctgagccaaa gtagtgacca tgcagagtcc cttaactgct aggacactag ggaatgccag 8520

tgcttttaat tttttttttc tttttatggt tgcacctgca gcttattgga agttccctgg 8580

ctagggattg aatttgagct gcagctgcca gcctacacca cagcttgtag cagcgctgga 8640

tctttaaccc actgagtgag gccagggatc aaacccgaat cctcatggag acagtgttgg 8700

gttcttaagc agatcagaca taatgggaac ttgtgatatg tatatatatt ttttggccat 8760

gcctgtggga tatggaagtt cccaggccag ctattgaacc cacaccataa tagttaccca 8820

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agacaggcca ctttcacaac aagcatgtct ttcttgtaga tccttaacaa gtagccaaca 8940

catactctgg cacttgagtt tttctcaaat tctctaaagt tgcagaaacg gggtccaagt 9000

cttgaggcac aacaggccat ggtttcacgg tcaaataaat atcaaagatg atcttgccag 9060

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actctttagt gtattattat aacactccac ttcctcctgc cagcttcttt tattgggtaa 9180

gatgctttct cttgcaaata atagaaaatc caatgcaaac aacttaaaca gtaaggggag 9240

ttaattggcc tctgtgactg aaaacttgag agctgtgggg gcaggcttca ggtgcaattt 9300

gatccagagg tttgtgacat catcaggtta ttttctttcc ctgccctcct ccatgtattg 9360

tcctcctcct cagactagcc tcctcatgaa agcagtcatg gccgcagaag ttccaagtat 9420

tacagctgta cttcatgcca cccagaggca gatggaacct gtgtcctaat attccaagcc 9480

gaagccccca ggctcagttg tatgattggc cttgaatcag ttacagtgac tgggagatgg 9540

aagcgtgttg tttgccttag tctagatcac atgctccatt cctggaacat ggggtaaaat 9600

tgacttccct ggaaagatgt ggattcccct gggggtcttg gaaagcatgc aggtggacct 9660

ctacatgtca aacagaaagt atcctcagcg ctctgcatat atatgttcct gtgtgaattc 9720

ttctgatagt ttatggaaac cttgagttag caagtgattc tgaaatctgt tctatagtca 9780

gcattgctct ttcagagaaa aaaaaaaaaa tcacttcttt ccgaggaaca aaatacatcg 9840

actgattgat ttcattgaaa tgtcagatcg aaccgaccag gcctggagat ggtcacagta 9900

aaggcagtca gtccatttgt gggaagatgg gaagtatctc tgtgccattt tctctgtgtc 9960

ctctgagagg gagggtgtca ctcattccta cctcaaggca cctagatgct aaaaagtaaa 10020

aaacaaagac aaaacaaaac aaaacgaaac gaaatgagac aaagctgtgc tggcatgatt 10080

aagtgaacat tggtttactt tattgttgta tttcatgttg tgtttttcag agtttttcac 10140

tcttacccgc tgactgtaac tcagcatttg ttttgccctc ttctgctctt tggattatcc 10200

aattgggata gaagtgtaaa aattagagcc cgtactcttg cttgagattt gtatttgaaa 10260

agttggtgaa gcaggtttaa ttacagagaa agattggctg cgtaattatt gttacctgca 10320

gcgcagctgt tgtctttctg cagctgtttc cataaataga tgccatatcc aggaatctac 10380

cccagggcaa agagttccca ttcagcctct tggcttaatt taaattactg gtttgaggta 10440

gttatttttg aaactcttct caggttgact tcccccataa gccctaaacc ttcttccctc 10500

atctgccaaa ttatatgtaa tgcatcgcag ctagagtgct tttggcattt cttgagtctg 10560

agaacttgaa atttgattta aatgttaatt tactgcgaca aaggttgggc actcatgttc 10620

ctatccctat acaagtcttt gcatggactt ggcatgggac cagctgtctc cctggcttct 10680

gcaacatctc tagagaatgg caagtgctct catctccacc ggttttattt taaagcagag 10740

tctggcctag ttcagagtgc atgaaagcat ttgtgatgct gctattgttg gcttttagca 10800

atacctaggg cttgtttgtt ccaggtgtag ctggcatgaa ataaaaaaaa aaaaaaaaga 10860

tttatattaa caaaaagtta actcgatttc tgttttaaaa aagatcatac tttttttttt 10920

tcctttttat agctgcatct gcagcatatg gaagttgctg ggttggtcga atcagagctc 10980

cagctgaggc ctatgccaca gccacagcaa caccaaatcc aagctgaatc tgcaacctac 11040

accacatctc atggcaatgg cgaatcctca atccactgag tgaggccagg gattgaacct 11100

gcatcctcat gaacactatg tcaggttctt aacccattga agcacaatgg gaattccttt 11160

ttttaaaaaa gttttacgcc tgtggcatat ggaaattcct agaccaggga ctaaatccaa 11220

gtcataactg tgatgtacgc agcagcttta tcaacattgg attctttagc tgtcaggcct 11280

ggggattgaa cctgcacctc cacagtgacc tgagctgttg cagttggatt cttaacccac 11340

tgcgccatgg tgggaactcc tatttttctt attttgatta ttaaatactt ccttattggt 11400

tacttttgtt tatgaacctt gctatttctt tttggtatct ctgttttggc ttttcagtgc 11460

atacctaaaa aaaaaaattt tttttaatgg atcagaaata atgtgtttgt ggattcacaa 11520

aaatcattag taattaataa tgaattatat aatcctcagc ctttcccagt tctctataaa 11580

atagcccaac tgaatgtagt cagaataggg ggacatttgt ttatgttgct gagacttaag 11640

caagaagact gacctttatg agatacagga tatgtgagta actccttcat gggaagaatt 11700

aaatgtactt ccctctcagt attaacagta tgaatatatg tgagtattta gttttagtat 11760

atttagtttt agtattattt agttttagta tactaaattg acttctgcat tttggaagca 11820

tttagaagga atggcccaga tgcatttatt tctacatcct ggtgatatta gagaaagcaa 11880

cataaaacat agacgcacac ttcacacact ttctgtgttc acgtggttga aagaatttta 11940

gtactctcaa cagccatcag atttgaagcc ttgggcattt aacattctgc tgttgggaat 12000

gcaatttagt gtgggcatcg aatgcagcct ttgcattgtg actctgtttc cacttggtac 12060

actttcactt tgagttaaag ggaaaccagt atttatggtc tattggttac atgttaattt 12120

gacttcgctg ttctagcacc atgtctgttg gcatgagcgt aagaatattg aggtcacttt 12180

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taagtcagtg ttgattcctg gaatgaaatt tctcccttta gatgtaatct tacaagtggt 12300

gattaagttc ttttaacaca gaatgtgaca cactcttaac taatcataag caaaattcct 12360

tgatctctct gaggttcctt atcttaaaat ggagatgata aaacctacct catggagtgg 12420

tgaggattaa attaattaat gcatggaaag ttcttgatat agcatctgat atgtggcaag 12480

tactcagtaa atgttagcat catttttaaa cattacttcc tgggaaaatg cattctgcat 12540

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tgacattgcc aggcaagggc tggtggaaag gggtgggttg ggttctcttg ctaaagtttg 12660

gcaacttctg gttgggaaga gaggatgctc taaagaagaa aacggcaacc ctggcttcct 12720

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tggctgtcag ttggcagatg gggggcttct aacagcttgg caacaattgt agctccttca 12840

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agccatttgg aactaccagt gcttcgtttc tccattggtg ctgagaaccc atctgaagtc 12960

cttctgctca ttcacgttgt ccccctttct ctctttccta cagcaagaca ccatggccaa 13020

aatggaggtg aagacgtcac ttctggacaa tatgattgga gttggagata tggttctttt 13080

agaacctctc aatgaggaaa ctgtcatcaa caacctcaag aagcgctttg accatagcga 13140

gatatatgtg agtgtccatg gaaggtcatc tgtggggtgt agactttgtg ttttgtggga 13200

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attgtgttgg gtgttggggg tgctctaaag ccagtggaag acagttctgc cctccaagga 13440

acatgtattc aggaggaaat tagaaactat aggcatcttt ttggatacct tcgtaagata 13500

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catgaacttt cttgacattt gtcgttagta gagataggaa cagatgacca gattatgaaa 13620

gtgtatttgt acatgtatgt gtaaatgggt caccatgctc cctcagtaga aaattcacag 13680

aacactgtaa accagctgta atgaaaaaaa aaatcattat atagataaaa atcattatat 13740

agttcccatt gtggcgcagt ggttaacgaa tccgactaga aaccatgagg ttgcgggttc 13800

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aaaagacaaa aaaaaaaaaa acgaaaaaac ttaaagaggg aaaaaaaaga aaaatgtatt 14040

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tttcactgtt actctatcaa gtttcttaaa tatatttatt ttatttttta tttttatctt 14460

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gaattagatt attgggacat gcttcatgtc agtctatcaa tgtgggagca agtaggagga 15060

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cactcatggc atgcgaaagt tccttggcca gggatcaaac ctgcactgca gttgcagcaa 15420

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acttttcgtc tttgtgattt ttgattgttg gaggtagggg gaggctgaca gtgacatgag 15660

atttttggaa accactttgg aatattaatc tgataactag atactaaact aagtttagag 15720

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aactttaaaa gacatcttat tagagagttg ggcattctct attttaggca aaaaagggaa 16380

aaaaaaagca atttgtaggg taatgtgtat agtatgatcc tatttttttt aatggatatt 16440

tatagttggg tacctttgtt tgtatatctg tatgagcatt gagaaaggca cgctaacttt 16500

aggcactaca atggggtgga atgggatatg gggacaagaa agagttaata ctctgtatta 16560

taggacttgt taagtcaagc atgtattgtt tttgtaatta aaaaaaaaat tactgtatag 16620

gctttccctg gtggcacagt gggttaagga tccagtgttg tcactgctgt ggcttgggtc 16680

actgctgtgg cgcaggtttg atccctggcc caggagcttt ttgcatgctg tgagtgctgc 16740

ccccccccca aaaaaaaatt accttacagt aatgttgatt actccacctc taacccacac 16800

attgtggata ccacccttgg gaaatctgtt tcttgctctt attccgataa tattcctgct 16860

ctgcctttgt tcacgggttg ctgcaaaatt gtttagcctg atgccaaagg ccaagtgttt 16920

tactatcttg tatttcactt tgtttcgtga tactttccca gaaaatgaag gtgcagtttt 16980

tttttatttt attttttaag tccctgttgt agtctgatag ctttatttta tcatgtaaaa 17040

gtatgtgatg gtctacagtg acccatcatg caaacatttt ggacagtcat ttctatgttc 17100

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actggttctt ctcttagatg gggcagcatc ctgtgtgaat cagctctcca tcagggaacc 17220

ccgttcttcc ttttgccttc tacacctgcc ccccgccacc atatctagag ttaagaaata 17280

gtccctgcct ttacagagtg ctcatgaatt agcaactcta gagcatttac aatgcctagt 17340

gatcctctgg atctccaacc aactgaatct gaaagtggaa tcccttgtga tcctgtcatt 17400

acacctgaag ctctgggtaa gcccacttga gtcacacatc ctcttcagac cactgactgt 17460

ggctaggtga ccagaatgag ctgagtggct taagaaaatg atgtctactc ctcagacttg 17520

gggagggtca gctttttcta aagtggatga gttgtgtgtt agttgggttg aatactatgc 17580

taaatacaac catctgtatg ataggaagaa gggggaatag atgctgatga gacctgctgc 17640

tgtaaccccc tacatgtttg gtaggaaatt ctgtagtgaa gtggttttat tggtgttggt 17700

accaccctaa agggtattcc ccctgagaaa catttatcct tggagttcca tggttcaagt 17760

gtacccaaac acacgctcct taagactttt ctcttagaga actcatggca gagaagagtg 17820

aacaggggcc ccaggaagac agcatagtta agtctatcca cttcagggaa attttgttga 17880

aatctttgct tccaaagcca ttcagagttt tattctcttc catgggtttt gtcttactgt 17940

atgctcgttg caacccttct ttgaataaga agtattttta gtgttgacac gtagttttag 18000

tttgtttcta ggaattgtca agttggggac gtcgagctgt agaggtctga attagtccta 18060

ttttaagatc ttatgttaaa ggaattgtag ttgtaagagg actcctttga aagtctagta 18120

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ggtccagtac tttaataaaa gatactcaag tgcctgcttc aggattatct gttctttgct 18240

ttgaggttgg tttatacact tgttacgagc cctgagttgg ctcataaccc tgtccttagc 18300

caggcatagt ctctaaatct gcgagttcca gctattgatg tggtctttgc gggaaggctg 18360

ttcctttaga gatggaggca gatcaggtga agacagatag agggactgtt gccctgatgg 18420

ggtaacacac agggtcagag attgtttgcc ttgattcctc actcttgtca gagctcggtg 18480

caagctggga ccagctgcag gacgtgccat tgctccagtg gcctttgtgg ggtcactggt 18540

gggaaacgct gctgtgacat tcttgagcac tggctgctct tctgtatttc tggcttttgt 18600

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acatggactt gcagtataga agatgcagcc agacgtgatt ctgtttttag ggtgactggt 18720

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agaggtctga aataggatct tttaggatgt tagattaaat taattgtaga tgtaagagag 18960

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agttaaggat ctggtgttgt cattgatgtg tcacgggttt gatccctagc cccaggaaat 19080

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tgaaaataat accagttaac atttttatat ttatttgaag tgtcaaaacc acttttctct 19320

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tgagactttg gtataaatga ggtattagtt ttcttttgct gcagaatagg ttgtctaaaa 19440

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ataagtgcct taactccttg gagacttttt cttattggta aaatgataag tgataacaat 21480

taacatttat taaatcctta ctgatacttg ttgttctaag cactttacgt gctttttttt 21540

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tgtctgcgat cccactaggg cttccacctg ctcgagggca agccagcggt accagctgac 25020

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tccgacttat ctgtagctga cactggcctt tctttcattc aaacccaaag tacttcttta 27600

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agatagaggt ataaaagatg ggaatgcctg gctcttctcc agaccataga atctctgaga 29460

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gcattctcca gaaaagactt cagttttcag tgcaatcaca ataggagcac tcaggtgtta 29640

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ggatataccc taacacacaa atgttcgagc ctctgcttgt atctcattgg tcaaatcagt 32340

cacgtagaca agtccagatt gaaaggatgg aggtaagctc caggcatccc tgcaaggatc 32400

ctaccacagt aggacaaagc aaccgagggg caaggatatt gtttaaggat ttgattggtg 32460

gcaacacatg gcgtatgggt ttaataaact attaggcacg gtataacagt gtacttggta 32520

ttgtatttca acaaagaata actgtatgaa agtggtttgt accatccact ttcttagtga 32580

tgaacaggcc ctgtgtgaat cagtcattca gtttgttatt tatggggcat catacatggg 32640

ccagacctga cctaggtggt agggaaacag ctggggaaaa aaaagcacac ataattcact 32700

atgtataaaa gtcacaagta acaagaaact taagacttgc tagtgtagct tttgagtttg 32760

agtttgaggc agccaagttt gttctccatg caagaatgcc acacaggcag atttttatca 32820

agaatttagc cactgtgaaa tttggtttta aagagcaact tgataattgg tttctctgct 32880

aacagccaat gtatgtttta attattgtag tcaagaagct acctacaaag ggagattcat 32940

gtacttttct gctattttta tttttagggc cacacctgag gcacatggaa gttcccaggc 33000

taggggttga atcagagctg tagctgctgg cctacaccac agtcacagca gtgtgggatc 33060

caagccgagt ctgcgaccta cgccacagct cacagcaaca ctggatcctt aatccactga 33120

gcgaggccag gaatcgaacc tgtgtcctta tggatgctag tcagatttgt ttccactgag 33180

ccatgatggn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 33240

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc ttatggatgc 33300

tagtcagatt tgtttccact gagccatgat ggaaactctg atgaaggcta atcttttaat 33360

caacagatgt taaggaaata aaccaatcat tgtattttca tatctaccaa tctaactaat 33420

tttagtatat tatataggct actcaaatga tcattcggtc tccatcatct cccatatact 33480

tgcccaggtg ggttggaatg tgaagaaacc ttggaaaagt cttgtcaaaa tgggataagt 33540

taggaaactt ggagttatct cttgtcaggc aagattaatt aggtcctaat gctagcctgt 33600

cagaaataaa ggtgaaaaat tgcttgggaa ctgagagttt ttctttcaca gcagcagtct 33660

tgtcacctct tgataagatt gcattcttct ggcatgaaag gaggtataaa aatcacctgt 33720

tcagttttcc aggttagggg aagtctttca taattaaaac aattgtgacc catgttttaa 33780

aagaatcaga acattcctac tgttctgttt tctgttctgt ttaattttcc agaaagatct 33840

gacaatttcc tcgactccag cggtggcagt actagaaaaa gttgttgcct aaaaatgtca 33900

ccttttgttg catgaccaat gggaagttgg aggagacttt tgttcttcct tcttttcctt 33960

tctttttttc acctttttct taaaaaaaaa ttttatcact gacatatttt tgttagtatc 34020

cctcctccca ccctagccat ctttataatg ttgaaactga aaggaagaat ggagctgcta 34080

aaataagtta cagttaagtg acttttgatt gcagcactgt gctagtcttt gtacagaatg 34140

acctaaacca accttgctgt caggaattta agatcgaaat gaaaaggaag ataaaatagt 34200

gttctgattt gcagtgtgag agggttactg tctgctaaaa tagaatactg atccctctga 34260

aagtaccttt aaattctaca ttaaatttat tatttttaaa tttttattta tttttttggt 34320

ttttagggcc acacctacgg catatggaaa ttcctaggct agaggtctaa ttggagctgt 34380

acctgccggc ctgcatcaca gccacagcaa tgccagactt gagccacgtc tgcaacctac 34440

accacagcaa cactggctcc ttaactcact gagtgaggcc agggatctaa cctgcatcct 34500

cgtggatact agtcgggttt gttactgctg agccataaca gtaactcctt ttctacataa 34560

aatttaaatt cgacatgaag tatactcttt cataaagtac acttaaattc tgatgttaca 34620

gtcctctaga tataatatga tatcatttcg ttggaatgcc cacgggataa ctgtggctct 34680

cataccgaat ggtctgagcc cactgtagag agtaacaggc tctgtaaggg cagtgccaga 34740

gtcacagccc cattggatag gtatggccgt gggcagggag gaggggaagc ctggattgct 34800

gtgcgctgaa acaggagaat aaagatgaga gaaacaaaca ccagttctaa ctggaatcaa 34860

ggagagcatg gctcttgctc acaattagcc acggttggtg atgaaatttt tggcaagtat 34920

aacagggctt ttggagaact cttatccagc ctcatgaatt agtctagaga tttattttga 34980

aaagtatttt cagtgtataa atctatgctt tccatttatc agcaaaatga ataaacatta 35040

ttgatcatct gtcttcagag atgcaaagtg ttcttaaaaa gtaaaaaatg aatggccagg 35100

cagtagaact cgtgttttga aaggatgaaa ccatgtgata ccatgactta aagatattaa 35160

aacgggtata ttttattctt ccttttgcag acatacattg gaagtgtggt tatatctgtt 35220

aacccatacc ggtccttgcc catttattca ccagagaaag tggaagatta caggaacaga 35280

aatttttatg aactgagccc tcacat 35306

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 2

taacccatac cggtccttgc 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 3

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<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 4

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<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 5

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<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 6

ttcacagtgg ctaagttccg c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 7

ttcacagtgg ctaagttctg c 21

Claims (10)

1.一种猪皮下脂肪相关的环状RNA，命名为circRNA_11897，序列与SEQ ID NO.1具有90％以上序列同源性。

2.一种检测皮下脂肪的试剂，试剂采用测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测样品circRNA_11897的表达水平。

3.权利要求2所述的试剂，其特征在于，采用高通量测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术检测样品circRNA_11897的表达水平，优选的，试剂含有检测circRNA_11897的探针或用于荧光定量PCR的引物。

4.根据权利要求2-3任意一项所述的试剂，其特征在于，样品为皮下脂肪组织，优选的，样品为猪皮下脂肪组织。

5.下述任意一项应用：

circRNA_11897在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

circRNA_11897在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

circRNA_11897在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

权利要求2-4任意一项所述的试剂在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

权利要求2-4任意一项所述的试剂在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

权利要求2-4任意一项所述的试剂在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

6.一种检测皮下脂肪的试剂，检测circRNA_11897相关基因的表达水平，其特征在于，相关基因为ssc-miR-27a、ssc-miR-27b-3p和/或SCD。

7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，试剂通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测circRNA_11897相关基因的表达水平，优选的，试剂包含特异性扩增ssc-miR-27a的引物；或特异性扩增ssc-miR-27b-3p的引物；或特异性扩增SCD的引物。

8.下述任意一项应用：

权利要求6-7任意一项所述试剂在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

权利要求6-7任意一项所述试剂在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

权利要求6-7任意一项所述试剂在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

9.一种检测猪皮下脂肪含量的方法，包括：(1)选取猪皮下脂肪组织；(2)检测样品中circRNA_11897和/或其相关基因的表达量。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，相关基因为ssc-miR-27a、ssc-miR-27b-3p和/或SCD。