CN104232645B - 一种过氧化物酶基因dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种过氧化物酶基因dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用。本发明所提供的dsRNA，为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。实验证明，饲喂过氧化物酶基因dsRNA后，麦长管蚜过氧化物酶基因有不同程度的降低，说明麦长管蚜通过口针摄入的dsRNA进入了麦长管蚜的细胞内发生了RNAi级联反应，目的基因的表达受到了干扰。在形态学角度来看，麦长管蚜的生长状态均发生了变化，饲喂过氧化物酶基因dsRNA的麦长管蚜的蜕皮指数和存活率均比对照显著降低。这表明过氧化物酶基因dsRNA可以用于麦长管蚜的防治，本发明为下一步利用植物介导的RNAi技术创建小麦新种质奠定了基础。

Description

一种过氧化物酶基因dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种过氧化物酶基因dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用。

背景技术

小麦是我国的主要粮食作物。小麦田内害虫种类很多，主要害虫有地下害虫、小麦吸浆虫、麦蚜、麦蜘蛛、食叶的粘虫等,其中麦蚜对小麦的危害最为严重。麦蚜属同翅目蚜科，俗称腻虫、由汗、蜜虫等，是我国小麦上的主要害虫之一。其种类主要包括麦长管蚜(Sitobion avenae)、麦二叉蚜(Schizaphis graminum)、禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padiLinnaeus)、麦无网长管蚜(Acyrthosiphon dirhodum)等。麦长管蚜、麦二叉蚜和禾谷缢管蚜在世界各个地区广泛分布，我国小麦种植区内均有发生。麦二叉蚜主要分布在西北、华北地区，麦长管蚜危害南北麦区，禾谷缢管蚜在南方地区发生严重。麦蚜的发生受气候影响较大，在小麦生不同的生长期内，麦蚜的危害优势种有所不同，在小麦拔节期，麦二叉蚜种群密度大，到达抽穗期，麦长管蚜逐渐变为优势种，麦二叉蚜与麦长管蚜混合发生，小麦抽穗以后，禾谷缢管蚜发生严重。

麦蚜以若蚜、成蚜聚集在小麦叶片、茎干，吸食小麦汁液，造成小麦叶片出现黄斑或枯萎，在苗期危害严重时造成小麦苗枯死，后期危害穗部，造成小麦籽粒干瘪，使小麦品质变劣，产量降低。麦蚜排出的废物覆盖在叶片上使叶片变黑，光合作用受到严重影响。此外，麦蚜还分泌毒素，传播病害，严重影响小麦产量和品质。因麦蚜的危害造成小麦减产一般在10％-20％，麦蚜危害严重时小麦减产量达到30％。麦蚜还可以传播小麦与大麦黄矮病毒，使小麦产量降低。

RNAi的基本过程包括起始阶段和效应阶段。在起始阶段，dsRNA穿过细胞膜进入细胞后，细胞质中的一种RNA酶Ⅲ家族的内切酶Dicer酶特异识别dsRNA，Dicer酶将dsRNA切割成许多21bp-23bp的小片段(small interference RNA，siRNA)，每个siRNA都有2个突出的核苷酸。效应阶段，siRNA与一个酶复合物形成一种沉默复合物(RNA-indueed sileneeingeomplex，RISC)。在ATP存在的前提下，携带的双链siRNA被RISC变成单链siRNA分子，变成具有活性的RISC(Slicer)。之后Slicer与外源性基因表达的mRNA分子结合，RISC在结合部位开始切割mRNA。切割后的mRNA诱导细胞降解这些mRNA片段。siRNA还能引导目的RNA结合RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)，合成新的dsRNA，然后由Dicer酶切割产生新的siRNA，又引发新一轮的合成切割过程，沉默信号逐渐扩大。

目前常用的dsRNA导入的方法有注射法、浸泡法、饲喂法、组织培养法、植物介导法等。注射法是通过显微注射仪将dsRNA导入到昆虫体内，是目前最常用的方法。这种方法既有优点又有缺点，优点是效率高，缺点是体外合成保存dsRNA成本高，难以避免注射的伤口影响昆虫生长。浸泡法是用dsRNA溶液浸泡昆虫组织或细胞，可以有效地抑制基因表达。浸泡法有一定的局限性，只适合于昆虫一定的发育阶段和易吸收dsRNA的细胞组织，在研究中应用较少。饲喂法操作方便且简单，对昆虫的影响小。喂食dsRNA在许多昆虫中都取得了成功，例如半翅目、鳞翅目、鞘翅目昆虫。组织培养法将dsRNA混入培养基，昆虫细胞从培养基里吸收dsRNA。目前利用这种方法取得成功的昆虫有果蝇、埃及伊蚊、白纹伊蚊。这种方法要求的培养基条件严格，不容易培养得到符合要求的细胞，对这种方法的使用受一定限制。转基因植物介导法是借助植物持续不断的产生稳定的dsRNA，昆虫持续取食这种植物会不断的摄入dsRNA。但是这种方法也有一定的局限性，不同昆虫或同一昆虫的不同基因对通过口腔进入的RNAi的敏感性不同，影响喂食dsRNA的成功率的关键因素是昆虫的上皮细胞摄入dsRNA的效率。Walshe等发现利用喂食方法可以抑制刺舌蝇(Glossina morsitansmorsitans)中肠表达TsetseEP，却不能抑制脂肪体的传递蛋白基因2A192的表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种过氧化物酶基因(POD基因)dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用。

本发明所提供的dsRNA，具体为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。

编码所述dsRNA的DNA分子也属于本发明的保护范围。

所述DNA分子的核苷酸序列具体为序列表中序列2。

含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因系细胞系也属于本发明的保护范围。

所述dsRNA、或所述DNA分子、或所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因系细胞系，在如下(a1)-(a5)任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(a1)防治麦长管蚜或制备防治麦长管蚜的产品；

(a2)降低麦长管蚜存活率或制备降低麦长管蚜存活率的产品；

(a3)抑制麦长管蚜生长或制备抑制麦长管蚜生长的产品；

(a4)降低麦长管蚜蜕皮指数或制备降低麦长管蚜蜕皮指数的产品；

(a5)抑制麦长管蚜过氧化物酶基因表达或制备抑制麦长管蚜过氧化物酶基因表达的产品。

进一步，所述应用为将所述dsRNA导入麦长管蚜，从而实现防治麦长管蚜、降低麦长管蚜存活率、抑制麦长管蚜生长、降低麦长管蚜蜕皮指数或抑制麦长管蚜过氧化物酶基因表达。

在本发明中，所述导入的方式具体为饲喂。

更加具体的，所述饲喂为：将所述dsRNA混合于液体饲料中，得到混合液；用所述混合液饲喂麦长管蚜；所述dsRNA在所述混合液中的终浓度具体为20ng/μL。

所述饲喂持续的时间可为4天以上，具体如4-6天。

在本发明中，所述麦长管蚜具体为1-2龄麦长管蚜，具体如2龄麦长管蚜。

活性成分为如下A-C中任一种的产品也属于本发明的保护范围：

A、所述dsRNA；

B、所述DNA分子；

C、所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因系细胞系；

所述产品具有如下(a1)-(a5)功能中的至少一种：

(a1)防治麦长管蚜；

(a2)降低麦长管蚜存活率；

(a3)抑制麦长管蚜生长；

(a4)降低麦长管蚜蜕皮指数；

(a5)抑制麦长管蚜过氧化物酶基因表达。

另外，抑制麦长管蚜过氧化物酶基因表达的物质，在如下(a1)-(a4)任一中的应用同样属于本发明的保护范围：

(a1)防治麦长管蚜或制备防治麦长管蚜的产品；

(a2)降低麦长管蚜存活率或制备降低麦长管蚜存活率的产品；

(a3)抑制麦长管蚜生长或制备抑制麦长管蚜生长的产品；

(a4)降低麦长管蚜蜕皮指数或制备降低麦长管蚜蜕皮指数的产品。

本发明将麦长管蚜POD基因dsRNA(序列1)采用体外饲喂的方法饲喂麦长管蚜，实际上是利用RNAi技术对POD基因的表达进行干扰。结果显示，从mRNA水平上检测饲喂后的麦长管蚜POD基因有不同程度的降低，说明麦长管蚜通过口针摄入的dsRNA进入了麦长管蚜的细胞内发生了RNAi级联反应，目的基因的表达受到了干扰。在形态学角度来看，麦长管蚜的生长状态均发生了变化，饲喂POD基因dsRNA的麦长管蚜的蜕皮指数和存活率均比对照降低。这表明POD基因dsRNA可以用于麦长管蚜的防治，本发明为下一步利用植物介导的RNAi技术创建小麦新种质奠定了基础。

附图说明

图1为麦长管蚜总RNA的提取结果。

图2为麦长管蚜过氧化物酶基因(POD基因)cDNA片段的PCR扩增。M为标准DNAmarker；1-3为不同退火温度(55℃57℃60℃)得到的结果，箭头所指为POD目的带。

图3为体外转录所得麦长管蚜POD基因dsRNA和GFP基因dsRNA的琼脂糖凝胶电泳结果。M：D2000plus；1：麦长管蚜POD基因体外转录产物dsRNA；2：GFP基因体外转录产物dsRNA；可以看到，得到目的转录产物。

图4为不同龄期麦长管蚜POD基因的表达量分析。其中，L1-L4为1-4龄麦长管蚜幼虫，Adult为麦长管蚜成虫。图中，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

图5为不同浓度的dsPOD饲喂麦长管蚜后POD基因的表达水平分析。图中，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

图6为饲喂dsPOD后不同处理组中麦长管蚜的存活率统计。图中，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

图7为饲喂dsPOD6天后不同处理组中麦长管蚜的蜕皮指数统计。图中，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

图8为饲喂dsPOD6天后不同处理组中麦长管蚜POD基因的表达水平分析。图中，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

麦长管蚜(Sitobion avenae)：从中国农业大学上庄实验站小麦试验田获得，按照“王春芝，3种小麦蚜虫的形态识别与防治技术，农技服务，2008，25(3)：50,58”一文记载的方法，鉴定证实确为麦长管蚜(Sitobion avenae)。其形态学特征如下：无翅孤雌蚜体长3.1mm，宽1.4mm，长卵形，草绿色至橙红色，有时头部带红色或褐色，腹部两侧有不明显的灰绿至灰黑色斑。触角黑色，第3节有8—12个感觉圈排成一行。腹部第6-8节及腹面具横网纹，无缘瘤。喙粗大，黑色，长度超过中足基节。腹管长圆筒形，黑色，长为体长的1/4，在端部有十几行网纹。有翅孤雌蚜体长3.0mm，椭圆形，绿色。喙不达中足基节。腹管长圆筒形，黑色，端部具15～16行横行网纹，尾片长圆锥状，有8～9根毛。若蚜体绿色，有时粉红色，复眼红色，一般体较短。麦长管蚜的饲养条件是：温度(22±1)℃，光周期16L∶8D，相对湿度控制在85％-90％。用温水浸泡小麦种子4h-8h，然后将小麦种子种在直径8cm，高为12cm的花盆中，放在人工气候培养箱中培养(温度22±1℃，光周期16L∶8D，RH85％-90％)。待5天后，小麦叶片长出约5cm时在小麦上接蚜虫。

pEGAD质粒：GenBank NO:AF218816.1，购于美国俄亥俄州立大学。在文献“RandomGFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells ofArabidopsis at a high frequency”Proc Natl Acad Sci USA.97(7),3718-3723(2000)中报道过。

总RNA提取试剂TRIzol，FastQuant RT Kit(With gDNase)，PCR产物纯化试剂盒，质粒小提试剂盒、荧光定量试剂SuperReal PreMix(SYBR Green)均购自天根生化科技(北京)有限公司。T载体pMD19-T Simple Vector、Ex购自TaKaRa。T7RiboMAX expressionRNAisystem购自promega。2×Taq MasterMix购自北京艾德莱生物科技有限公司。乙醇、异丙醇均为国产试剂。

麦长管蚜的人工饲料：制备过程可参考文献“李彩霞,高丽锋,高玲玲,李润植.全纯人工营养液饲养蚜虫的研究.山西农业大学学报,1997,17(3):225-228.Li C X,Gao LF,Gao L L,Li R Z.Study on the rearing of aphids on a artificially holidicdiets.Journal of Shanxi Agricultural University,1997,17(3):225-228.(inChinese)”进行，用0.2μm的细菌过滤器过滤人工饲料，分装到2.0mL灭菌的离心管保存于-20℃的冰箱中，避免反复冻融。

实施例1、麦长管蚜过氧化物酶基因dsRNA的获得

一、麦长管蚜总RNA的提取及反转录

1、总RNA提取

1)取50头麦长管蚜放入无RNA酶的1.5mL EP离心管中，加入60μLTrizol Reagent，用电动研磨器研磨至匀浆状态；

2)取出1-2μL总RNA进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，同时用NanoDrop测定260/280吸光值、260/230吸光值和核酸浓度，剩余的放于-80℃备用。

结果如图1所示，可见提取的总RNA比较完整，总RNA的5S、18S、28S条带比较清晰，RNA未降解。

2、反转录

按反转录试剂盒进行操作，操作如下：

(1)配制基因组DNA去除体系混合液：5×gDNA buffer2μl；总RNA1μg；RNase freeddH₂O补足10μl。

42℃孵育3min，冰上放置。

(2)配制反转录反应体系混合液：RT Enzyme Mix1μl；10×Fast RT buffer2μl；FQ-RT Primer Mix2μl；RNasefree ddH₂O补足10μl。

(3)将步骤(1)配得的混合液加入步骤(2)中配得的混合液中，充分混匀。42℃孵育15min之后95℃孵育3min。将反转录后得到的cDNA存放于-20℃保存。

二、含有麦长管蚜过氧化物酶基因片段的重组质粒的构建

根据豌豆蚜的过氧化物酶基因(POD基因)(GenBank登录号：XM001947380.3)序列设计引物，引物如下：

引物PODF：5’-CATTGATTGGTAACGTTGATGG-3’(序列5的第1-22位)；

引物PODR：5’-CAGCAATAACACAACTTCCAGT-3’(序列5的第363-384位的反向互补序列)；

以步骤一反转录所得cDNA为模板，采用引物PODF和PODR进行PCR扩增。反应条件是：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。

将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。如图2所示，可见PCR产物大小为384bp。将PCR产物胶回收后与pMD19-T Simple Vector相连，得到重组质粒，命名为pMD19-POD。测序表明，重组质粒pMD19-POD在pMD19-T Simple Vector的缺口处连入了序列表中序列5所示DNA片段。

三、麦长管蚜过氧化物酶基因dsRNA的获得

1、引物的设计

体外合成dsRNA需要带有T7序列的引物，利用Primer5.0设计并合成如下引物：

针对POD基因的引物对如下：

dsPODFt：5’-TAATACGACTCACTATAGGCGCGAACCCCAGCCAT-3’(无下划线部分为序列2的第1-16位)；

dsPODRt：5’-TAATACGACTCACTATAGGCGTCAACCGATGAATAGAA-3’(无下划线部分为序列2的第229-247位的反向互补序列)。

针对作为对照的GFP基因的引物对如下：

dsGFPFt：5’-TAATACGACTCACTATAGGCACAAGTTCAGCGTGTCCG-3’(无下划线部分为序列4的第1-19位)；

dsGFPRt：5’-TAATACGACTCACTATAGGGTTCACCTTGATGCCGTTC-3’(无下划线部分为序列4的第402-420位的反向互补序列)。

引物中标有下划线的序列为T7启动子序列。

2、合成DNA模版

将步骤二所得重组质粒pMD19-POD稀释成浓度为5ng/μl，作为模板，用带有T7启动子序列的引物对dsPODFt/dsPODRt做PCR合成带有T7序列的DNA。

将pEGAD质粒稀释成浓度为5ng/μl，作为模板，用带有T7启动子序列的引物对dsGFPFt/dsGFPRt做PCR合成带有T7序列的DNA。

PCR反应体系：2×Taq Master Mix10μl；ddH₂O8μl；上游引物0.5μl；下游引物0.5μl；模板1μl。

反应条件：94℃3min；94℃30s、53℃30s、72℃40s，38个循环；72℃10min。

反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示，采用引物对dsPODFt/dsPODRt扩增得到大小约为285bp的DNA片段，进一步测序为“TAATACGACTCACTATAGG+序列2+CCTATAGTGAGTCGTATTA”。采用引物对dsGFPFt/dsGFPRt扩增得到大小约为458bp的DNA片段，进一步测序为“TAATACGACTCACTATAGG+序列4+CCTATAGTGAGTCGTATTA”。

3、合成dsRNA

以步骤2获得的两端带有T7启动子序列的DNA片段为模板，利用T7RiboMAXexpression RNAisystem(promega)试剂盒体外高效转录生成麦长管蚜的dsRNA片段。

体外转录的(T7RiboMax)反应体系：RiboMaxTM Express T7 2×buffer 10μL；DNA模版1μg；Enzyme Mix2μL；RNase Free水补充至20μL。

1)将上述溶液轻轻混匀，置于37℃中金属浴中孵育2hr-6hr；

2)孵育结束后将反应液放于70℃水浴10min，缓慢降至室温，约20min；

3)向冷却至室温的反应液中加入lμL RQ1RNase-Free DNase和1μL RNaseSolution(RNase Solution稀释200倍)去除模板DNA和单链RNA，37℃温浴30min；

4)加入与管中溶液等体积的3M醋酸钠水溶液，冰浴5min；

5)15000rpmin离心l0min；

6)弃上清，用500μL70％(体积分数)乙醇洗两次，弃上清，空气中干燥15min，加50μL RNase Free水溶解；

7)将产物电泳检测后，放于-80℃超低温冰箱中保存。

反应结束后，取反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图3所示，M：D2000plus；1：麦长管蚜POD基因体外转录产物dsRNA；2：GFP基因体外转录产物dsRNA；可以看到，得到目的转录产物。

将麦长管蚜POD基因dsRNA和GFP基因dsRNA分别测序，结果如下：

麦长管蚜POD基因dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列表中的序列1，其反义链的核苷酸序列为序列表中的序列1的反向互补序列；

GFP基因dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列表中的序列3，其反义链的核苷酸序列为序列表中的序列3的反向互补序列。

当然，也可以直接人工合成序列1所示的麦长管蚜POD基因dsRNA和序列3所示的GFP基因dsRNA用于下述实施例。

实施例2、麦长管蚜POD基因dsRNA在防治麦长管蚜中的应用

一、不同龄期麦长管蚜POD基因的表达量分析

在做饲喂实验之前，挑取处于不同龄期的麦长管蚜分别检测POD基因的表达量。每个龄期(1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫和成虫)选取20头左右的蚜虫提取总RNA然后检测基因表达量。

利用Primer5.0分别设计不同基因的荧光定量引物，荧光定量引物如下：

用于检测麦长管蚜POD基因的引物：

PODRTF：5’-TCCCGCCCTACACTAAAAT-3’(序列2的第122-140位)；

PODRTR：5’-TCAACCGATGAATAGAAAT-3’(序列2的第237-245位的反向互补序列)。

用于检测内参基因RpL7Actin的引物：

内参基因RpL7ActinF：5’-CCGAAAAGCTGTCATAATGAAGACC-3’；

内参基因RpL7ActinR：5’-GGTGAAACCTTGTCTACTGTTACATCTTG-3’。

采用的荧光定量试剂盒为SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)，所用的PCR反应体系为：2×SuperReal PreMix Plus10μL，50×ROX Reference Dye2μL，ddH₂O5.8μL，上游引物F0.6μL，下游引物0.6μL，cDNA模板1μL。扩增反应条件为：94℃15min；94℃10s，54℃20s，72℃30s，40个循环。每个样本重复3次，最后结果用2^-△△Ct法(Ct表示循环数)进行计算，△△Ct＝(目的基因的Ct-内参基因的Ct)_实验组-(目的基因的Ct-内参基因的Ct)_对照组，对照组是将3龄幼虫的△Ct＝Ct_目的基因-Ct_内参基因定义为1.0(100％)，其余龄期为实验组，计算各组的平均值，进行差异显著性分析。

结果如图4所示，可以看出，1龄、2龄麦长管蚜的POD基因表达量显著高于其他龄期(P<0.05)，3龄、4龄、成虫期的表达量差异不显著，说明POD基因主要在1、2龄若虫期发挥作用。同时考虑到蚜虫太小不便操作，后续试验中采用2龄麦长管蚜作为研究对照。

二、dsRNA的饲喂及最佳饲喂浓度的确定

1、麦长管蚜的dsRNA饲喂方法

饲喂麦长管蚜时采用的是两端开口直径为2-3.5cm、长度为3-4cm的玻璃通管。将Parafilm膜截成1.5cm²，用手拉展开膜覆盖在玻璃管的一端，放在紫外灯下照射15分钟，然后在Parafilm膜表面加上150μL的人工饲料或者是人工饲料与dsRNA的混合液，再在其上面另覆盖一层Parafilm膜。将麦长管蚜放入管内，玻璃管的另一端用细棉纱网封住以防止蚜虫逃逸。将玻璃管放到光照培养箱中饲养，温度22℃±1℃,相对湿度为85％～90％，光周期16∶8(L∶D)。选用同龄的蚜虫为供试群体，饥饿4小时左右后接入玻璃管内，每管内接麦长管蚜15头，每个处理重复2管，实验重复3次。

2、饲喂浓度的确定

为了确定比较合适的POD基因dsRNA的饲喂浓度，先采用三个不同浓度的dsRNA饲喂麦长管蚜(2龄幼虫)，饲喂实验在饲喂6天后检测基因的表达量(具体操作参见步骤一)。采用三组不同的POD基因dsRNA终浓度分别为5ng/μL，10ng/μL，20ng/μL(以5ng/μL为例，为将POD基因dsRNA与人工饲料混合，形成混合液，POD基因dsRNA在所述混合液中的终浓度为5ng/μL。其余浓度所表示含义以此类推)。在实验中以相同浓度的GFP基因dsRNA的饲喂为对照。将5ng/μL POD基因dsRNA组的△Ct＝Ct_目的基因-Ct_内参基因定义为1.0，计算各组的平均值，进行差异显著性分析。

结果显示，采用三种不同浓度的POD基因dsRNA饲喂麦长管蚜时，与对照相比，麦长管蚜的POD基因表达量只有在20ng/μL的浓度下才显著降低(P<0.05)，所以在后续实验中采用20ng/μL这个浓度对麦长管蚜进行RNA干扰实验(图5)。

三、dsRNA饲喂后麦长管蚜存活率、蜕皮指数及POD基因表达量的测定

1、实验方法

以2龄麦长管蚜为研究对象，参照上文所述方法对其进行dsRNA饲喂，dsRNA的浓度选用20ng/μL，同设置3个处理，即POD基因dsRNA饲喂组(简称dsPOD)、GFP基因dsRNA饲喂组(简称dsGFP)、以及向人工饲料中加入等量的DEPCH₂O的对照组。共饲喂6天。用dsRNA饲喂蚜虫后每天观察麦长管蚜的生长状态，记录麦长管蚜的存活数和蜕皮数。每天计算每个处理的麦长管蚜的存活率，饲喂6天后计算每个处理的麦长管蚜的蜕皮指数。另外，饲喂6天后检测每个处理的麦长管蚜POD基因的表达量，其中△△Ct＝(目的基因的Ct-内参基因的Ct)_实验组-(目的基因的Ct-内参基因的Ct)_对照组，将对照组的△Ct＝Ct_目的基因-Ct_内参基因定义为1.0(100％)，dsPOD饲喂组和dsGFP饲喂组为实验组，计算各组的平均值，进行差异显著性分析。

计算公式如下：

存活率＝前一天的存活虫数/当天的存活虫数×100％；

蜕皮指数(Im)＝∑(蜕皮数/前一天的存活虫数)。

2、实验结果

(1)麦长管蚜存活数

结果显示，dsPOD处理组的麦长管蚜4天后存活率开始显著低于对照组(P<0.05)，饲喂6天后蚜虫的存活率低于50％。dsPOD处理组麦长管蚜每天的存活率为91.11％，73.33％，64.44％，51.11％，48.89％，44.45％，对照组dsGFP饲喂后的麦长管蚜存活率分别为97.78％，95.55％，93.33％，86.67％，82.22％，80.00％，饲料中加等量DEPCH₂O饲喂后的麦长管蚜每天的存活率分别为97.62％，93.01,％，83.97％，81.59％，76.99％。结果详见图6。

(2)麦长管蚜蜕皮指数

结果显示，dsPOD饲喂能显著降低麦长管蚜的蜕皮指数(P<0.05)，阻碍麦长管蚜的生长，dsPOD处理组麦长管蚜的蜕皮指数为1.36±0.06(平均值±标准误)，dsGFP对照组的蜕皮指数为1.73±0.07(平均值±标准误)，DEPCH₂O对照组的蜕皮指数为1.75±0.10(平均值±标准误)。结果详见图7。

(3)POD基因的表达量

结果显示，与对照相比，dsPOD处理组的麦长管蚜的POD基因表达量降低，显著低于dsGFP处理组(P<0.05)，极显著低于DECH2O对照组(P<0.001)(图8)。

本发明受农业部行业项目“作物蚜虫综合防控技术研究和示范推广(201103022)”的支持。

Claims (12)

1.一种dsRNA，为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。

2.权利要求1所述的dsRNA在防治麦长管蚜或制备防治麦长管蚜的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用为将权利要求1所述的dsRNA导入麦长管蚜，从而实现防治麦长管蚜。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述导入的方式为饲喂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述饲喂为：将所述dsRNA混合于液体饲料中，得到混合液；用所述混合液饲喂麦长管蚜；

所述dsRNA在所述混合液中的终浓度为20ng/μL；

所述饲喂持续的时间为4天以上。

6.根据权利要求2-5中任一所述的应用，其特征在于：所述麦长管蚜为1-2龄麦长管蚜。

7.权利要求1所述的dsRNA在如下(a1)-(a4)任一中的应用

(a1)降低麦长管蚜存活率或制备降低麦长管蚜存活率的产品；

(a2)抑制麦长管蚜生长或制备抑制麦长管蚜生长的产品；

(a3)降低麦长管蚜蜕皮指数或制备降低麦长管蚜蜕皮指数的产品；

(a4)抑制麦长管蚜过氧化物酶基因表达或制备抑制麦长管蚜过氧化物酶基因表达的产品。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用为将权利要求1所述的dsRNA导入麦长管蚜，从而实现降低麦长管蚜存活率、抑制麦长管蚜生长、降低麦长管蚜蜕皮指数或抑制麦长管蚜过氧化物酶基因表达。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述导入的方式为饲喂。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述饲喂为：将所述dsRNA混合于液体饲料中，得到混合液；用所述混合液饲喂麦长管蚜；

所述dsRNA在所述混合液中的终浓度为20ng/μL；

所述饲喂持续的时间为4天以上。

11.根据权利要求7-10中任一所述的应用，其特征在于：所述麦长管蚜为1-2龄麦长管蚜。

12.具有防治麦长管蚜功能的产品，其活性成分为权利要求1所述的dsRNA。