CN103602681B

CN103602681B - 一种抑制麦蚜腺体蛋白MYS2基因表达的dsRNA及其应用

Info

Publication number: CN103602681B
Application number: CN201310556579.5A
Authority: CN
Inventors: 夏兰琴; 王大海; 孙永伟; 杜文明
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-11-11
Filing date: 2013-11-11
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2033-11-11
Also published as: CN103602681A

Abstract

本发明公开了一种抑制麦蚜腺体蛋白MYS2基因表达的dsRNA及其应用。本发明提供了一种双链RNA分子，如序列表的序列2所示。本发明还保护编码所述RNA分子的DNA分子。本发明还保护所述RNA分子或所述DNA分子的应用，为如下（1）至（4）中的至少一种：（1）防治蚜虫；（2）促进蚜虫死亡；（3）抑制蚜虫生长；（4）抑制蚜虫体内腺体蛋白MYS2基因的表达。本发明对于农业生产上蚜虫的防治具有重要应用价值。

Description

一种抑制麦蚜腺体蛋白MYS2基因表达的dsRNA及其应用

技术领域

本发明涉及一种抑制麦蚜腺体蛋白MYS2（salivaryproteinMYS2）基因表达的dsRNA及其应用。

背景技术

麦蚜（尤其是麦长管蚜）是危害中国小麦生产的主要害虫之一，据统计，中国每年小麦蚜虫危害面积可高达0.17亿公顷，占小麦总种植面积的62%，造成减产15%-30%，严重时可高达50%。近年来，由于全球气候变暖、耕作制度变化等因素，使蚜虫的繁殖能力和适应性显著增强，其危害日趋严重。目前，蚜虫防治以喷洒农药为主，大量使用农药不仅对人畜有害，而且造成了严重的环境污染。培育抗蚜虫小麦品种是防止蚜虫危害的最有效途径，但由于现有种质资源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性机制尚不明确，常规育种难以奏效。挖掘和利用新型抗蚜基因并通过基因工程培育小麦抗蚜新种质具有重要意义。

植物介导的RNAi技术已成为农作物抗虫基因工程的热点之一，通过寄主植物表达相应昆虫特异基因的dsRNA，昆虫取食植物后沉默其相应的基因从而达到控制害虫危害的目的。RNAi的过程是双链RNA（dsRNA）进入生物体内，被Dicer酶切割成21-23nt的siRNA，siRNA与RNA诱导沉默复合物结合，与互补序列的靶mRNA结合，被Dicer识别，造成靶基因表达量的下降。近年来，利用dsRNA体外饲喂或注射来筛选RNA靶标基因，导致靶标基因表达和沉默，已经广泛应用于昆虫生长发育关键基因的鉴定和功能分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制麦蚜腺体蛋白MYS2基因表达的dsRNA及其应用。

本发明提供了一种双链RNA分子，如序列表的序列2所示。

本发明还保护编码所述RNA分子的DNA分子。所述DNA分子为序列表的序列1所示的DNA分子。

含有所述RNA分子的重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒均属于本发明的保护范围。

含有所述DNA分子的重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒均属于本发明的保护范围。

本发明还保护所述RNA分子或所述DNA分子在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下（1）至（4）中的至少一种：（1）防治蚜虫；（2）促进蚜虫死亡；（3）抑制蚜虫生长；（4）抑制蚜虫体内腺体蛋白MYS2基因的表达。所述蚜虫具体可为麦蚜，更具体可为麦长管蚜。所述蚜虫可为具有腺体蛋白MYS2基因的蚜虫。所述腺体蛋白MYS2基因具体可为具有序列表的序列5所示DNA片段的DNA分子或具有与序列表的序列5所示的DNA片段具有80%以上同源性的DNA片段的DNA分子。

本发明还保护一种产品，其活性成分为所述RNA分子或所述DNA分子；所述产品的用途为如下（1）至（4）中的至少一种：（1）防治蚜虫；（2）促进蚜虫死亡；（3）抑制蚜虫生长；（4）抑制蚜虫体内腺体蛋白MYS2基因的表达。所述蚜虫具体可为麦蚜，更具体可为麦长管蚜。所述蚜虫可为具有腺体蛋白MYS2基因的蚜虫。所述腺体蛋白MYS2基因具体可为具有序列表的序列5所示DNA片段的DNA分子或具有与序列表的序列5所示的DNA片段具有80%以上同源性的DNA片段的DNA分子。

本发明还保护所述RNA分子或所述DNA分子的应用，为如下（1）至（4）中的至少一种：（1）防治蚜虫；（2）促进蚜虫死亡；（3）抑制蚜虫生长；（4）抑制蚜虫体内腺体蛋白MYS2基因的表达。所述蚜虫具体可为麦长管蚜。所述蚜虫具体可为麦蚜，更具体可为麦长管蚜。所述蚜虫可为具有腺体蛋白MYS2基因的蚜虫。所述腺体蛋白MYS2基因具体可为具有序列表的序列5所示DNA片段的DNA分子或具有与序列表的序列5所示的DNA片段具有80%以上同源性的DNA片段的DNA分子。

本发明还保护用于抑制蚜虫体内腺体蛋白MYS2基因的表达的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下（a）和/或（b）和/或（c）：（a）防治蚜虫；（b）促进蚜虫死亡；（c）抑制蚜虫生长。所述蚜虫具体可为麦长管蚜。所述蚜虫具体可为麦蚜，更具体可为麦长管蚜。所述蚜虫可为具有腺体蛋白MYS2基因的蚜虫。所述腺体蛋白MYS2基因具体可为具有序列表的序列5所示DNA片段的DNA分子或具有与序列表的序列5所示的DNA片段具有80%以上同源性的DNA片段的DNA分子。

本发明还保护一种产品，其活性成分为抑制蚜虫体内腺体蛋白MYS2基因的表达的物质；所述产品的用途为如下（a）和/或（b）和/或（c）：（a）防治蚜虫；（b）促进蚜虫死亡；（c）抑制蚜虫生长。所述蚜虫具体可为麦长管蚜。所述蚜虫具体可为麦蚜，更具体可为麦长管蚜。所述蚜虫可为具有腺体蛋白MYS2基因的蚜虫。所述腺体蛋白MYS2基因具体可为具有序列表的序列5所示DNA片段的DNA分子或具有与序列表的序列5所示的DNA片段具有80%以上同源性的DNA片段的DNA分子。

本发明基于麦长管蚜的腺体蛋白MYS2的cDNA的保守序列，提供了一种dsRNA。体外饲喂本发明提供的dsRNA，可以通过RNAi沉默麦长管蚜体内腺体蛋白MYS2基因，进而对麦长管蚜产生致死效应，且随着dsRNA浓度增大和饲喂时间延长，麦长管蚜的死亡率均逐渐增大。本发明对于农业生产上蚜虫的防治具有重要应用价值。

附图说明

图1为制备dsRNA-1和dsRNA-2的过程中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为dsRNA-1和dsRNA-2的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为用P3-F和P3-R组成的引物对鉴定内参基因的扩增曲线和标准曲线。

图4为用P2-F和P2-R组成的引物对鉴定腺体蛋白MYS2基因的扩增曲线、标准曲线和溶解曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。T7体外转录试剂盒：NEB公司。

麦长管蚜：参考文献：钱幼亭，周广和，张淑香，张向才.麦长管蚜有性世代的研究.植物保护，1982,01,14-15.；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得；将麦长管蚜接种到小麦品种科农199的幼苗上，放入人工气候箱中（20±2℃、60%-80%湿度、16小时光照/8小时黑暗）进行繁殖。

实施例1、用于沉默腺体蛋白MYS2基因的dsRNA的制备

1、提取麦长管蚜的总RNA并反转录为cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，用P1-F和P1-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1A。

P1-F（上游引物）：TAATACGACTCACTATAGGGAGGTTTGGATCGAGTGCTGGTCTAAAATGC；

P1-R（下游引物）：TAATACGACTCACTATAGGGAGGACCGCCGAAGACTTCAACGA。

下划线标注的区域为T7启动子序列。

PCR反应体系：10×PCRBuffer5μL、dNTP（2.5mmol·L^-1）4μL、rTaq0.5μL、上游引物（20μmol·L^-1）1μL、下游引物（20μmol·L^-1）1μL、模板1μL，用ddH₂O补足至50μL。

PCR反应条件：94℃4min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，39个循环；72℃10min；4℃保存。

3、dsRNA-1的制备

回收步骤2得到的PCR扩增产物并作为模板，采用T7体外转录试剂盒进行体外转录（42℃孵育16小时），用DNaseI和RNaseA消化残留的模板DNA和单链RNA，得到dsRNA-1。

dsRNA-1的琼脂糖凝胶电泳图见图2A。将dsRNA-1进行测序，测序结果表明，dsRNA-1为序列表的序列2所示的双链RNA。用无RNase水溶解dsRNA-1，用分光光度计（波长260nm）进行定量，然后置于-20℃冰箱中保存。

实施例2、用于沉默GFP基因的dsRNA的制备

1、合成序列表的序列3所示的双链DNA分子。

2、以步骤1得到的双链DNA分子为模板，用P4-F和P4-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1B。

P4-F（上游引物）：TAATACGACTCACTATAGGGACGGGAACTACAAGACACG；

P4-R（下游引物）：TAATACGACTCACTATAGGGCTTTGGAAAGGGCAGATT。

PCR反应体系和PCR反应条件同实施例1的步骤2中的PCR反应体系和PCR反应条件。

3、dsRNA-2的制备

回收步骤2得到的PCR扩增产物并作为模板，采用T7体外转录试剂盒进行体外转录（42℃孵育16小时），用DNaseI和RNaseA消化残留的模板DNA和单链RNA，得到dsRNA-2。

dsRNA-2的琼脂糖凝胶电泳图见图2B。将dsRNA-2进行测序，测序结果表明，dsRNA-2为序列表的序列4所示的双链RNA。用无RNase水溶解dsRNA-2，用分光光度计（波长260nm）进行定量，然后置于-20℃冰箱中保存。

实施例3、dsRNA在抑制蚜虫生长中的应用

一、蚜虫人工饲料的配制和饲育器的准备

人工饲料配制方法和饲育器的结构见参考文献（李彩霞,高丽锋,高玲玲,李润植.全纯人工营养液饲养蚜虫的研究.山西农业大学学报,1997,17(3):225-228.LiCX,GaoLF,GaoLL,LiRZ.Studyontherearingofaphidsonaartificiallyholidicdiets.JournalofShanxiAgriculturalUniversity,1997,17(3):225-228.(inChinese)）。用0.2μm孔径的细菌过滤器过滤人工饲料，分装到2.0mL灭菌的离心管中，保存于-20℃的冰箱中，避免反复冻融。

二、dsRNA在抑制蚜虫生长中的应用

麦长管蚜的饲喂方法见参考文献：纠敏,刘树生.利用人工饲料饲养蚜虫技术.华东昆虫学报,2004,13(2):102-109.JiuM,LiuSS.Aphidrearingwithartificialdiets.EntomologicalJournalofEastChina,2004,13(2):102-109。

1、分组处理

DSR33组：每个饲育器中放入15头3龄的麦长管蚜，采用混合饲料甲（混合饲料甲的制备方法：每100μL人工饲料中加入750ngdsRNA-1）饲喂蚜虫，每两天更换新的混合饲料甲、每两天统计死亡率并取存活的麦长管蚜检测腺体蛋白MYS2基因的相对表达量。

GFP组：每个饲育器中放入15头3龄的麦长管蚜，采用混合饲料乙（混合饲料乙的制备方法：每100μL人工饲料中加入750ngdsRNA-2）饲喂蚜虫，每两天更换新的混合饲料乙、每两天统计死亡率并取存活的麦长管蚜检测腺体蛋白MYS2基因的相对表达量。

对照组：每个蚜虫饲育器中放入15头3龄的麦长管蚜，采用人工饲料饲喂蚜虫，每两天更换新的人工饲料、每两天统计死亡率并取存活的麦长管蚜检测腺体蛋白MYS2基因的相对表达量。

每组设置5个重复处理（即5个饲育器）。

养殖条件：20±2℃、湿度60%-80%，16小时光照/8小时黑暗。

2、死亡率统计结果

使用Excel2003软件对死亡率进行统计学分析，计算平均值与方差，并进行显著性差异的分析（t-test，P<0.01或0.05）。结果见表1。

表1各组的死亡率统计分析结果，平均值±标准差（%）

	2d	4d	6d	8d
					DSR33组	41±12.8^＊＊	65±9.9^＊＊	90±10.1^＊＊	93±8.2^＊＊
GFP组	8.89±3.85	11.11±7.69	15.56±3.85	17.78±3.85
					对照组	6.00±5.96	12.33±5.58	17.67±3.65	18.33±5.58

^＊表示与对照组相比，结果差异显著(P<0.05)；^＊＊表示与对照组相比，结果差异极显著(P<0.01)。

对于DSR33组而言，饲喂dsRNA-1的时间越长麦长管蚜的死亡率越高，饲喂6天后麦长管蚜的平均死亡率为90%，饲喂8天后麦长管蚜的平均死亡率为93%，与对照组相比均存在显著性差异。对于GFP组而言，饲喂dsRNA-2的各个时间点，试验组的死亡率与对照组的死亡率没有显著性差异。

3、腺体蛋白MYS2基因的相对表达量结果

取存活的麦长管蚜，提取总RNA并反转录为cDNA（反转录体系为10μL），用TE缓冲液稀释至20倍体积后作为模板，采用实时荧光定量PCR鉴定腺体蛋白MYS2基因的相对表达量。用于鉴定腺体蛋白MYS2基因的引物对由P2-F和P2-R组成。用于鉴定内参基因的引物对（ACTIN基因）由P3-F和P3-R组成。

P2-F（上游引物）：GATGTTGAAACCCACCTGAT；

P2-R（下游引物）：CGCCCTGTTTGGATCGA。

P3-F（上游引物）：AGCCAAGGCGGTGATT；

P3-R（下游引物）：TCCGTTGCCCAGAAGC。

实时荧光定量PCR体系：上游引物（10μmol·L^-1）0.5μL、下游引物（10μmol·L^-1）0.5μL、2×TransStart_TMGreenqPCRSuperMix12.5μL、PassiveReferenceDye0.5μL、模板1μL，用ddH₂O补足至25μL。

实时荧光定量PCR程序：95℃30s、95℃5s、57℃15s、72℃10s，40个循环。

采用2-△△Ct法（Ct表示循环数）进行计算，即△△Ct=（Ct_{腺体蛋白MYS2基因}－Ct_ACTIN基因）_试验组－（Ct_{腺体蛋白MYS2基因}－Ct_ACTIN基因）_对照组，使用Excel2003软件进行统计学分析，计算平均值与方差，并进行显著性差异的分析（t-test，P<0.01或0.05）。

麦长管蚜体内腺体蛋白MYS2基因的相对表达量见表2。

表2麦长管蚜体内腺体蛋白MYS2基因的相对表达量，平均值±标准差（%）

	0d	2d	4d	6d	8d
						DSR33组	100±3.2	71±4.9	59±3.5	45±10.7^＊	35±5^＊
GFP组	101±4	93±4	114±6	98±8	96±7

与对照组相比，饲喂dsRNA-1的各个时间点麦长管蚜体内腺体蛋白MYS2基因的相对表达量显著降低，在统计学上表现为差异显著。与对照组相比，饲喂dsRNA-2的各个时间点麦长管蚜体内腺体蛋白MYS2基因的相对表达量没有显著差异。结果表明，通过饲喂dsRNA-1能够引起麦长管蚜体内腺体蛋白MYS2基因的RNAi效应，导致腺体蛋白MYS2基因的表达量明显降低，从而导致蚜虫死亡。

4、建立用P3-F和P3-R组成的引物对鉴定内参基因的标准曲线方程

取麦长管蚜，提取总RNA并反转录为cDNA（反转录体系为10μL），用TE缓冲液10倍梯度稀释后作为模板，采用实时荧光定量PCR，采用P3-F和P3-R组成的引物对鉴定内参基因（ACTIN基因）。

扩增曲线见图3B，标准曲线见图3A。

标准曲线方程为：y=2.536x+13.074（y对应Ct值，x对应稀释倍数以10为底的对数值）,R²=0.9644。

5、建立用P2-F和P2-R组成的引物对鉴定腺体蛋白MYS2基因的标准曲线方程

取麦长管蚜，提取总RNA并反转录为cDNA（反转录体系为10μL），用TE缓冲液10倍梯度稀释后作为模板，采用实时荧光定量PCR，采用P2-F和P2-R组成的引物对鉴定腺体蛋白MYS2基因。

扩增曲线见图4B，标准曲线见图4A，熔解曲线见图4C。

标准曲线方程为：y=2.388x+3.254（y对应Ct值，x对应稀释倍数以10为底的对数值），R²=0.9683。

步骤4和步骤5的结果表明，用于鉴定腺体蛋白MYS2基因的引物对（P2-F和P2-R）与用于鉴定内参基因的引物对（P3-F和P3-R）均特异性良好，并且扩增效率相对一致。

Claims

1.一种双链RNA分子，如序列表的序列2所示。

2.编码权利要求1所述RNA分子的DNA分子。

3.含有权利要求1所述RNA分子或权利要求2所述DNA分子的重组表达载体。

4.含有权利要求1所述RNA分子或权利要求2所述DNA分子的转基因细胞系。

5.含有权利要求1所述RNA分子或权利要求2所述DNA分子的重组菌。

6.含有权利要求1所述RNA分子或权利要求2所述DNA分子的表达盒。

7.权利要求1所述RNA分子或权利要求2所述DNA分子在制备防治麦长管蚜产品中的应用。

8.权利要求1所述RNA分子或权利要求2所述DNA分子在制备产品中的应用；所述产品的用途如下(1)至(3)所示：(1)促进麦长管蚜死亡；(2)抑制麦长管蚜生长；(3)抑制麦长管蚜体内腺体蛋白MYS2基因的表达。

9.一种防治麦长管蚜的产品，其活性成分为权利要求1所述RNA分子或权利要求2所述DNA分子。

10.一种产品，其活性成分为权利要求1所述RNA分子或权利要求2所述DNA分子；所述产品的用途为如下(1)至(3)中的至少一种：(1)促进麦长管蚜死亡；(2)抑制麦长管蚜生长；(3)抑制麦长管蚜体内腺体蛋白MYS2基因的表达。

11.权利要求1所述RNA分子或权利要求2所述DNA分子在防治麦长管蚜中的应用。

12.权利要求1所述RNA分子或权利要求2所述DNA分子的应用，为如下(1)至(3)中的至少一种：(1)促进麦长管蚜死亡；(2)抑制麦长管蚜生长；(3)抑制麦长管蚜体内腺体蛋白MYS2基因的表达。