CN109971654A - 普通大蓟马生防菌渐狭蜡蚧菌scaudcl-53及其应用 - Google Patents

普通大蓟马生防菌渐狭蜡蚧菌scaudcl-53及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种对普通大蓟马具有良好生防效果的渐狭蜡蚧菌及其在防治普通大蓟马中的应用。经过生物学实验表明，本发明的渐狭蜡蚧菌菌株对普通大蓟马控制效果达到100%(以108孢子/mL进行实验)，在普通大蓟马的生物防治上具有很大的应用潜力。所述菌株已于2019年2月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC NO:60586。

Description

普通大蓟马生防菌渐狭蜡蚧菌SCAUDCL-53及其应用
技术领域
本发明涉及植物保护领域，具体涉及生物防治领域，尤其涉及渐狭蜡蚧菌及其在防治普通大蓟马中的应用。
背景技术
化学农药在植物病虫害的防治中功不可没，但也产生了不容忽视的问题。据统计，全球农药的有效利用率不足30％，我国每年化学农药使用面积在2.8亿hm2以上，施用量达50-60万吨，约80％的化学农药直接进入环境(李亮,张占英等.农药危害与绿色植保技术探讨[J].湖北植保,2018,(4):63-64)。由于化学农药大量的施用，带来的害虫抗药性、农药残留和害虫再猖厥以及环境污染问题越发严重。因此，要改变使用化学农药为主的防治方式，应当坚持农药防治为主、生物防治为基础，并结合其他防治措施对害虫进行综合治理的可持续建康发展具有极其重要的意义(杨运华等.虫生真菌的生物防治研究进展[J].河南科技学院学报,2011,39(1):34-37)。
蓟马是缨翅目(Thysanoptera)蓟马科(Thripida)昆虫的统称。蓟马类害虫体型微小，容易隐藏，且繁殖力强，生长周期短，世代重叠严重，为防治增加了难度。目前，该类害虫防治主要依赖于化学防治，由于常期缺乏理想、高效的化学药剂，导致大量化学药剂的不合理使用，从而引发害虫抗药性、杀伤天敌、农药残留、环境污染等诸多问题，产品质量安全也受到威胁，2010年发生的“毒豇豆”事件就引人深思。近年来，全球贸易和气候变暖加速了蓟马的扩散和传播，蓟马现已成为世界性重要的农林害虫。所以，寻求环境友好型防治策略极为迫切的今天，生物防治在蓟马类害虫的防治工作中具有广阔的应用前景。另外，生物防治在生产过程中能够保障产品的质量安全，能有效的减少化学药剂的使用量。迄今为止，关于生物防治措施防治蓟马害虫的研究已有不少报道。
渐狭蜡蚧菌(Akanthomyces attenuatum)是一种重要的昆虫病原真菌，隶属于子囊菌纲，肉座菌目，蜡蚧菌属，寄主和分布广泛(Zare R,Gams W.A revision ofVerticillium section Prostrata.IV.The genera Lecanicillium and Simplicilliumgen.nov[J].Nova Hedwigia,2001, 73(1):1-50)，该菌在西欧、苏、美、中等许多国家和地区已有广泛研究和应用。蜡蚧菌于 1861年在咖啡蜡蚧上被首次发现，而后1898年Zinmerman将其命名为蜡蚧头孢霉 (Cephalosporium lecanii Zinmerman)；1939年Viegas将其归入轮枝菌属，并更名为蜡蚧轮枝菌；后来Zare等通过形态学和rDNA-ITS序列分析对蜡蚧轮枝菌进行了重新定义，建立了蜡蚧菌属，主要包括渐狭蜡蚧菌(A.attenuatum)、蜡蚧菌(L.lecanii)、刀孢蜡蚧菌(L.psalliotae)等(Zare R,Gams W,Culham A.A revision ofVerticillium sect.Prostrata.I. Phylogenetic studies using ITS sequences[J].Nova Hedwigia,2000,71(3-4):págs.465-480；Zare R,Gams W.A revision ofVerticillium section Prostrata.IV.The genera Lecanicillium and Simplicilliumgen.nov[J].Nova Hedwigia,2001,73(1):1-50)。
如果能够分离或筛选到生防效果优异的渐狭蜡蚧菌(A.attenuatum)，可以作为某些对杀虫剂产生抗药性的昆虫的防治替代品，因而有对环境无污染、无残留的效果。
发明内容
本发明针对这一农业生产的重要需求而研发，筛选到一株对蓟马效果非常好的渐狭蜡蚧菌(Akanthomyces attenuatum)生防真菌。因而，本发明的目的在于提供一种渐狭蜡蚧菌 SCAUDCL-53，该菌对蓟马，尤其是普通大蓟马具有优良生防效果。
该菌株从广东省广州市朱村采集豇豆田土壤样品中筛选得到，其在PDA平板上，菌落呈绒状，表面白色，背面橘黄色，有少量皱褶。孢子圆柱形和椭圆形，孢子长3.767μm，宽1.233μm。
该渐狭蜡蚧菌菌株已于2019年2月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC NO:60586，保藏地址为中国广州。
进一步地，本发明提供所述菌株在防治蓟马中的应用。
优选地，所述蓟马为普通大蓟马。
在一个实施方式中，将所述菌株培养后制成孢子液、含孢子的菌剂。施用时菌株的孢子浓度为107孢子/mL至109孢子/mL，优选为108孢子/mL至109孢子/mL。
由于不同的渐狭蜡蚧菌(Akanthomyces attenuatum)对蓟马的致死效果差异很大，需要经过筛选才能获得效果好的菌株。而经过生物学实验表明，本发明的渐狭蜡蚧菌SCAUDCL-53菌株对普通大蓟马控制效果表现极佳(明显优于同时分离到的另外两株渐狭蜡蚧菌),实验效果表明在浓度为1×107孢子/mL时，SCAUDCL-53第5d的累计死亡率为 70％；当浓度为1×108孢子/mL时，SCAUDCL-53的致死率在第3d的累计致死率就达到75％，在第5天其致死率可达100％。因此,本发明的渐狭蜡蚧菌菌株SCAUDCL-53可有效抑制普通大蓟马种群，在生物防治上具有很大的应用潜力，可以作为某些对杀虫剂产生抗药性的昆虫的防治替代品，而达到对环境无污染、无残留的效果。
附图说明
图1 SCAUDCL-53菌落形态图
(左图为SCAUDCL-53菌落正面图,右图为SCAUDCL-53菌落背面图)
图2 SCAUDCL-53孢子形态图
图3 SCAUDCL-53的分子鉴定中PCR扩增产物电泳图
图4针对SCAUDCL-53的构建的分子系统树。
具体实施方式
下面通过本发明的研发过程和具体实施方式进行详细行介绍，以进一步理解本发明，但不构成对本发明保护范围的限制。
实施例一 蜡蚧菌的采集
在中国广东省广州市朱村采集豇豆田土壤样品，取表土下10～15cm处土壤100g左右，用塑料袋封装后带回实验室处理。土壤样品过筛去掉石粒和杂物，然后取净土10g悬浮于 90mL 0.1％的吐温80溶液中，摇匀，静置15min，取其上清液2mL稀释于8mL 0.05％吐温80中，配制为土壤悬浮液。将0.1mL土壤悬浮液接种于孟加拉红琼脂培养基平板上，用三角玻璃刮子将悬浮液推匀于平板表面下，25℃培养3～7d，然后用接种环切取单菌落，接种于PDA板上继续培养，得到从形态上看初步为蜡蚧菌的三个菌株，分别命名为 SCAUDCL-38，SCAUDCL-53和SCAUDCL-56。切取菌丝块移植于PDA斜面，继续培养，4℃下保藏于冰箱中。
实施例二 菌株的形态鉴定
将三株菌株接种到PDA平板上，25℃，培养5天，观察菌落形态:菌落绒状，表面白色，背面橘黄色，有少量皱褶(以SCAUDCL-53为例，如图1所示)。孢子圆柱形和椭圆形，孢子长3.767μm，宽1.233μm(以SCAUDCL-53为例，如图2所示)。根据形态观察和判断,进而初步确定这三株菌株均为渐狭蜡蚧菌。
实施例三 菌株的生物测定
1供试昆虫
普通大蓟马种群采自广州市朱村豇豆田，在实验室饲养多代，饲养条件为温度26℃，相对湿度65％，光周期L∶D＝12∶12。
2供试菌株
实施例一所获得的三株菌SCAUDCL-38，SCAUDCL-53和SCAUDCL-56。
3实验方法
(1)孢子悬浮液的配制
在PDA平板上26±1℃培养7d后，充分产孢的虫生真菌分生孢子用0.05％吐温-80无菌水洗脱孢子，用磁力搅拌器搅拌，再置于摇床180rpm 25℃振荡培养25min后用双层擦镜纸过滤，用血球计数板计数，测量母液的浓度，配制成1×107孢子/mL和1×108孢子/mL的孢子悬浮液。
(2)虫生真菌对普通大蓟马的毒力测定
将配制好的孢子悬浮液置于平底指型管(15mm×75mm)中，浸泡2h后倒出孢子悬浮液，指型管自然风干后备用；豇豆切段(1cm，两端无孔)，浸入孢子悬浮液，30s取出，自然风干后对应放入处理好的指型管中，同时接入普通大蓟马雌成虫50头，棉花封口，置于人工气候箱中，以0.05％吐温-80无菌水为空白对照，每个处理重复4次。连续5d记录其死亡率。
(3)数据处理
利用SPSS 19.0软件进行试验处理分析，采用单因素方差分析对各结果进行分析，并运用Tukey检验差异显著性。
4实验结果
实验结果显示，同一浓度下，三株虫生真菌的致病力存在差异，普通大蓟马雌成虫的死亡率随着处理时间的增加而上升,当浓度为1×107孢子/mL时(表1)，SCAUDCL-53第 5d的累计死亡率为70％，显著高于菌株SCAUDCL-56，与SCAUDCL-38无显著性差异；当浓度为1×108孢子/mL时(表2)，SCAUDCL-53的致死率均高于其他菌株，在第3d的累计致死率就达到75％，在第5天其致死率可达100％。
结果表明，菌株SCAUDCL-56、SCAUDCL-38和SCAUDCL-53对普通大蓟马均均有致死效果，但SCAUDCL-53的致病效果要明显优于其他菌株，属于潜在优良生防菌。
表1 1×107孢子/mL的孢子悬浮液对普通大蓟马的校正死亡率(％)
注:经Tukey检验,同一列的不同小写字母表示不同菌株间致病力差异显著(P＜0.05)
表2 1×108孢子/mL的孢子悬浮液对普通大蓟马的校正死亡率(％)
注:经Tukey检验,同一列的不同小写字母表示不同菌株间致病力差异显著(P＜0.05)
实施例四 菌株SCAUDCL-53的分子生物学鉴定
1分子生物学鉴定方法
针对菌株SCAUDCL-56、SCAUDCL-38和SCAUDCL-53进行分子生物学鉴定。
(1)采用CTAB法提取DNA，包括以下步骤：
(a)将球孢白僵菌菌株SCAUDCL-53在PDA平板上培养一周后，小心刮取菌丝体于研钵中，加入液氮迅速充分研碎；
(b)取适量研碎的菌丝体迅速转移到离心管中，加入300μL经65℃预热的DNA提取液裂解液，充分混匀，加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)混合液混匀，65℃下水浴1h， 10min左右轻轻震荡一次，12000rpm常温条件下离心5min；
(c)缓慢吸取上清液于另一新离心管中，缓慢加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)混合液进行再次抽提，12000rpm常温条件下离心5min；
(d)缓慢吸取上清液于另一新离心管中，加入1/10体积的醋酸钠，等体积预冷的异丙醇，室温静止15min；
(e)加入70％乙醇洗涤沉淀2次；
(f)移液枪紧贴管壁缓慢吸出乙醇，置于超净工作台内吹干；
(g)所得沉淀溶于50μL的TE中；
(h)用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，其余提取物置于-20℃条件下保存。
(2)真菌DNA的PCR所用引物为通用引物：B5.1F：5’-cgacccggccaactactttga-3’和B3.1R：5’-gtcttccagtaccactacgcc-3’。扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min。
50μL反应体系如下:
PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(含EB)，缓冲液为1×TAE，电压150V、电流220mA，Marker DL2000作为分子量标准参照物，电泳结束后，在凝胶成像仪上检测并拍照记录。
特异性PCR产物委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。序列比对与发育树构建：测序结果用BLAST搜索同源性较高的相关序列，使用MEGA5.1软件中的Cluster W进行序列比对和多重序列比对。并在该软件中构建Neighbour-joining(NJ)系统发育树。 2鉴定结果
(1)如图3所示，每个泳道的电泳条带比较清晰，可以根据PCR产物的迁移距离来准确判断该菌株的基因片段约为600bp，其中株，而编号1至3分别SCAUDCL-38、 SCAUDCL-53和SCAUDCL-56菌株。
(2)将得到的SCAUDCL-53菌株基因型的ITS序列和从GenBank下载的渐狭蜡蚧菌菌相关序列组合，构建分子系统树，结果如图4所示，可以鉴定SCAUDCL-53菌株属于渐狭蜡蚧菌()Akanthomyces attenuatum)。

Claims (6)

1.一种渐狭蜡蚧菌SCAUDCL-53，其是渐狭蜡蚧菌(Akanthomyces attenuatum)，于2019年2月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC NO: 60586。
2.如权利要求1所述的菌株在防治蓟马中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述蓟马为普通大蓟马。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将所述菌株培养后制成孢子液、含孢子的菌剂。
5.如权利要求2至4任一项所述的应用，其特征在于，施用时菌株的孢子浓度为107 孢子/mL至109 孢子/mL。
6.如权利要求2至4任一项所述的应用，其特征在于，施用时菌株的孢子浓度为108 孢子/mL至109 孢子/mL。
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