CN107663522B

CN107663522B - 一种利用二化螟小rna培育抗虫水稻的方法

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Publication number: CN107663522B
Application number: CN201610596743.9A
Authority: CN
Inventors: 陈浩; 刘好桔; 江山; 申恩龙; 林拥军
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2016-07-26
Filing date: 2016-07-26
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2036-07-26
Also published as: CN107663522A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种利用二化螟小RNA培育抗虫水稻的方法。本发明对所获得的二化螟[Chilo suppressalis(Walker)内源小RNA序列进行了功能验证和应用研究，利用高通量小RNA测序和生物信息学分析，得到一条SEQ ID NO：1所示的二化螟内源的小RNA csu‑53的核苷酸序列，利用csu‑53的序列构建人工microRNA(amiRNA)表达载体并转化水稻，离体茎秆接虫试验表明，转基因水稻能显著延长二化螟幼虫在稻株上的生长周期，降低虫重和蛹重。本发明分离的二化螟内源小RNA可应用于水稻抗虫改良中，特别是能应用于抑制水稻害虫二化螟生长中的应用。

Description

一种利用二化螟小RNA培育抗虫水稻的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种利用二化螟小RNA培育抗虫水稻的方法。克隆得到一条二化螟[Chilo suppressalis(Walker)]内源小RNA序列，通过生物学功能验证，本发明的小RNA序列可用于水稻抗虫改良中。

背景技术

植物基因工程已经成为近代为提高农作物产量而被接受最快的农业生物技术。全球转基因农作物的种植面积已从1996年的170万公顷增加到2015年的1.797亿公顷。然而目前使用的大部分商业化转基因农作物仅仅只使用了一个或几个抗虫和抗除草剂基因。近年来，人们期待多基因聚合的转基因技术能够使转基因农作物既能够增强营养品质、又能够提高粮食产量。因此，为了扩大转基因作物的使用范围，就需要鉴定新基因以扩大基因来源，并对其在作物性状改良方面的功能进行鉴定和评估。

水稻是世界上主要粮食作物之一，约有一半的世界人口以其为主食。在农业生产上，病虫害会导致水稻生产的大规模减产，造成巨大的经济损失。二化螟是水稻的主要害虫之一，广泛分布于亚洲、大洋洲、北非、南欧等国家；在我国除青海和西藏外，各省均有二化螟的发生(盛承发等2003)。近年来，二化螟的危害在我国多数稻区呈上升趋势。在水稻生产上，化学试剂是二化螟防治的主要手段，但人们也在积极探索其他更经济和低环境危害的方法。目前对于二化螟，Bt对其有较明显的抗性，但人们也在尝试新的方法来以备二化螟在Bt筛选压下产生耐受性，或是发现在抗虫方面优于Bt的方法。

RNA干涉现象(RNA interference,RNAi)最早在牵牛花中被发现(Napoli etal.1990)，并由Fire等人明确将其名为RNAi(Fire et al.1998)。RNAi的机制被发现后，广被泛运用在基因治疗、功能基因组研究和品种改良中。近年来，人们尝试用RNAi技术在植物抗虫育种方面进行应用，Mao等人用表达dsRNA的转基因拟南芥和烟草喂饲棉铃虫，发现其植株对棉铃虫具有抗性(Mao et al.2007)；Baum等人用人工合成的dsRNA喂饲西部玉米根虫(western corn rootworm)，12h到1d后，害虫的目标基因表达显著下降(Baum etal.2007)。

MiRNA是一类长约21～28nt的非编码(non-coding)RNA(Couzin 2002)，来源于60～80nt的发夹前体pre-miRNA。一般pre-miRNA的长度在动物中比较恒定，但在植物中其长度的变化性较大，可以从几十到几百nt(Reinhart et al.2002；LAGOS-QUINTANA etal.2003)。miRNA的主要功能是在生物体生长和发育过程中起着基因表达调控的作用，如在线虫的miRNA lin-4通过与靶标mRNA的3’末端的非翻译区不完全配对来对靶标mRNA进行翻译后抑制，lin-4的突变往往造成线虫发育形态的改变(Banerjee and Slack 2002；Pasquinelli and Ruvkun 2002)新miRNA的发现可通过直接克隆或生物信息学分析得到。其中直接克隆的方法耗时耗力，人们更倾向于通过生物信息学的方法来发现新miRNA。生物信息学的方法需要依靠高通量测序技术，它能一次对几十万到几百万条的DNA分子进行序列测定。采用边合成边测序(sequencing by synthesis)的策略可减少因二级结构造成的区域缺失，并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点。目前，不少物种已经通过高通量测序的方法发现了很多新的miRNA并上传至miRNA数据库miRBase(Kozomara and Griffiths-Jones 2011)，如通过小RNA高通量测序，在蝗虫中发现55个miRNA序列(Wen et al.2009)，在松材线虫中确定出37个新miRNA(Huanget al.2010)，在家猪中的10个样本中发现了777条新的miRNA(Li et al.2010)等。

利用天然的植物miRNA前体作为骨架，把人工设计的针对目标基因的21nt的序列替换相应的天然miRNA序列，依循天然miRNA的生物学形成机制可生成成熟的人工miRNA(artificial microRNA,amiRNA)。然后amiRNA可以和天然miRNA一样特异性地沉默目标基因的表达。目前，在拟南芥、烟草、番茄、水稻、苔藓以及藻类等多种植物中均已成功应用amiRNA技术特异性地抑制内源或外源基因的表达(Schwab et al.2006；Qu et al.2007；Warthmann et al.2008；Molnar et al.2009)。amiRNA干涉与dsRNA干涉相比具有更高的特异性，不易引起“脱靶”的现象，被誉为“第二代”基因沉默技术(Tang et al.2007)。目前该技术广泛运用在功能基因组研究、品种改良和医疗领域，但amiRNA技术运用于转基因抗虫育种尚不多见。本发明运用amiRNA技术，将二化螟体内源小RNA片段在转基因水稻中过量表达。通过二化螟喂饲试验，发现该转基因水稻具有一定的抗二化螟效果，该研究为植物转基因抗虫育种制提供了新思路，也为深入了解miRNA干涉的机制提供了帮助。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用高通量测序技术和生物信息学鉴定出二化螟内源的特异小RNA csu-53，利用csu-53的序列体外构建相应的amiRNA表达载体，并通过农杆菌介导的遗传转化方法转化到水稻品种中花11。转基因中花11过量表达与csu-53序列一致的amiRNA，二化螟取食转基因水稻后，摄入大量的amiRNA，由于amiRNA与内源小RNA csu-53的序列一致，可能导致二化螟的体内相应基因调控的紊乱，达到影响二化螟生长发育，从而起到抗虫的效果。

本发明的技术方案如下所述：

1.收集二化螟6个不同生长发育时期的样本，包括卵、1-2龄幼虫、3-4龄幼虫、5龄幼虫、蛹和成虫，用Trizol试剂分别抽提6个样本的总RNA(见实施例1)。

2.将收集到的二化螟6个样本的总RNA送华大基因公司进行小RNA高通量测序，通过生物信息学方法分析，预测出6个样本中保守的miRNA、rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA、tRNA、piRNA等小RNA，同时分析6个样本中未发现的新miRNA，以及它在6个样本中的表达情况(见实施例2)。其中csu-53是一个预测的新miRNA，它在二化螟的中肠组织中存在，其序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其天然前体序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

3.对预测出的csu-53通过茎环RT-PCR以及对RT-PCR产物再次测序可以验证csu-53真实的存在于二化螟体内(见实施例3)。

4.根据Warthmann等(2008)的报道，根据csu-53的序列体外构建相应的amiRNA表达载体(见实施例4)，并用农杆菌介导的转化方法导入水稻品种中花11(见实施例5)，得到转基因水稻植株。

5.对转基因水稻植株进行阳性检测以及amiRNA表达量检测后(见实施例6)，选取amiRNA表达量高的植株进行二化螟接虫鉴定(见实施例7)，得到对二化螟生长有明显抑制效果的转基因植株。

本发明进一步的技术方案如下所述：

一种抑制水稻害虫二化螟生长的小RNA csu-53基因在培育转基因抗虫水稻中的应用，该基因的核苷酸序列如SEQ NO：1所示。

SEQ NO：1所示的小RNA csu-53基因在抑制水稻害虫二化螟生长中的应用，包括下列步骤：

利用csu-53基因序列设计扩增引物53-I、53-II、53-III、53-IV、G4368和G4369，然后用两轮PCR合成csu-53人工miRNA的前体基因，并将该前体基因构建到pC1300-Ubi-Nos载体上，得到重组质粒pUbi-ami-csu53，用该重组质粒转化水稻(例如水稻品种中花11)，将获得的转基因的水稻材料，申请人将该材料命名水稻种子csu-53，Oryza sativa L.csu-53，于2016年7月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：P201613；

其中：csu-53人工miRNA前体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述的53-I、53-II、53-III、53-IV、G4368和G4369引物序列分别如下所示：

53-I：agGAGGAGCTCGATGGCGCAAGTcaggagattcagtttga(5′–3′)；

53-II：tgACTTGCGCCATCGAGCTCCTCctgctgctgctacagcc(5′–3′)；

53-III：ctACTTGGGCCTTCGAGCTCCTCttcctgctgctaggctg(5′–3′)；

53-IV：aaGAGGAGCTCGAAGGCCCAAGTagagaggcaaaagtgaa(5′–3′)；

G-4368：CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC(5′–3′)；

G-4369：GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG(5′–3′)；

所述的重组质粒pUbi-ami-csu53含有SEQ ID NO：3所示的csu-53人工miRNA前体基因。

所述的两轮PCR合成csu-53人工miRNA的前体基因的步骤如下所述：

第一轮PCR：应用引物组合G-4368+53-II、53-I+53-IV和53-III+G-4369以质粒pNW55为模板进行第一轮PCR反应，反应体系为：10×pfu Taq buffer 2.0μl，dNTPs 2.0μl，左、右引物各0.2μl，pNW55 10ng，pfu Taq 0.2μl，灭菌双蒸水至20μl；

反应条件：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃7min。

将第一轮PCR产物于0.8％琼脂糖胶电泳，挖胶后回收得到三种PCR产物，最后溶于20μl灭菌双蒸水；用回收的第一轮PCR的三种PCR产物进行第二轮PCR；

第二轮PCR：应用G-4368+G-4369引物组合，反应体系为：10×Ex Taq buffer 2.0μl，dNTPs2.0μl，G-4368 0.2μl，G-4369 0.2μl，第一轮PCR产物等量混合1.0μl，Ex Taq 0.2μl，灭菌双蒸水至20μl；

反应条件：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃7min；最终PCR产物克隆于T载体pEASY-T3上，然后测序验证；利用BamH I和Kpn I酶切含有csu-53 amiRNA前体基因的T载体，并释放出的前体基因克隆于载体pC5300-Ubi-tNos上获得重组质粒(即，最终表达载体)pUbi-ami-csu53。

本发明的优点在于：

1.本发明采用RNAi技术，其抗虫育种方式为绿色环保育种，没有引入对环境有危害的毒蛋白及毒素。

2.本发明的amiRNA前体基因片段小，无蛋白产物，在转基因植株中过量表达不易增加超表达植株的代谢负担。

3.本发明的外源基因序列来源于二化螟内源的小RNA，且片段很小仅21nt，靶标容易预测，潜在的风险较小。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明的二化螟小RNA csu-53的DNA序列。

序列表SEQ ID NO：2是二化螟小RNA csu-53预测的天然前体的DNA序列。

序列表SEQ ID NO：3是二化螟小RNA csu-53人工miRNA前体基因的DNA序列

图1：二化螟小RNA生物信息学注释和新microRNA预测流程。

图2：通过RT-PCR技术检测二化螟小RNA csu-53在不同发育时期的表达情况。

图3：是本发明涉及的质粒载体pNW55结构示意图

图4：是本发明涉及的原始载体pC1300-Ubi-Nos结构示意图。

图5：是本发明构建的终载体(重组质粒)pUbi-ami-csu53结构示意图。

图6：转基因水稻离体茎秆接种二化螟后的鉴定结果。附图标记说明：图6中左边为转基因水稻(转基因中花11，或称为csu-53)植株茎秆中剥出的二化螟；右边为非转基因(即野生型中花11，或称ZH11)对照植株茎秆中剥出的二化螟。

图7：是本发明重复接种水稻二化螟的鉴定结果。

具体实施方式

实施例1:二化螟小RNA样品的抽提

通常，二化螟的生命周期包括四个生长发育阶段：即卵、幼虫、蛹和成虫。其中幼虫期通常分为5个龄期。本发明收集了二化螟6个生长发育时期的样品包括：卵、1-2龄幼虫、3-4龄幼虫、5龄幼虫、蛹和成虫。收集到各个时期二化螟样品后，先放入液氮罐中保存，带样品收集齐后使用Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司)进行抽提，方法如下：

(1)称取0.1g的二化螟样品在液氮中研磨成粉。

(2)加入5ml Trizol试剂迅速将研磨后的样品粉末混匀，分装在5个1.5mlRNAase-free的离心管中。

(3)室温下放置数分钟至混合物完全融化成液体。

(4)4℃.5000g离心10min，并转移上清液到新的1.5ml RNAase-free的离心管中，此步可除去多余的组织杂种。

(5)加入200μl冰冻的三氯甲烷并且震荡15s。

(6)4℃，5000g离心10min，并转移上清液到新的1.5ml RNAase-free的离心管中。

(7)继续重复步骤(5)和(6)。

(8)在转移出的上清液中加入500μl异丙醇，混合均匀，-20℃冰冻过夜。

(9)4℃，5000g离心30min，弃上清。

(10)加入500μl 75％乙醇洗盐。

(11)4℃，5000g离心5min，弃上清。

(12)打开离心管盖，空气中干燥RNA，时间不超过10min。

(13)加入30-50μl DEPC处理过的ddH₂O。

(14)轻弹使RNA快速溶解，可在65℃水浴中使RNA溶解。

实施例2:二化螟小RNA样品的回收和Solexa测序

二化螟6个时期的RNA样品通过凝胶电泳回收80nt以下的小RNA片段，再将回收的小RNA片段连接特异的3’端接头和5’端接头。利用3’端引物进行反转录，得到的产物再用5’和3’端的引物PCR扩增后进行小RNA高通量测序(按常规方法)。

通过Solexa测序，每个样本得到1×10⁸左右的小片段数据量，得到这些数据后进入分析流程(见图1)。首先将得到的片段序列去掉5’和3’端接头，并且去掉低质量的序列，选取出18-30nt长度的片段。将处理后得到的片段与Genbank数据库比对，对6个样本中保守的rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA、tRNA、piRNA等小RNA进行注释，再与miRBase数据库进行比对，注释保守的miRNA。把注释的保守小RNA排除掉后，剩下的未被鉴定出的小RNA结合二化螟的转录组信息和Mireap软件来预测新的二化螟miRNA。

miRNA来源于pri-miRNA前体,当pri-miRNA在细胞核中转录出来后被Drosha识别并切割成pre-miRNA，并经过Exportin-5转运到细胞质中(Kurreck 2009)。因此，二化螟转录组数据库存在pre-miRNA的序列信息。先将测序的小RNA片段定位到转录组的序列上，长度预设为miRNA前体的一般长度，约70nt(Lee et al.2003)，然后再预测这段前体序列的二级机构，看其发夹结构两臂匹配情况，即能否形成发夹结构以及结构的自由能，最终选取一个适合的序列作为前体，将测序的小RNA片段与其进行对比，选取完全匹配、表达量高的序列作为预测的新miRNA成熟体，也就是物种的特异miRNA。

用二化螟转录组数据库来预测miRNA的同时，也采用二化螟中肠组织的转录组来对特异的miRNA来进行预测，这样用两种二化螟转录组数据库预测出来的特异miRNA共同的结果，不仅在可信度上更真实，而且可以初步预测出一些存在于二化螟中肠组织的特异miRNA，因为这些miRNA的前体在二化螟中肠组织，它在中肠组织形成，其作用的靶基因也相应存在于中肠组织中。

通过以上的预测和假设，得到小RNA序列csu-53，其序列如序列表SEQ ID NO：1所示，它在二化螟全组织转录组和中肠转录组中都被预测为新miRNA，因此初步确定csu-53存在于二化螟中肠组织，其天然前体基因序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

实施例3:小RNA cus-53表达的验证

通过高通量测序和生物信息学预测出的二化螟新miRNA csu-53，还需要通过茎环RT-PCR(Chen et al.2005)以及对RT-PCT产物再次测序等实验的方法来验证其真实性和准确性。具体步骤如下所示。

根据预测出的候选miRNA结果，设计出特异反转录引物和PCR引物，所涉及到的引物如表1所示。

表1茎环RT-PCR所需的引物序列

首先用DNase I处理去掉样品中的基因组DNA，再用特异反转录引物53-specific-R对二化螟6个样本分别进行反转录，体系如下：

RNA样品： 1.0μg；

DNase I： 0.5μl；

10×DNase I buffer 1.0μl；

补DEPC处理的ddH₂O至10μl；

37℃反应15min；

65℃水浴失活10min；

失活后放在冰上2min，稍微离心。

加入反转录试剂：

补DEPC处理的ddH₂O至20μl。

16℃水浴30min。

38℃水浴30min。

70℃水浴失活10min。

反转录得到的产物用PCR引物和通用引物进行RT-PCR，反应体系为：

ddH₂O补水至20μl。

PCR条件：

RT-PCR结果如图2所示，csu-53小片段在二化螟6个时期中均有表达，并且在幼虫期和蛹期表达较卵期和成虫期高。

用pEASY-T3Cloning Kit(购自北京全式金生物技术有限公司)对其茎环RT-PCR的产物进行TA克隆，并对TA质粒进行测序。具体步骤如下：

(1)吸取3μl并加入1μl质粒pEASY-T3Cloning vector(购自北京全式金生物技术有限公司)，混合均匀在室温下反应5min，迅速放在冰上。

(2)将反应好的混合物加入到50μl大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混匀后放在冰上25min。

(3)42℃水浴下热激30s，迅速置于冰上2min。

(4)加入250μl LB复苏液，并在37℃摇床170rpm迅速复苏1h。

(5)将复苏产物均匀涂于含有2ml，100mg/L的氨苄青霉素的LB培养皿上。

(6)37℃下培养过夜。

TA克隆完毕后，在含有2ml，100mg/L的氨苄青霉素的LB培养皿上挑取单克隆，放入2ml，100mg/L的氨苄青霉素抗性LB中培养过夜，进行质粒抽提。对抽提好的质粒进行酶切检测，选出插入了RT-PCR产物片段的阳性质粒测序。测序结果显示，茎环RT-PCR获得的csu-53的序列与高通量测序的结果完全一致。

实施例4:csu-53片段的人工miRNA表达载体的构建

人工miRNA表达载体的获得来自Warthmann等(2008)报道的玉米Ubiquitin启动子驱动的特异miRNA序列，本实施例的构建方式与其一致，以质粒pNW55(见图3，由德国马普生物发育研究所Detlef Weigel教授提供)为模板，通过重叠延伸PCR的方法扩增出DNA片段。具体的引物如表2所示，一共包含6条引物，其中2条引物为G4368和G4369通用引物，另外4条引物分别为引物53-I、53-II、53-III和53-IV。

表2 amiRNA表达载体构建所需引物序列

第一轮PCR的反应模板为pNW55，使用引物组合G-4368+53-II、53-I+53-IV和53-III+G-4369，反应体系：

补ddH₂O至20μl。

PCR条件：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30cycles；72℃7min。

PCR使用的pfu Taq为pfu polymerase(New England Biolabs，美国)，对PCR产物进行凝胶电泳检测，并用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN，德国)试剂盒回收PCR产物，最后溶于20μl ddH₂O，回收到的产物混合成一管并作为第二次PCR的模板。

第二轮PCR使用G-4368和G-4369通用引物，反应体系如下：

补ddH₂O至20μl。

PCR条件：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，30cycles；72℃7min。

PCR使用的Taq为Ex polymerase(TaKaRa)，对PCR产物进行凝胶电泳检测并对其片段使用pEASY-T3Cloning Kit(购自北京全式金生物技术有限公司)进行TA克隆，并对TA质粒用酶切方法验证正确的质粒进行测序，选择测序正确的质粒用BamH I和Kpn I酶切下目标片段连入本申请人所在的作物遗传改良国家重点实验室先前构建的质粒载体pC1300-Ubi-Nos(见图4，Chen et al.2013)，构建形成本发明的终载体(或称重组质粒)pUbi-ami-csu53(结构见图5)。

实施例5:水稻的遗传转化

用构建好的终表达载体pUbi-ami-csu53通过农杆菌介导的遗传转化方法转化到水稻品种中花11(水稻中花11，又称ZH11，来自中国农业科学院作物科学研究所)中，将获得的转基因的水稻材料命名为水稻种子csu-53，Oryza sativa L.csu-53，于2016年7月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：P201613。

农杆菌介导的遗传转化具体步骤如下：

(1)愈伤组织诱导：

将成熟的水稻种子中花11去壳，然后依次用75％的乙醇处理1min，0.15％氯化汞种子表面消毒20min。用灭菌单蒸水洗种子4-5次，将种子均匀放在愈伤组织诱导培养基上。接种后的愈伤组织诱导培养基放置于黑暗室中培养4-6周，培养温度28±1℃。

(2)愈伤组织继代

挑取亮黄色、紧实并且相对干燥的胚性愈伤组织，放于继代培养基上在暗室中培养3周，培养温度28±1℃。

(3)预培养

挑取紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，放置于预培养基上黑暗条件下培养4d，培养温度28±1℃。

(4)农杆菌培养

在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌2d，培养温度为28±1℃。将农杆菌移至悬浮培养基里，在摇床上以28℃，200rpm的条件培养2-3h。

(5)农杆菌侵染

将预培养的愈伤组织转移至灭菌的瓶子内。调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀＝0.3左右。愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡10min。转移愈伤组织至已灭菌的滤纸上吸干，然后放置于共培养培养基上培养3d，培养温度19-20℃。

(6)愈伤组织洗涤和选择培养

用灭菌水洗涤侵染后愈伤组织7-8次，然后浸泡在含有400mg/L的羧苄青霉素的灭菌水中30min。转移愈伤组织到灭菌好的滤纸上吸干后，转移愈伤组织到选择培养基上进行选择培养3次，每次为2周。

(7)分化诱导

将抗性愈伤组织转移至预分化培养基在黑暗处培养7天，培养温度26±1℃。转移预分化培养的愈伤组织至分化培养基，在光照(按照水稻组织培养的常规光照条件，参照华中农业大学已经授权的同类转基因专利申请公开文献)下培养，培养温度26±1℃。

(8)生根诱导

剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基上光照(按照水稻组织培养的常规光照条件，参照华中农业大学已经授权的同类转基因专利申请公开文献)下培养2-3周，培养温度26±1℃。

(9)小植株移栽

将转基因小植株根上的残留培养基洗干净，将具有良好根系的转基因幼苗转移入温室，同时在最初的几天内保持水分湿润。

本实施例的培养基及其配制方法参见华中农业大学授权的专利文献：专利号2011100832269，授权公告日2013年08月21日。

实施例6:转基因再生水稻植株的阳性检测

转基因再生水稻植株(简称：转基因再生苗)移栽3周后，分别取其叶片，提取DNA(具体方法见后)。利用潮霉素基因引物进行PCR阳性检测。潮霉素基因引物序列：

Hpt-F 5’-AGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGA-3’

Hpt-R 5’-TCAAGACCAATGCGGAGCATATAC-3’。

(1)水稻叶片小量DNA提取：

(1)取3-5cm的幼嫩叶片；

(2)将叶片在磨样机上磨成匀浆，加入800μl的15×CTAB缓冲液，65℃水浴锅中水浴30min，期间每5min摇匀一次；

(3)加入等量的体积比24:1(氯仿/异戊醇)，轻缓颠倒混匀5-10min；

(4)12000rpm离心10min；

(5)吸取300μl的上清，将其转移至另一干净的离心管中，加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，-20℃静置30min；

(6)12000rpm离心15min；

(7)弃上清，加入500μl的75％乙醇，上下混匀洗涤；

(8)12000rpm离心5min；

(11)弃上清，于超净工作台上吹干，加入100μl灭菌的ddH₂O，室温溶解。

PCR反应体系：

用ddH₂O补水至20μl。

PCR条件为：95℃5min，95℃5s，59℃30s，72℃1min 30cycles；72℃7min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，挑取阳性的植株。所得到的阳性T₀代植株繁种后得到T₁代植株，然后对T₁代植株再次进行阳性检测。提取阳性T₁代植株的叶片组织RNA，通过茎环RT-PCR检测目的片段的表达量，RNA抽提方法及茎环RT-PCR的检测与实施例3相同。对通过茎环PCR的方法筛选出表达量较高的植株做进一步检测。

实施例7:转基因植株的接虫鉴定

通过茎环RT-PCR检测获得高表达量的T₁代转基因植株，进行二化螟接虫鉴定。接虫鉴定的具体步骤如下：

(1)取拔节后的转基因水稻植株和野生型中花11(非转基因)水稻植株茎秆；

(2)每个家系取长短一致的5根茎秆置于一根洁净的生根管中，接种20头大小一致刚孵化的二化螟幼虫，用封口膜封住生根管口，每个家系重复做5管；

(3)在光照培养箱内于28℃饲养7d；

(4)剥开茎秆，取出二化螟幼虫，统计来各个家系茎秆中二化螟虫子的平均重量。

接虫鉴定的结果表明，喂饲转基因水稻材料后的二化螟的平均体重比喂饲对照野生型中花11材料的二化螟的平均体重相比有明显的下降(见图6)。对二化螟不同时期，每个时期都进行了三次重复试验。接种二化螟数据表明，与野生型中花11相比，转基因水稻茎秆中的二化螟平均体重下降20％；化蛹时间延长了26.5％；蛹重下降17.1％。

上述接种二化螟试验分别在不同的时间段进行，为单次独立试验中，喂饲表达csu-53片段的水稻植株后二化螟虫重下降趋势基本一致，说明本发明的csu-53片段在水稻植株中超表达后对二化螟的生长有显著的抑止作用，具有一定的抗虫效果。

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Claims

1.SEQ NO：1所示的小RNA csu-53基因在抑制水稻害虫二化螟生长中的应用。

2.如权利要求1所述的小RNA csu-53基因在抑制水稻害虫二化螟生长中的应用，其特征在于，包括下列步骤：

利用csu-53基因序列设计扩增引物53-I、53-II、53-III、53-IV、G4368和G4369，然后用两轮PCR合成csu-53人工miRNA的前体基因，并将该前体基因构建到pC1300-Ubi-Nos载体上，得到重组质粒pUbi-ami-csu53，用该重组质粒转化水稻，得到保藏编号为CCTCC NO:P201613的转基因水稻(Oryza sativa L.)csu-53；

其中：

csu-53人工miRNA前体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

53-I：agGAGGAGCTCGATGGCGCAAGTcaggagattcagtttga；

53-II：tgACTTGCGCCATCGAGCTCCTCctgctgctgctacagcc；

53-III：ctACTTGGGCCTTCGAGCTCCTCttcctgctgctaggctg；

53-IV：aaGAGGAGCTCGAAGGCCCAAGTagagaggcaaaagtgaa；

G-4368：CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC；

G-4369：GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG；

所述的重组质粒pUbi-ami-csu53含有SEQ ID NO：3所示序列的csu-53人工miRNA前体基因。

3.如权利要求2所述的小RNA csu-53基因在抑制水稻害虫二化螟生长中的应用，其特征在于，所述的两轮PCR合成csu-53人工miRNA的前体基因的步骤如下所述：

第一轮PCR：使用引物组合G-4368+53-II、53-I+53-IV和53-III+G-4369以质粒pNW55为模板进行第一轮PCR反应，反应体系为：10×pfu Taq buffer 2.0μl，dNTPs 2.0μl，左、右引物各0.2μl，pNW55 10ng，pfu Taq 0.2μl，灭菌双蒸水至20μl；

反应条件：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30cycles；72℃7min；

将第一轮的PCR产物于0.8％琼脂糖胶电泳，挖胶后回收后得到三种PCR产物，最后溶于20μl灭菌双蒸水；用回收的第一轮PCR的三种PCR产物做第二轮PCR；

第二轮PCR：使用G-4368+G-4369引物组合，反应体系为：10×Ex Taq buffer 2.0μl，dNTPs 2.0μl，G-4368 0.2μl，G-4369 0.2μl，第一轮PCR产物等量混合1.0μl，Ex Taq 0.2μl，灭菌双蒸水至20μl；

反应条件：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，30cycles；72℃7min；最终PCR产物克隆于T载体pEASY-T3上，然后测序验证；利用BamH I和Kpn I酶切含有csu-53 amiRNA前体基因的T载体，并释放出的前体基因克隆于载体pC1300-Ubi-Nos上获得重组质粒pUbi-ami-csu53。