CN103602705B - 利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法：在表达外源基因的同时，利用内源性miRNA作为前体，定向抑制水稻中除草剂解毒酶表达，从而获得安全、可选择灭杀的转基因水稻。具体为：将外源基因表达框与定向抑制解毒酶的amiRNAs表达框构建在同一个植物表达载体上；所述amiRNA表达框包括由启动子、反方向的被抑制基因的全部或部分片段和终止子功能性连接而成。本发明通过定向沉默水稻中参与除草剂解毒和脱毒代谢酶基因的表达，从而获得了一种能安全选择消灭转基因水稻的方法。

Description

利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻方法

技术领域

本发明涉及一种利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法，以及所用的基因、质粒属于基因工程技术领域。

背景技术

转基因农作物目前已经在世界上许多国家大量推广，我国也在大力发展、推广转基因技术和转基因研究。当下，利用转基因农作物作为生物反应器来生产药用蛋白、工业酶等研究工作也开展得如火如荼（LarrickandThomas,CurrentOpinioninBiotechnology,2001,12:411-418）。种植这些转基因农作物存在其可能混入非转基因农作物从而导致混入人食物中的重要健康安全隐患以及转基因漂移等生态安全隐患，因此，发明一种简便、控制转基因农作传播方法具有重大的现实意义。

细胞色素P450是一类利用NADPH所传递的电子去催化分子氧活化的血红素蛋白，占植物基因的1%，是植物中一类重要的酶。它在植物体内介导一系列氧化反应，其功能涉及木质素、甾醇、内萜、生物碱、脂肪酸和许多起植保素功效的次生物质合成代谢，以及天然和人工合成的许多外源抗生素（如除草剂）等物质的降解和除毒代谢等，在植物生长发育、防御病虫害和适应逆境中有着特别重要的作用。细胞色素P450是一个超基因家族，植物中命名的已超过1000个，水稻中可能的有500多个，截止目前，生物学功能被确切验证的植物P450基因只有40个左右，目前的研究显示P450在水稻自身防御中具有重要作用，是茉莉酸途径中的一类重要氧化酶，参与合成二萜、羟色胺等多种用于防御的此生代谢产物（FujiwaraTetal,JouralofBiologyChemistry,2010285:11308-11313;ReubenJPetal,Phytochemisty2006,67:2307-2317）。CYP81A6基因是水稻P450基因家族中苯达松、磺酰脲类除草剂解毒酶基因，故水稻对苯达松、磺酰脲类除草剂有良好的抗性（Siminiszky,PhytochemistryReviews5:445-458;Panetal,PlantMolecularBiology,2006,61:933-943;Werck-Reichhartetal,TrendsinPlantScience5:116-123）。将水稻解毒的P450基因用反义RNA或RNAi技术与目的基因以及其它相关构建于同一载体，就可以在表达目的基因的同时获得可以选择灭杀的转基因植物（生物反应器）。

目前应用的反义RNA或RNAi沉默技术尽管能够达到选择灭杀转基因水稻的目的，但是它存在很多的问题，其中最重要有“脱靶效应”：水稻中P450基因是一个超基因家族，其彼此间的同源性很高，在构建RNA或RNAi沉默载体产生转基因水稻时，dicer酶酶切前体siRNA(dsRNA)不是单一位点酶切，会产生大量siRNA，可能会造成目的基因脱靶；同时，水稻被注释的基因只有60%左右，由于RNA聚合酶的作用，可能会产生次生的siRNA，产生“非靶标效应”，在沉默靶基因的同时，也导致非靶标基因也被沉默，从而可能导致一些有益农艺性状的消失以及一些不可预知的水稻功能缺失(StephanOssowskietal,ThePlantJoural2008,53:674-690；NormanWarthmannetal,PLoSONE,2008,3(3)；张晓辉等，自然科学进展，2009,10:1029-1036)。所以急需一个特异性高、安全、无明显副作用的沉默技术以及方法。

miRNAs(microRNAs)是一种高度保守的、长度为18-25个核苷酸的单链RNA小分子，广泛存在于真核生物中，最早在1993年于秀杆线虫中被发现。miRNAs前体与沉默目标基因存在1个至几个碱基的不完全配对或完全配对，在dicer酶的作用下，miRNAs前体偏好产生并聚集一种sRNA双链结构（miRNA-miRNA*），然后与整合到沉默复合体（RISC）中，最后与靶基因的mRNA3’未翻译区结合，完全匹配的导致mRNA降解而达到靶基因沉默，不完全配对的导致mRNA转录抑制而达到靶基因沉默(NormanWarthmannetal,PLoSONE,2008,3(3);StephanOssowskietal,ThePlantJoural2008,53:674-690)。miRNA沉默技术特异性高、效率高、遗传稳定、作用时间长、体内稳定、高RNA启动子兼容性、无明显毒性等优点（ShaoYaoYing,MicroRNAProtocols,2006,HumanapressInc;KrisshnaraoAppasani,MicroRNAs:FromBasicSciencetoDiseaseBiology,2008,CambridgeUniversityPress），其在功能基因组学研究、基因治疗、动植物抵抗外源病毒等领域具有广泛的应用前景。amiRNAs(artificialmicoRNAs)是利用内源性miRNA前体产生sRNA来实现基因沉默。2002年amiRNAs沉默技术第一次在人细胞系中应用，之后在多种植物和动物中应用。

目前还没有一个既能表达外源蛋白同时又能安全、可选择灭杀的转基因水稻（生物反应器）的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻方法；本发明通过定向沉默水稻中参与除草剂解毒和脱毒代谢酶基因的表达，从而获得了一种能安全选择消灭转基因水稻的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法，在表达外源基因的同时，利用内源性miRNA作为前体，定向抑制水稻中除草剂解毒酶表达，从而获得安全、可选择灭杀的转基因水稻。

作为本发明的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法的改进：将外源基因表达框与定向抑制解毒酶的amiRNAs表达框（amiRNA表达抑制框）构建在同一个植物表达载体上；

amiRNA表达框包括由启动子、反方向的被抑制基因的全部或部分片段和终止子功能性连接而成。

作为本发明的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法的进一步改进：表达的外源基因为医用蛋白基因、工业酶基因、抗虫基因或抗除草剂基因。

作为本发明的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法的进一步改进：作为前体的内源性miRNA命名为OS-528，其多核苷酸序列为SEQIDNO:1。

作为本发明的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法的进一步改进：除草剂解毒酶基因为CYP81A6，其多核苷酸序列为SEQIDNO:2。

作为本发明的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法的进一步改进：在水稻中表达外源基因（目的基因）的同时定向抑制苯达松或磺酰脲类除草剂解毒基因CYP81A6的表达，所得的转基因水稻就能被苯达松或磺酰脲类除草剂选择灭杀；

即，将目的基因（外源基因）表达框和苯达松、磺酰脲类除草剂解毒酶基因CYP81A6表达抑制框连接在同一个载体上，转化时它们在同一个T-DNA片段上导入植物染色体中。

作为本发明的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法的进一步改进：

amiRNAs核苷酸序列为以下：

miR1-F：AGTCAATACATGAGTTCGTCCGGCAGGAGATTCAGTTTGA；

miR1-R：TGCCGGACGAACTCATGTATTGACTGCTGCTGCTACAGCC；

miR11-F：CTCCGGAgGAAgTCATGTATTGATTCCTGCTGCTAGGCTG；

miR11-R：AATCAATACATGAcTTCcTCCGGAGAGAGGCAAAAGTGAA。

备注说明：

amiRNAs存在1-2个碱基错配，小写字体代表的是错配碱基；带下划线的字体代表的是设计的人工miRNAs。

作为本发明的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法的进一步改进：所得的载体为1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i，将所述1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i载体导入水稻中，最终获得抗草甘膦而对除草剂苯达松敏感的转基因水稻。

备注说明：1174相当于一个外源基因。

本发明是一种利用人工小分子RNAs(artificialmicroRNAs，amiRNAs)获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法。

具体而言，本发明采用的技术方案是：

在表达目的基因（外源基因）的同时，利用amiRNAs方法，抑制转基因水稻中参与除草剂解毒、脱毒基因的表达，获得可被安全选择灭杀的转基因水稻。

具体地，所述目标除草剂为苯达松或磺酰脲类除草剂，它们是农业上常用的除草剂，对多种阔叶杂草具有良好的除草能力，水稻具有对这两种除草剂的解毒酶CYP81A6，故对这两种除草剂有良好的抗性（Siminiszky,PhytochemistryReviews5:445-458;Panetal,PlantMolecularBiology,2006,61:933-943;Werck-Reichhartetal,TrendsinPlantScience5:116-123）。故在水稻中表达目的基因的同时定向抑制苯达松或磺酰脲类除草剂解毒基因CYP81A6的表达，转基因水稻就可以被苯达松或磺酰脲类除草剂选择灭杀。2002年amiRNAs沉默技术第一次在人细胞系中成功应用，随后在多种植物和动物中应用，尽管其功能机制还有待于进一步的研究，但由于amiRNAs沉默技术特异性高、效率高、遗传稳定、作用时间长、体内稳定、高RNA启动子兼容性、无明显毒性等优点（ShaoYaoYing,MicroRNAProtocols,2006,HumanapressInc;KrisshnaraoAppasani,MicroRNAs:FromBasicSciencetoDiseaseBiology,2008,CambridgeUniversityPress），其已成为新一代沉默技术的代表(NormanWarthmannetal,PLoSONE,2008,3(3);StephanOssowskietal,ThePlantJoural2008,53:674-690)。amiRNA表达抑制框可以由一个启动子、反方向的被抑制基因的全部或部分片段、终止子等功能性连接而成。启动子可选择玉米泛素启动子Zmubi-1(ChristensenandQuail,TransgenicRes,5:213-8)，或水稻泛素启动子（WangandOard,PlantCellReports,22:129-134），或水稻Actin启动子（McElroyetal,PlantCell2:163-171），或CaMV35S启动子，或其它在水稻中有活性的启动子，终止子可为广泛利用的CaMV35S终止子、Nos终止子等。

在本发明中，为使得到的转基因水稻能稳定传代，目的基因表达框与定向抑制的苯达松、磺酰脲类除草剂解毒酶基因CYP81A6的表达框紧密连锁。这种连锁在本发明中是通过插入DNA片段的构建来实现：即将目的基因表达框和苯达松、磺酰脲类除草剂解毒酶基因CYP81A6表达抑制框连接在同一个载体上，转化时它们在同一个T-DNA片段上导入植物染色体中。例如利用农杆菌转化时，则是连接在同一个T-DNA片段中；利用基因枪方法时，则连接在同一个载体上的同一个DNA插入片段中。

具体地：

1.内源miRNA至少具有以下核苷酸序列编码：SEQIDNO:1。

2.被抑制表达苯达松、磺酰脲类除草剂解毒酶基因CYP81A6至少具有以下核苷酸序列编码：SEQIDNO:2。

3.amiRNAs至少具有以下核苷酸序列：

注：小写字体代表的是错配碱基；带下划线的字体代表的是设计的人工miRNAs。

所述转基因水稻中苯达松、磺酰脲类除草剂解毒酶基因CYP81A6被抑制表达，从而该转基因水稻至少对一种除草剂敏感。

本发明中的发明点是：利用水稻内源性miRNA为前体，构建水稻中苯达松、磺酰脲类除草剂解毒酶基因CYP81A6特异抑制表达框，再将该表达框与目的基因表达框连接在同一个载体上，达到了1个重要目的：特异抑制水稻中苯达松、磺酰脲类除草剂解毒酶基因CYP81A6的表达，致使该转基因水稻对苯达松或磺酰脲类除草剂敏感，从而可以选择灭杀该转基因水稻。

本发明的方法具备如下优点：

1、特异抑制水稻解毒酶基因CYP81A6表达。

2、可选择性灭杀转基因水稻。

3、在用水稻表达外源蛋白时，利用水稻内源性miRNAs作为前体，构建amiRNAs沉默载体，定向沉默水稻中降解苯达松、磺酰脲类除草剂的P450解毒酶基因--CYP81A6，可以获得安全、可选择灭杀转基因水稻，具有重要的生态、食品安全意义。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为载体1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP816Ai的T-DNA结构示意图。

具体实施方式

以下实施例中，非转基因常规水稻均为秀水134。

实施例1、茎环骨架内源性miRNA选择：

通过2个标准从miR/Rfam中存在的所有水稻miRNA前体中进行茎环骨架内源性miRNA选择，该2个标准具体如下：

标准1.预测二级结构能够形成短、简单发卡茎环结构、同时能不通过插入或删除就能形成完全miRNA-miRNA*匹配的内源性miRNA前体；

标准2.该内源性miRNA前体序列已经在EST数据库中存在并有相应文献支持。

osa-MIR528（获取号：MI0003201；相应文献：NormanWarthmannetal,PLoSONE,2008,3(3)。）符合上述2个标准。

osa-MIR528（获取号：MI0003201）的前体能够形成短的茎环结构同时其在水稻的根、叶等多个组织中均存在以及表达（LiuBetal，PlantPhysiol2005，139:296–305）；通过NCBI数据库搜索该前体有3个EST序列（获取号分别为：AK099390，AK073820，AK063857）；通过序列align发现前体（osa-MIR528）中存在intron，而osa-MIR528的茎环结构已经有明确的注释LOC_Os03g03724(TIGRv5,orLOC_Os03g0129400,RAP)（http://www.mirba-se.org/index.shtml），故选择包含osa-MIR528茎环结构长度为245bp的前体DNA片段作为miRNA前体，利用引物MIR528-F（5’-3’：TCGGATCCCAGCAGCAGCCACAGCAAA下划线为BamHⅠ位点）、MIR528-R（5’-3’：CTCGAGCTCGCTGCTGATGCTGATGCCAT下划线为SacⅠ位点）按照标准PCR从水稻品系“秀水134”基因组中获得，命名为OS-528，其序列为SEQIDNO：1。SEQIDNO：1中，加下划线的为内源前体0S-528中被替换的21个碱基。

备注说明：OS-528是具有茎环骨架的内源性miRNA，OS-528是osa-MIR528去掉了intron后的序列。

实施例2.人工amiRNA选择：

WMD2(http://wmd2.weigelworld.org)目前可提供包括水稻在内的38种植物21个base的miRNA序列，它（WMD2）通过两步筛选给出特异、有效的候选miRNA，首先，该数据库软件会将输入序列中所有第十位碱基为“A”或“U”且5’端不稳定（5’高AU含量，3’高GC含量）长度为21个base的序列视为候选miRNA，接着将所有候选miRNA第一个base替换为“U”，然后基于特异物种基因或序列对候选miRNA的13-15和17-21碱基连续替换，将在“种子区域”（2-12碱基区域）与靶序列只有不超过1个碱基错配，在其他位点有1或2个碱基错配的候选miRNA作为最终的miRNA返回给用户（SchwabRetal,PlantCell,2006,18:1121–1133;OssowskiSetal,PlantJ,2008,53:674–690;SchwabRetal,DevCell,2005,8:517–527）。

将CYP81A6基因所对应的mRNA的3’未翻译区序列输入WMD2数据库软件，获得候选amiRNA-amiRNA*序列。

备注说明：SEQIDNO：2中，带单下划线的加粗斜体为CYP81A6基因5’非翻译区，带双下划线的加粗斜体为3’非翻译区。

具体如下：

注：小写字体代表的是错配碱基；带下划线的字体代表的是设计的人工miRNAs。

实施例3、水稻表达载体1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i构建

利用引物miR1-F：AGTCAATACATGAGTTCGTCCGGCAGGAGATTCAGTTTGA（下划线代表替换碱基）；

miR1-R：TGCCGGACGAACTCATGTATTGACTGCTGCTGCTACAGCC（下划线代表替换碱基）；

miR11-F：CTCCGGAgGAAgTCATGTATTGATTCCTGCTGCTAGGCTG（下划线代表替换碱基，小写字母代表错配碱基）；

miR11-R：AATCAATACATGAcTTCcTCCGGAGAGAGGCAAAAGTGAA（下划线代表替换碱基，小写字母代表错配碱基）；

替换245bp内源miRNAosa-MIR528中的21bp的碱基序列（备注：miR1-R包含amiRNA正义链序列，miR1-F包含amiRNA反义链序列，miR11-F包含amiRNA*正义链序列，miR11-R包含amiRNA*正义链序列）。

备注说明：SEQIDNO：1中，加下划线的为内源前体0S-528中被替换的21个碱基。

具体方法为：

1）.利用引物MIR528-F与miR1-R、miR1-F与miR11-R、miR11-F与MIR528-R以OS-528为模板按照标准PCR分别获得128bp、89bp、177bp片段，分别电泳凝胶回收。具体如下：

注：斜体字母代表替换碱基；小写字母代表错配碱基。

2）.利用引物MIR528-F与MIR528-R以1）中三个回收片段混合物为模板进行标准PCR，获得329bp的融合片段（如SEQIDNO：3所述），即amiRNA，克隆到PMD-19-T载体，然后送上海生工测序（中国，上海）。备注说明：SEQIDNO：3中：斜体字母代表替换碱基；带双下划线的字母代表错配碱基；带单下划线的字母分别为下划线BamHⅠ位点、下划线SacⅠ位点。

将测序正确的amiRNA用BamHⅠ、SacⅠ双酶切，连接到经过BamHⅠ、SacⅠ双酶切的过渡1300-Ubq-NJB载体上，转大肠杆菌TG1，将正确克隆用HindⅢ、KpnⅠ双酶切（获得带启动子Ubq、amiRNA、终止子的目的片段），凝胶回收目的片段（如SEQIDNO：3所述），与经过HindⅢ、KpnⅠ双酶切的双元载体1300-35S-Ubq-1174进行连接(注：1174为高抗草甘膦基因)，获得amiRNA载体1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i（图1）。

所述的amiRNA载体1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i中，作为外源基因的是高抗草甘膦基因—1174。

备注说明：

一、过渡1300-Ubq-NJB载体的构建方法为：

1）、PCR扩增玉米泛素启动子Ubq（带HindⅢ、BamHⅠ酶切位点）、基因NJB（带BamHⅠ、SacⅠ酶切位点）。

2）、用HindⅢ、KpnⅠ双酶切pCAMBIA1300载体，电泳回收载体；用HindⅢ、BamHⅠ双酶切玉米泛素启动子Ubq，电泳回收启动子Ubq片段；用BamHⅠ、SacⅠ双酶切基因NJB，电泳回收基因NJB片段。

3、将2中的3个片段进行连接，转化大肠杆菌TG1并鉴定，获得过渡载体1300-Ubq-NJB。

二、双元载体1300-35S-Ubq-1174的构建方法为：

1、人工合成基因1174（带BglⅡ、终止子、HindⅢ位点）。

2、PCR扩增玉米泛素启动子Ubq（带KpnⅠ、BamHⅠ酶切位点）

3、用HindⅢ、KpnⅠ双酶切pCAMBIA1300载体，电泳回收载体；用BglⅡ、HindⅢ双酶切基因1174，电泳回收基因片段；用KpnⅠ、BamHⅠ双酶切玉米泛素启动子Ubq，电泳回收启动子Ubq片段。

4,、将3中3个片段进行连接、转化，将正确质粒用KpnⅠ、HindⅢ酶切，电泳回收目的片段（Ubq-1174）并补平、去磷酸化；用XhoⅠ单酶切pCAMBIA1300载体并补平、去磷酸化；将这两个片段进行连接、转化即可获得双元载体1300-35S-Ubq-1174。

实施例4、定向抑制解毒基因CYP81A6而对苯达松、磺酰脲敏感的转基因水稻的获得

转基因水稻的获得方法是采用现有技术（卢雄斌等，1998生命科学10：125-131；刘凡等，2003分子植物育种1：108-115）。选取成熟饱满的“秀水134”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。通过电击方法将T-DNA载体1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i导入到根癌农杆菌LB4404感受态中。取含T-DNA载体1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i的农杆菌划板，挑去单菌落接种，准备侵染愈伤。将待转化的水稻愈伤组织放入OD₆₆₀为0.6的含T-DNA载体1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i的农杆菌菌液中（含乙酰丁香酮，40mg/L），让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养2-3天。用无菌水冲洗转化的愈伤，然后将其转移到含2mM草甘膦筛选培养基上，筛选培养两个月（中间继代一次）。把筛选后生长良好的愈伤转移到预分化培养基上共培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织转移到分化培养基上，光暗比（14h:10h）分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，炼苗3-4天，最后将再生植株洗去琼脂移植到温室作为鉴定材料。

T-DNA的插入及其基因的表达可以通过PCR和Western印迹分析检测，通过基因特异引物可扩增出基因大小片段或通过WesternBlot可获得相应大小蛋白条带，即可确定基因的插入及表达；基因组DNA可以根据现有的方法从转化再生水稻植株和非转化水稻植株中提取。

实施例5利用除草剂对转基因水稻进行功能正负选择验证

获得转化了1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i的T0代转基因水稻植株和非转基因水稻植株分别在培养溶液中单株培养。设3个处理，每个处理包括来自不同1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i转化事件的T0代转基因水稻植株各30个和10个非转基因植株。

处理1：喷10mM草甘膦；处理2：喷2500mg/L苯达松；处理3：空白对照，喷清水。每个处理喷80mL/平方米，处理后10天记录植株成活率，结果见表1。

表2非转基因、1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i转基因水稻对草甘膦和苯达松处理下敏感性

从上表我们可以看出：1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i转基因水稻抗草甘膦基因正常表达，对草甘膦表现出很高的抗性，对苯达松敏感；非转基因水稻对草甘膦敏感，对苯达松不敏感。初步达到预期在表达外源蛋白时，利用amiRNA抑制解毒酶基因CYP81A6表达，从而使转基因水稻可以用苯达松进行选择灭杀的目的。

实施例6、T1代1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i转基因水稻的除草剂敏感性测定

T1代1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i转基因水稻符合孟德尔遗传规律，遗传稳定，将1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i转基因水稻两个转化事件的T1代阳性植株各100株和200株非转基因常规水稻混种，在4-5叶期间分为两个处理：处理1喷施80mL/平方米的2500mg/L苯达松，处理2喷施10mM草甘膦。10天后，处理1中两个1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i转基因水稻转化事件阳性植株被全部杀灭，非转基因常规水稻生长正常；处理2中两个1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i转基因水稻转化事件阳性植株生长正常，非转基因常规水稻被全部杀灭。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110>浙江大学

<120>利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻方法

<160>3

<210>1

<211>245

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>OS-528的多核苷酸序列

<400>1

cagcagcagccacagcaaaatttggtttgggataggtaggtgttatgttaggtctggttt60

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<210>2

<211>1867

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>OS-528的多核苷酸序列

<400>2

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<210>3

<211>329

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>融合片段

<400>3

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Claims (5)

1.利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法，其特征在于：在表达外源基因的同时，利用内源性miRNA作为前体，定向抑制水稻中除草剂解毒酶表达，从而获得安全、可选择灭杀的转基因水稻；

amiRNAs核苷酸序列为以下：

miR1-F：AGTCAATACATGAGTTCGTCCGGCAGGAGATTCAGTTTGA；

miR1-R：TGCCGGACGAACTCATGTATTGACTGCTGCTGCTACAGCC；

miR11-F：CTCCGGAgGAAgTCATGTATTGATTCCTGCTGCTAGGCTG；

miR11-R：AATCAATACATGAcTTCcTCCGGAGAGAGGCAAAAGTGAA；

作为前体的内源性miRNA命名为OS-528，其多核苷酸序列为SEQIDNO:1；

除草剂解毒酶基因为CYP81A6，其多核苷酸序列为SEQIDNO:2。

2.根据权利要求1所述的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法，其特征在于：将外源基因表达框与定向抑制解毒酶的amiRNAs表达框构建在同一个植物表达载体上；

所述amiRNA表达框包括由启动子、反方向的被抑制基因的全部或部分片段和终止子功能性连接而成。

3.根据权利要求2所述的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法，其特征在于：表达的外源基因为医用蛋白基因、工业酶基因、抗虫基因或抗除草剂基因。

4.根据权利要求3所述的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法，其特征在于：在水稻中表达外源基因的同时定向抑制苯达松或磺酰脲类除草剂解毒基因CYP81A6的表达，所得的转基因水稻就能被苯达松或磺酰脲类除草剂选择灭杀。

5.根据权利要求4所述的利用amiRNAs获得安全可选择灭杀转基因水稻的方法，其特征在于：所得的载体为1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i，所述1300代表pCAMBIA1300双元载体，所述1174代表高抗草甘膦基因，所述CYP81A6i为CYP81A6的amiRNA，其序列为SEQIDNO：3；

将所述1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i载体导入水稻中，最终获得抗草甘膦而对除草剂苯达松敏感的转基因水稻。