CN101570752A - 一种用于预防烟草花叶病毒病的小干扰rna的制备和应用 - Google Patents

一种用于预防烟草花叶病毒病的小干扰rna的制备和应用 Download PDF

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CN101570752A
CN101570752A CNA2009100222006A CN200910022200A CN101570752A CN 101570752 A CN101570752 A CN 101570752A CN A2009100222006 A CNA2009100222006 A CN A2009100222006A CN 200910022200 A CN200910022200 A CN 200910022200A CN 101570752 A CN101570752 A CN 101570752A
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tobacco mosaic
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安德荣
赵明敏
张文斌
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Northwest A&F University
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Abstract

本发明涉及一种用于预防烟草花叶病毒病的小干扰RNA的制备和应用，其能有效干扰烟草花叶病毒的侵染，预防由烟草花叶病毒引起多种植物病毒病。制备方法为：选择烟草花叶病毒复制酶基因、外壳蛋白基因和运动蛋白基因为靶位，按照以下方法设计小干扰RNA：从开放阅读框3’端300bp以后，避开调控识别区，选择以AA开头、G+C含量为30－50％的19nt的寡核苷酸，以TTCAAGAGA为环碱基，Oligo末端增加RNaseIII结合的终止转录位点4－6个TT区，尾部避免G，再在Oligo 3’端加BamH I识别序列，5’端加Sst I识别序列，在BamH I下游加HindIII识别序列，生物合成同源于TMV基因组的小干扰RNA。

Description

一种用于预防烟草花叶病毒病的小干扰RNA的制备和应用
一、技术领域：
本发明涉及一种用于预防烟草花叶病毒(Tobacco Masaic Virus-TMV)感染的新型生物制剂，尤其是涉及一种用于预防烟草花叶病毒病的小干扰RNA(small interfering RNA-siRNA)的制备，属于生物制药技术领域。
二、背景技术：
RNA干扰现象是指当与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA(dsRNA)导入细胞后，该mRNA发生特异性的降解，而导致该基因表达的沉默。是属于转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)机制范畴，被认为是植物在进化过程中发展出的一种非常先进的抵抗外来基因(病毒、转座子等)入侵的防御方式。目前，在果蝇(Drosophila)、锥虫(Trypanosomes)、涡虫(Planaria)、斑马鱼(Zebrafish)、拟南芥(Arabid opsis thaliana)、大小鼠和人体内均发现了RNAi现象。在RNA干扰应用方面，21nt的小干扰RNA作为RNAi途径的重要中介，已被广泛应用于哺乳动物和人细胞体系中基因功能和抗病毒研究，并取得了良好效果，但在植物抗病毒研究中应用较少。
根癌农杆菌介导的瞬时表达系统已广泛用于非转基因植物的基因功能研究，它不仅可以快速地导入外源基因，而且使转入基因在短时间内表达。它的另一个特点是可以在一个叶片组织中同时导入多个基因。由于上述优点，这一研究技术将在功能基因组学和蛋白组学研究中发挥更大的作用。
烟草花叶病毒具有寄主范围广、抗逆性强和在生产上造成的危害大等特点。TMV可侵染茄科、藜科、苋科、葫芦科、十字花科、木犀科、锦葵科、番杏科、豆科和商陆科等共30科300多种植物，包括烟草、番茄、茄子、辣椒、菠菜等。全世界每年因TMV而造成的经济损失就超过1亿美元；在我国，南北烟区均有发生，尤其南方烟区受害较重，田间株发病率一般5％～20％，个别田块可高达30％～100％，早期发病的损失可达50％～70％，甚至失收；此外，染病烟叶的质量等级也会下降，品质变劣，对优质烟叶生产构成了极大威胁。同时TMV体外失活温度较高，汁液中的病毒经75℃处理40d才失去致病力，干病叶在120℃经30min仍不失致病力，防治相当困难。
另一方面，烟草花叶病毒是正单链RNA病毒，是典型的模式植物病毒。该病毒基因组中，126kDa蛋白是病毒的复制酶，参与TMV病毒在植物体内的复制和增殖；外壳蛋白具有保护病毒RNA，病毒在植物体内的长距离运输，参与黄化症状的表达；30kDa的运动蛋白与病毒在细胞与细胞间的运动有关。研究清楚RNA干扰在植物抗TMV上的作用，既可防治由烟草花叶病毒引起多种植物病毒病，如烟草花叶病，辣椒病毒病，番茄病毒病。可以带动其他病毒的相关理论问题和应用实践研究。
三、发明内容：
本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种用于预防烟草花叶病毒病的小干扰RNA及制备和应用，其能有效干扰烟草花叶病毒的侵染，预防由烟草花叶病毒引起多种植物病毒病。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于预防烟草花叶病毒病的小干扰RNA的制备，其特征在于：小干扰RNA的核苷酸序列为：
(1)相应于TMV复制酶基因ORF1519-1537、2129-2147片段的19寡核苷酸序列：
siRNA1519：
F：5’-GATCCAAGCTTCGACTTATCAGAGTGGCAGGCTTCAAGAGAGCCTGCCACTCTGATAAGTTTTTTTGAGCT-3’
R：5’-CAAAAAACTTATCAGAGTGGCAGGCTCTCTTGAAGCCTGCCACTCTGATAAGTCGAAGCTTG-3’
siRNA2129：
F：5’-GCTGGATCCAAGCTTCGTTCGTAAGCAGATGAGCTCTTCAAGAGAGAGCTCATCTGCTTACGAATTTTTGAGCTCCTG-3’
R：5’-CAGGAGCTCAAAAATTCGTAAGCAGATGAGCTCTCTCTTGAAGAGCTCATCTGCTTACGAACGAAGCTTGGATCCAGC-3’
(2)相应于TMV外壳蛋白编码区域的19寡核苷酸序列：
F：5’-GATCCAAGCTTCGATGTGAAGATGTCAGCGGGTTCAAGAGACCCGCTGACATCTTCACATTTTTTGAGCT-3’
R：5’-CAAAAAATGTGAAGATGTCAGCGGGTCTCTTGAACCCGCTGACATCTTCACATCGAAGCTTG-3’
(3)相应于TMV运动蛋白编码区181-199、435-454、781-799的19核苷酸序列：
siRNA181：
F：5’-GATCCAAGCTTCGCTTATTGATAGTGGATACGTTCAAGAGACGTATCCACTATCAATAAGTTTTTGAGCT-3’
R：5’-CAAAAACTTAAAGATAGTGGATACGTCTCTTGAACGTATCCACTATCAATAAGCGAAGCTTG-3’
siRNA435：
F：5’-GATCCAAGCTTCGTGTGAAGATGTCAGCGGGTTTCAAGAGAACCCGCTGACATCTTCACATTTTTGAGCT-3’
R：5’-CAAAAA TGTGAAGATGTCAGCGGGTTCTCTTGAAACCCGCTGACATCTTCACACGAAGCTTG-3’
siRNA781-799
F：5’-GATCCAAGCTTCGACTGTCGCCGAATCGGATTTTCAAGAGAAATCCGATTCGGCGACAGTTTTTTGAGCT-3’
R：5’-CAAAAAACTGTCGCCGAATCGGATTTCTCTTGAAAATCCGATTCGGCGACAGTCGAAGCTTG-3’
一种用于预防烟草花叶病毒病的小干扰RNA的制备，其特征在于：选择烟草花叶病毒复制酶基因、外壳蛋白基因和运动蛋白基因为靶位，按照以下方法设计小干扰RNA：从开放阅读框3’端300bp以后，避开调控识别区，选择以AA开头、G+C含量为30-50％的19nt的寡核苷酸，以TTCAAGAGA为环碱基，Oligo末端增加RNaseIII结合的终止转录位点4-6个TT区，尾部避免G，再在Oligo 3’端加BamH I识别序列，5’端加Sst I识别序列，在BamH I下游加HindIII识别序列，生物合成同源于TMV基因组的小干扰RNA。
一种用于预防烟草花叶病毒病的小干扰RNA的应用，其特征在于：用BamHI和Sst I酶切具有T-DNA整合必需序列和卡那霉素抗性基因的pBI121质粒，与退火后的小干扰RNA连接，构建成小干扰RNA重组表达载体pBI121/siRNA，共3种6个；应用表达载体pBI121/siRNA，用CaCl2转化法转至大肠杆菌TG1进行鉴定与扩繁，从中抽提质粒后，再转入根癌农杆菌EHA105中，得到6株不同的根癌农杆菌EHA105；将根癌农杆菌EHA105接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，28℃培养24h，离心沉淀菌体，去上清，用10mM乙磺酸、10mM氯化镁和150uM乙酰丁香酮的缓冲液悬浮菌体至光密度为OD600＝0.8；将菌丝体悬浮液再添加佐剂和1/100w/w 80目金刚砂，作为生物性保护制剂，高压喷雾器喷施于烟草叶面，有效干扰TMV的侵染。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
本发明提供一种用于预防烟草花叶病毒病的小干扰RNA(smallinterfering RNA-siRNA)的制备以及在此基础上研制的生物制剂。该制备过程选择烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus-TMV)复制酶(126kDa蛋白)基因、外壳蛋白基因和运动蛋白基因为靶位，设计时从开放阅读框3’端300bp以后，避开调控识别区，选择以AA开头、G+C含量为30-50％的19nt的寡核苷酸(Oligo)，以TTCAAGAGA为环(Loop)碱基，Oligo末端增加4-6个TT区，尾部避免G，再在Oligo 3’端加BamH I识别序列和HindIII识别序列，5’端加SstI识别序列，将合成的siRNA与含有T-DNA整合的必需序列和卡那霉素抗性基因的pBI121载体连接，得到3种6个重组表达载体pBI121/siRNA，先分别转至大肠杆菌进行鉴定与繁殖，再转化至根癌农杆菌EHA105中，在LB培养基(含50μg/ml卡那霉素)中，28℃液体发酵24h，离心去上清，所得菌丝添加佐剂和1/100(w/w)80目金刚砂，高压喷施到烟草叶面，挑战接种TMV后，均能有效干扰TMV的侵染，其中靶向TMV126kDa蛋白的siRNA的抑制率达86％-100％。既可预防由烟草花叶病毒引起的多种病毒病，如烟草花叶病，辣椒病毒病，番茄病毒病，又可以带动其他病毒的相关理论问题和应用实践研究。
四、附图说明：
图1为植物双元表达载体pBI121的图谱；
图2双元载体pBI121酶切线性化电泳鉴定；
图3重组表达载体的酶切鉴定；
图4为重组表达载体pBI/siRNA的构建；
图5转化农杆菌EHA105后pBI/siRNA的HindIII酶切鉴定；
图6农杆菌喷施处理的普通烟叶片接种TMV 7d后病毒含量；
图7 Northern杂交检测siRNA介导的干扰作用的时间和部位依赖性；
五、具体实施方式：
1、表达siRNA的寡核苷酸(Oligo)的设计合成
依据TMV126kD蛋白、外壳蛋白和运动蛋白对应的mRNA，设计并合成表达小干扰RNA的寡核苷酸，其序列为：
(1)相应于TMV复制酶基因(126kDa蛋白)ORF1519-1537、2129-2147片段(下划线部分，下同)的19寡核苷酸(nt)序列
siRNA1519：
F：5’-GATCCAAGCTTCGACTTATCAGAGTGGCAGGCTTCAAGAGAGCCTGCCACTCTGATAAGTTTTTTGAGCT-3’
R：5’-CAAAAAACTTATCAGAGTGGCAGGCTCTCTTGAAGCCTGCCACTCTGATAAGTCGAAGCTTG-3’
siRNA2129：
F：5’-GCTGGATCCAAGCTTCGTTCGTAAGCAGATGAGCTCTTCAAGAGAGAGCTCATCTGCTTACGAATTTTTGAGCTCCTG-3’
R：5’-CAGGAGCTCAAAAATTCGTAAGCAGATGAGCTCTCTCTTGAAGAGCTCATCTGCTTACGAACGAAGCTTGGATCCAGC-3’
(2)相应于TMV外壳蛋白编码区域的19寡核苷酸(nt)序列
F：5’-GATCCAAGCTTCGATGTGAAGATGTCAGCGGGTTCAAGAGACCCGCTGACATCTTCACATTTTTTGAGCT-3’
R：5’-CAAAAAATGTGAAGATGTCAGCGGGTCTCTTGAACCCGCTGACATCTTCACATCGAAGCTTG-3’
(3)相应于TMV运动蛋白编码区181-199、435-454、781-799的19核苷酸(nt)序列
siRNA181：
F：5’-GATCCAAGCTTCGCTTATTGATAGTGGATACGTTCAAGAGACGTATCCACTATCAATAAGTTTTTGAGCT-3’
R：5’-CAAAAACTTATTGATAGTGGATACGTCTCTTGAACGTATCCACTATCAATAAGCGAAGCTTG-3’
siRNA435：
F：5’-GATCCAAGCTTCGTGTGAAGATGTCAGCGGGTTTCAAGAGAACCCGCTGACATCTTCACATTTTTGAGCT-3’
R：5’-CAAAAATGTGAAGATGTCAGCGGGTTCTCTTGAAACCCGCTGACATCTTCACACGAAGCTTG-3’
siRNA781-799
F：5’-GATCCAAGCTTCGACTGTCGCCGAATCGGATTTTCAAGAGAAATCCGATTCGGCGACAGTTTTTTGAGCT-3’
R：5’-CAAAAAACTGTCGCCGAATCGGATTTCTCTTGAAAATCCGATTCGGCGACAGTCGAAGCTTG-3’
2、寡核苷酸与线性化载体pBI121连接
用BamH I和Sst I酶切pBI121质粒，将退火后的Oligo DNA与酶切产物用T4DNA连接酶连接，以构建成siRNA的重组表达载体pBI121/siRNA。
DNA限制性内切酶反应体系包含1-5μg DNA，1/10总体积的10×酶切反应缓冲液和适量的DNA限制性内切酶及RNase A，反应体积一般为20μl-40μl，37℃保温2h。
DNA片段连接反应体系包含0.1-0.2μg的载体DNA，1-2μg外源片段DNA，1/5体积5×T4 Ligase Buffer，1单位T4 DNA连接酶，反应体系一般为20μl。平端连接16℃过夜，粘性末端于22℃连接4h后即可用于转化。
3、转化至感受态大肠杆菌TG1进行鉴定与扩繁
(1)CaCl2感受态细胞的制备
将培养过夜的受体菌按2％的比例转接于50mlLB中，37℃振荡培养1.5h至对数生长期，4000rpm离心2min，弃上清，菌体悬浮于10ml冰预冷的100mMCaCl2中，冰浴30min，于4℃以4000rpm离心2min，菌体悬浮于2ml冰预冷的100mM CaCl2中，置冰浴中保存备用。
(2)CaCl2感受态细胞的转化
质粒DNA及其连接产物的转化：取20ng质粒DNA或适量连接产物，加入100μl感受态细胞，轻轻混匀，冰浴放置30min，于42℃热冲击90s，加入1ml LB培养液，于37℃保温45min，然后取200μl涂布于含适当抗生素的LB平板上，于37℃倒置培养过夜。
(3)转入pBI121/siRNA的大肠杆菌TG1扩繁
LB培养液：1％tryptone，0.5％yeast extract，1％NaCl，pH7.0
LB固体培养基：LB培养液，加琼脂粉至浓度为1.5-2.0％
4、转入根癌农杆菌EHA105
利用直接转化法将pBI/siRNA植物表达载体导入农杆菌EHA105后，用利福平与卡那霉素作为选择标记，将获得的带抗性标记的克隆提取质粒，用HindIII酶切进行鉴定。获得转入质粒pBI/siRNA的农杆菌EHA105。
5、根癌农杆菌的发酵及生物制剂
将携带有重组表达载体的根癌农杆菌接种于5ml LB培养基(含50μg/ml卡那霉素)中，28℃培养24h，离心沉淀菌体，去上清，用含有10mM(N-吗啉)乙磺酸(MES，pH5.6)、10mM氯化镁和150uM乙酰丁香酮(AS)的缓冲液悬浮菌体至光密度为OD600＝0.8左右。28℃静置2-3h后，添加佐剂和1/100(w/w)80目金刚砂，用高压喷雾器喷施到烟草叶面，挑战接种TMV证明对其预防效果。
通过以下检测方法证明本发明制剂具有抗TMV活性
1、瞬时表达siRNA对TMV侵染干扰效果的生物学检测
将含有pBI121/siRNA的根癌农杆菌EHA105喷施到4-5叶期的心叶烟叶片的一半，另一半喷施含空载体的根癌农杆菌，以叶片全部渗入含空载体的根癌农杆菌做对照，以喷施含空载体的根癌农杆菌做对照，4d后分别在喷施叶片接种TMV病毒。5d后，统计心叶烟上的枯斑数目见下表。pBI121和pBI/siRNA1519-的处理心叶烟上有较多的枯斑，而pBI/siRNA1519和pBI/siRNA2129处理的则有极少的枯斑或没有枯斑产生(表1)，平均抑制率分别为为96.82％和95.55％。
表1含pBI/siRNA的农杆菌处理的心叶烟在病毒侵染后的枯斑数
    重复     pBI121-pBI/siRNA1519     pBI121-pBI/siRNA2129     pBI121-pBI121
    1     32/2     27/0     33/23
    2     28/0     33/3     24/27
    3     21/0     30/0     32/27
    4     34/3     30/1     26/31
    5     25/1     24/0     23/20
    6     30/0     21/3     25/31
2、ELISA检测病毒含量
用含有pBI/siRNA181、pBI/siRNA435、pBI/siRNA781的根癌农杆菌EHA105喷施到4-5叶期的普通烟叶片，以注射空载体pBI121和Mock不作任何处理的烟草叶片作对照，4d后分别在喷施根癌农杆菌EHA105叶片上接种TMV。对接种病毒7d后的普通烟叶片，用TAS-ELISA测定TMV病毒含量(图6)。在瞬时表达pBI121/siRNA的叶片上检测到较少的病毒含量，而在喷施空载体的根癌农杆菌和不作任何处理的Mock对照均检测到较高含量的病毒。其中siRNA181的处理干扰效果最明显，OD405仅为0.047。
3、Northern杂交检测TMV RNA在系统寄主的积累
为研究烟草叶片在喷施表达pBI/siRNA1519的载体之后何时发生干扰作用以及持续时间，将TMV病毒与农杆菌悬浮液同时接种或者在农杆菌喷施后1-7d分别接种TMV病毒，分别在接种0，1，2，3，4，5，6，7d取样检测TMV病毒RNA积累情况，Northern杂交试验发现，农杆菌喷施和病毒接种同时进行或者间隔1-2d的烟草叶片有大量TMV RNA积累，而二者处理时间间隔3-7d的叶片则有少量或未检测到TMV RNA积累(见图7)。
实施例1：
相应于TMV外壳蛋白编码区域的19寡核苷酸(nt)序列的设计与合成：
依据TMV外壳蛋白对应的mRNA，设计并合成表达小干扰RNA的siRNA，设计合成的按下面原则设计：(1)从靶蛋白的ORF 3’端300bp以后开始设计，避开调控识别区；(2)选择以AA开头的19nt的Oligo，并使得G+C含量为30-50％；(3)Loop碱基为TTCAAGAGA；(4)Oligo末端增加RNaseIII结合的终止转录位点4-6个TT区，尾部避免G。再根据pBI121载体需要，在Oligo两端加相应的限制性内切酶识别序列，如3’端加BamH I识别序列，5’端加Sst I识别序列。在BamH I下游加HindIII识别序列，以便于筛选重组子时，鉴定阳性克隆。这样，预期在植物体内转录后可自动折叠形成19bp的发夹给构，颈环部位可迅速被剪切产生功能性siRNA。生物合成两条寡核苷酸(Oligo)片。序列为：
F：5’-GATCCAAGCTTCGATGTGAAGATGTCAGCGGGTTCAAGAGACCCGCTGACATCTTCACATTTTTTGAGCT-3’
R：5’-CAAAAAATGTGAAGATGTCAGCGGGTCTCTTGAACCCGCTGACATCTTCACATCGAAGCTTG-3’
实施例2：
作用于TMV复制酶基因的生物制剂的研制：
(1)依据TMV 126kDa蛋白对应的编码区1519-1537、2129-2147片段(下划线部分，下同)，设计并合成表达小干扰RNA的siRNA1519序列：
F：5’-GATCCAAGCTTCGACTTATCAGAGTGGCAGGCTTCAAGAGAGCCTGCCACTCTGATAAGTTTTTTGAGCT-3’
R：5’-CAAAAAACTTATCAGAGTGGCAGGCTCTCTTGAAGCCTGCCACTCTGATAAGTCGAAGCTTG-3’
siRNA2129：
F：5’-GCTGGATCCAAGCTTCGTTCGTAAGCAGATGAGCTCTTCAAGAGAGAGCTCATCTGCTTACGAATTTTTGAGCTCCTG-3’
R：5’-CAGGAGCTCAAAAATTCGTAAGCAGATGAGCTCTCTCTTGAAGAGCTCATCTGCTTACGAACGAAGCTTGGATCCAGC-3’
(2)用BamH I和Sst I酶切pBI121质粒，将退火后的Oligo DNA与酶切产物用T4DNA连接酶连接，以构建成siRNA的重组表达载体pBI121/siRNA。
(3)转化至感受态大肠杆菌TG1中
取20ng质粒DNA或适量连接产物，加入100μl感受态细胞，轻轻混匀，冰浴放置30min，于42℃热冲击90s，加入1ml LB培养液，于37℃保温45min，然后取200μl涂布于含适当抗生素的LB平板上，于37℃倒置培养过夜。
(4)转入根癌农杆菌EHA105
利用直接转化法从大肠杆菌提取的pBI/siRNA植物表达载体导入农杆菌EHA105后，用利福平与卡那霉素作为选择标记，获得转入质粒pBI/siRNA的农杆菌EHA105。
(5)根癌农杆菌的发酵及生物制剂
将获得转入质粒pBI/siRNA的根癌农杆菌EHA105 5ml LB培养基(含50μg/ml卡那霉素)中，28℃培养24h，离心沉淀菌体，去上清，用含有10mM(N-吗啉)乙磺酸(MES，pH5.6)、10mM氯化镁和150uM乙酰丁香酮(AS)的缓冲液悬浮菌体至光密度为OD600＝0.8左右。28℃静置2-3h后，添加佐剂和1/100(w/w)80目金刚砂，用高压喷雾器田间喷雾造成微伤，可解决含有质粒pBI/siRNA的农杆菌EHA105侵入发病植株体内的问题，保证siRNA对TMV126kDa蛋白的干扰作用。
SEQUENCE LISTING
<110>西北农林科技大学
安，德荣
<120>一种用于预防烟草花叶病毒病的小干扰RNA的制备和应用
<130>发明专利
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
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<212>DNA
<213>人工序列
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<220>
<221>stem_loop
<222>(5)..(132)
<223>
<220>
<221>stem_loop
<222>(5)..(132)
<223>allele
     attenuator
<400>6
gatccaagct tcgactgtcg ccgaatcgga ttttcaagag aaatccgatt cggcgacagt   60
tttttgagct caaaaaactg tcgccgaatc ggatttctct tgaaaatccg attcggcgac  120
agtcgaagct tg                                                      132

Claims (3)

1、一种用于预防烟草花叶病毒病的小干扰RNA的制备，其特征在于：小干扰RNA的核苷酸序列为：
(1)相应于TMV复制酶基因ORF1519-1537、2129-2147片段的19寡核苷酸序列：
siRNA1519：
F：5’-GATCCAAGCTTCGACTTATCAGAGTGGCAGGCTTCAAGAGAGCCTGCCACTCTGATAAGTTTTTTGAGCT-3’
R：5’-CAAAAAACTTATCAGAGTGGCAGGCTCTCTTGAAGCCTGCCACTCTGATAAGTCGAAGCTTG-3’
siRNA2129：
F：5’-GCTGGATCCAAGCTTCGTTCGTAAGCAGATGAGCTCTTCAAGAGAGAGCTCATCTGCTTACGAATTTTTGAGCTCCTG-3’
R：5’-CAGGAGCTCAAAAATTCGTAAGCAGATGAGCTCTCTCTTGAAGAGCTCATCTGCTTACGAACGAAGCTTGGATCCAGC-3’
(2)相应于TMV外壳蛋白编码区域的19寡核苷酸序列：
F：5’-GATCCAAGCTTCGATGTGAAGATGTCAGCGGGTTCAAGAGACCCGCTGACATCTTCACATTTTTTGAGCT-3’
R：5’-CAAAAAATGTGAAGATGTCAGCGGGTCTCTTGAACCCGCTGACATCTTCACATCGAAGCTTG-3’
(3)相应于TMV运动蛋白编码区181-199、435-454、781-799的19核苷酸序列：
siRNA181：
F：5’-GATCCAAGCTTCGCTTATTGATAGTGGATACGTTCAAGAGACGTATCCACTATCAATAAGTTTTTGAGCT-3’
R：5’-CAAAAACTTATTGATAGTGGATACGTCTCTTGAACGTATCCACTATCAATAAGCGAAGCTTG-3’
siRNA435：
F：5’-GATCCAAGCTTCGTGTGAAGATGTCAGCGGGTTTCAAGAGAACCCGCTGACATCTTCACATTTTTGAGCT-3’
R：5’-CAAAAATGTGAAGATGTCAGCGGGTTCTCTTGAAACCCGCTGACATCTTCACACGAAGCTTG-3’
siRNA781-799
F：5’-GATCCAAGCTTCGACTGTCGCCGAATCGGATTTTCAAGAGAAATCCGATTCGGCGACAGTTTTTTGAGCT-3’
R：5’-CAAAAAACTGTCGCCGAATCGGATTTCTCTTGAAAATCCGATTCGGCGACAGTCGAAGCTTG-3’。
2、根据权利要求1所述的一种用于预防烟草花叶病毒病的小干扰RNA的制备，其特征在于：选择烟草花叶病毒复制酶基因、外壳蛋白基因和运动蛋白基因为靶位，按照以下方法设计小干扰RNA：从开放阅读框3’端300bp以后，避开调控识别区，选择以AA开头、G+C含量为30-50％的19nt的寡核苷酸，以TTCAAGAGA为环碱基，Oligo末端增加RNaseIII结合的终止转录位点4-6个TT区，尾部避免G，再在Oligo 3’端加BamH I识别序列，5’端加Sst I识别序列，在BamH I下游加HindIII识别序列，生物合成同源于TMV基因组的小干扰RNA。
3、根据权利要求1所述的一种用于预防烟草花叶病毒病的小干扰RNA的应用，其特征在于：用BamH I和Sst I酶切具有T-DNA整合必需序列和卡那霉素抗性基因的pBI121质粒，与退火后的小干扰RNA连接，构建成小干扰RNA重组表达载体pBI121/siRNA，共3种6个；应用表达载体pBI121/siRNA，用CaCl2转化法转至大肠杆菌TG1进行鉴定与扩繁，从中抽提质粒后，再转入根癌农杆菌EHA105中，得到6株不同的根癌农杆菌EHA105；将根癌农杆菌EHA105接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，28℃培养24h，离心沉淀菌体，去上清，用10mM乙磺酸、10mM氯化镁和150uM乙酰丁香酮的缓冲液悬浮菌体至光密度为OD600＝0.8；将菌丝体悬浮液再添加佐剂和1/100w/w 80目金刚砂，作为生物性保护制剂，高压喷雾器喷施于烟草叶面，有效干扰TMV的侵染。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102286637A (zh) * 2011-07-21 2011-12-21 陕西省烟草研究所 采用反转录环介导等温扩增技术检测烟草病毒的方法
CN103204914A (zh) * 2013-03-05 2013-07-17 清华大学 Mip1基因及其应用
CN103409500A (zh) * 2013-05-10 2013-11-27 安徽农业大学 一种快速鉴定烟草抗性基因的有效方法
CN105767018A (zh) * 2016-04-29 2016-07-20 山东胜伟园林科技有限公司 一种防治橙子病虫害的微生物源农药及其制备方法
CN110488023A (zh) * 2019-08-31 2019-11-22 贵州大学 HrBP1作为筛选防治烟草花叶病毒的药物的靶标及其应用
CN110857438A (zh) * 2018-08-20 2020-03-03 中国烟草总公司黑龙江省公司牡丹江烟草科学研究所 一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102286637A (zh) * 2011-07-21 2011-12-21 陕西省烟草研究所 采用反转录环介导等温扩增技术检测烟草病毒的方法
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CN103204914B (zh) * 2013-03-05 2014-08-06 清华大学 Mip1基因及其应用
CN103409500A (zh) * 2013-05-10 2013-11-27 安徽农业大学 一种快速鉴定烟草抗性基因的有效方法
CN105767018A (zh) * 2016-04-29 2016-07-20 山东胜伟园林科技有限公司 一种防治橙子病虫害的微生物源农药及其制备方法
CN110857438A (zh) * 2018-08-20 2020-03-03 中国烟草总公司黑龙江省公司牡丹江烟草科学研究所 一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用
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