CN113584077A - 沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默载体及其应用和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默载体及其应用和方法，桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；通过利用宿主诱导的基因沉默技术，将含有靶向桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默片段的载体在植物中表达，通过对桑实杯盘菌致病力鉴定，转基因植物能够显著提高对桑实杯盘菌的抗性，因此可以利用此方法提高植物对桑实杯盘菌的抗性，防治桑实杯盘菌的感染。

Description

沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默载体及其应用和 方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1，还涉及该载体的应用和方法。

背景技术

桑树(Morus alba L.)是我国一种重要经济林木，不仅可产桑叶养蚕，获取蚕茧缫丝织绸，还能生产桑椹。桑椹果肉多汁，滋味甘美，富含人体必需的氨基酸、维生素、黄酮及花青素，已被国家卫生部列为“药食同源”的农产品之一，具有很高的食药用价值。在果桑种植中，桑椹极易爆发灾害性病害─“桑椹菌核病”。其中桑椹肥大性菌核病病原菌桑实杯盘菌是对桑椹危害最大、传播范围最广的桑椹病原菌。目前对于桑实杯盘菌的防控仍然主要通过化学农药，而农药残留会对环境以及食品安全产生不利影响，同时由于真菌的遗传特点，真菌产生耐药性的速度较快，从而会使对于该病防控的经济成本增加；近年来，生物防治因其对环境无污染的特点，也被应用在植物病原菌的防控中，但是生防菌由于其成本高、见效慢、难保存以及受环境影响较大的特点，在实际的应用中备受限制。

G蛋白信号通路是真核生物中保守存在的信号通路，对于感知、传递、响应外界的各种信号以及刺激具有十分重要的作用。在真菌中，异三聚体G蛋白通过调控腺苷酸环化酶和磷脂酶活性及离子通道等，从而参与调控营养生长、致病性、产孢及侵染结构形成等生理过程。在没有外界信号刺激的情况下，G蛋白Gα亚基与GDP结合，Gα与Gβγ亚基以异三聚体的形式存在，此时的G蛋白处于非活性状态，当感受到外界信号后，GPCR作为鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor:GEF)和信号分子结合引起构象改变，并与G蛋白的Gα亚基结合，引起构象改变释放GDP结合GTP，形成激活态的Gα亚基，同时与Gβγ异二聚体解离，分别与下游的效应分子结合，将信号传递下去。Gα亚基自身具有GTP酶水解活性将GTP水解为GDP，使Gα与GDP结合，与Gβγ亚基重新结合为非激活的异三聚体状态，最终关闭GPCR信号。而GTP水解的速率能够被G蛋白调控因子RGS提高。G蛋白α亚基作为G蛋白信号的重要组成部分，在真菌生长发育、致病等过程发挥重要的作用。在颖枯壳针孢、黄曲霉、灰霉菌、尖孢镰刀菌等植物病原菌中，敲除Gα亚基基因后均出现真菌的致病力下降，表明Gα亚基对于真菌的致病至关重要。

早在RNA沉默被认同的10年前，Sanford和Johnson就将病原基因片段转入植物或者动物寄主中幵获得对相应病原的抗性，因此提出了parasite/pathogen-derivedresistance(PDR)的概念。随后人们发现，转入双链的病原基因片段能够获得更有效的抗病效果，这就是目前应用最广泛的被称为HD-RNAi(Host-delivered RNAi)或宿主诱导的基因沉默(Host induced gene silencing，HIGS)的策略。其基本原理就是在宿主中表达靶向害虫或者病原菌致病基因的RNAi载体，沉默病原靶标基因，从而使宿主获得对病原的抗性。后来的研究证实了这种做法不仅可以有效地用于抵御病毒入侵，在害虫防治以及对抗细菌和真菌的侵染中也同样有效。

由于传统的育种方式周期较长、对于病原菌的耐受能力差异较大以及对植物抗性提升有限等不足，因此急需一种基于桑实杯盘菌靶序列诱导基因沉默显著提升了转基因烟草对桑实杯盘菌的抗性的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默载体；本发明的目的之二在于提供所述沉默载体在降低桑实杯盘菌致病力中的应用；本发明的目的之三在于提供所述沉默载体在提高植物对桑实杯盘菌抗性中的应用；本发明的目的之四在于提供提高植物对桑实杯盘菌抗性的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默载体，包括表达载体以及插入所述表达载体的含正向沉默片段和反向沉默片段的表达框，所述表达载体为pBin19和pCAMBIA1300，所述正向沉默片段如SEQ ID NO.2所示；所述反向沉默片段如SEQ ID NO.2的反相互补序列所示。

优选的，所述表达载体为pBin19，所述表达框构建方法如下：SEQ ID NO.2所示序列通过KpnⅠ和XhoⅠ连入pHANNIBAL质粒，得到中间载体pHANNIBAL-SiCsGPA1-F，然后将SEQID NO.2所示序列通过XbaⅠ和HindШ反向连入中间载体pHANNIBAL-SiCsGPA1-F，得到载体pHANNIBAL-SiCsGPA1-FR，用SacI和SpeⅠ酶切得到表达框。

优选的，所述表达载体为pCAMBIA1300；所述表达框构建方法如下：将SEQ ID NO.2所示序列通过XhoⅠ和HindШ连接入pSilent-1质粒，得到pSilent-SiCsGPA1-U质粒，将SEQID NO.2所示的反相片段通过KpnⅠ和BglⅡ连入pSilent-CsGPA1-U质粒，得到载体pSilent-SiCsGPA1-UD。

2、所述沉默载体在降低桑实杯盘菌致病力中的应用。

3、所述沉默载体在提高植物对桑实杯盘菌抗性中的应用。

4、一种提高植物对桑实杯盘菌抗性的方法，通过在植物中转化所述沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默载体，使转基因植物内表达沉默片段，获得转基因植物为对桑实杯盘菌抗性的植物，所述桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

优选的，转化沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默载体方法为：将所述沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默载体通过农杆菌介导转化入植物中，筛选阳性植株即可。

优选的，所述农杆菌为LBA4404。

优选的，所述植物为烟草或桑树。

本发明的有益效果在于：本发明公开了沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默载体，通过以桑实杯盘菌CsGPA1的一段特异性序列为靶点，通过宿主诱导基因沉默获得一种高抗桑实杯盘菌的植株，该方法与现有技术相比不需要使用化学农药，转基因植株中的沉默片段针对的是桑实杯盘菌CsGPA1的基因序列并特异性的沉默其表达，对植物本身影响较小；由于载体中使用了35S强启动子，能够大量表达针对于桑实杯盘菌CsGPA1的sRNA具有较好的沉默效果；转基因植株的种子筛选至纯合后可以稳定遗传，产生持续的抗菌效果。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为CsGPA1干扰菌株对真菌致病力影响；

图2为是本发明中卡娜霉素抗性基因在转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果(其中Marker：DL5000 DNA Marker；WT：野生型总DNA为模板进行的扩增)；

图3为转基因烟草抗病性鉴定及表性分析；

图4为接种桑实杯盘菌后叶片病斑面积统计；

图5为接种桑实杯盘菌后叶片中菌丝相对生物量统计；

图6为接种桑实杯盘菌后叶片中真菌CsGPA1的相对表达量。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

本发明通过NCBI检索核盘菌、灰霉菌以及酿酒酵母中G蛋白α亚基基因，通过与本地的桑实杯盘菌基因组数据比对，获得桑实杯盘菌CsGPA1的核苷酸序列。根据基因组的序列设计引物CsGPA1-F/R，具体引物如下：

CsGPA1-F：5’-atgtttgatgtgggtggaca-3’(SEQ ID NO.3)；

CsGPA1-R：5’-ttaaagtatgcccgagtctt-3’(SEQ ID NO.4)；

以桑实杯盘菌cDNA为模板进行PCR扩增，产物经回收后与PMD19-T载体连接，经测序后获得CsGPA1核苷酸序列如SEQ NO.1所示。

实施例2

选取CsGPA1上大概300bp左右一段特异性序列构建靶向桑实杯盘菌CsGPA1的沉默载体，所选沉默片段SiCsGPA1如SEQ ID NO.2所示。

使用如下引物扩增正向沉默片段：

SiCsGPA1-F：5’-ccgctcgaggaagctggaaggatagcagc-3’(SEQ ID NO.5)；

SiCsGPA1-R：5’-cggggtaccaatactggttcgcataaacc-3’(SEQ ID NO.6)；

SiCsGPA1-F1：5’-cgcggatccgaagctggaaggatagcagc-3’(SEQ ID NO.7)；

SiCsGPA1-R1：5’-cccaagcttaatactggttcgcataaacc-3’(SEQ ID NO.8)；

用于宿主诱导基因沉默载体构建的沉默片段SiCsGPA1连入pHANNIBAL质粒XhoⅠ和KpnⅠ酶切位点，获得中间载体pHANNIBAL-SiCsGPA1-F，然后将SiCsGPA1连入pHANNIBAL-SiCsGPA1-F质粒的BamHⅠ和HindШ酶切位点，得到载体pHANNIBAL-SiCsGPA1-FR，随后将含有SiCsGPA1的片段使用SacⅠ和SpeⅠ切下连入pBin19质粒的SacⅠ和XbaⅠ，获得最终的沉默表达载体pBin19-SiCsGPA1。

真菌沉默表达载体构建方法如下：将SEQ ID NO.2所示的正向片段通过XhoⅠ和HindШ连接入pSilent-1质粒，得到pSilent-SiCsGPA1-U质粒，将SEQ ID NO.2所示的反向片段通过KpnⅠ和BglⅡ连入pSilent-SiCsGPA1-U质粒，得到载体pSilent-SiCsGPA1-UD。

使用如下引物扩增：

SiCsGPA1-U：5’-ccgctcgaggaagctggaaggatagcagc-3’(SEQ ID NO.9)

SiCsGPA1-D：5’-cccaagcttaatactggttcgcataaacc-3’(SEQ ID NO.10)

SiCsGPA1-U1：5’-cggggtaccgaagctggaaggatagcagc-3’(SEQ ID NO.11)

SiCsGPA1-D1：5’-ggaagatctaatactggttcgcataaacc-3’(SEQ ID NO.12)

随后将含有SiCsGPA1的片段使用XbaⅠ切下连入pCAMBIA1300质粒的XbaⅠ酶切位点，获得最终的沉默表达载体pCAMBIA1300-SiCsGPA1。

实施例3

将沉默表达载体pCAMBIA1300-SiCsGPA1使用原生质体转化法获得相应的干扰菌株。野生型烟草于25℃，16h光照/22℃8h黑暗培养箱培养40天，随后将同一叶位、大小一致的叶片置于带有浸湿无菌滤纸的培养皿中；选用刚要长满整个平板的菌丝(野生型、空载、三个CsGPA1干扰菌株)，使用黄色枪头在菌丝边缘打孔，将同样大小的菌丝块接种在烟草上置于25℃培养箱，于接种后48小时拍照、取材，利用image J软件计算侵染后叶片的病斑面积，结果如图1所示。

将最终的沉默表达载体pBin19-SiCsGPA1通过化学转化法转入根癌农杆菌LBA4404，通过菌液PCR鉴定阳性转化子，检测引物如下：

Kan-F：5’-ggtgccctgaatgaactgca-3’(SEQ ID NO.13)；

Kan-R：5’-ggtagccaacgctatgtcct-3’(SEQ ID NO.14)。

结果如图2所示。阳性农杆菌通过叶盘转化法转化本氏烟草无菌苗，获得阳性株系(Line1，Line2，Line3，Line4，Line5，Line6，Line7)的种子。

实施例4

选取(Line1，Line2，Line3)的种子萌发后进行后续的侵染实验。将4℃春化24小时的野生型和转基因种子均匀播在高压过的营养土中，待萌发10天后，选取长势一致的幼苗移栽到单独的花盆中，于25℃，16h光照/22℃8h黑暗培养箱培养40天，随后将同一叶位、大小一致的叶片置于带有浸湿无菌滤纸的培养皿中；选用刚要长满整个平板的菌丝，使用蓝色枪头在菌丝边缘打孔，将同样大小的菌丝块接种在烟草上置于25℃培养箱，于接种后48小时拍照、取材，结果如图3所示。结果表明，转基因烟草病斑面积小于野生型烟草。

使用image J软件计算侵染后叶片的病斑面积，结果如图4所示。结果表明，转基因烟草侵染后形成的病斑面积显著低于野生型烟草。使用烟草actin基因定量引物actin-QF/QR和真菌tubulin基因定量引物tubulin-QF/QR，以侵染材料的基因组为模板进行定量PCR反应，计算真菌的相对生物量，结果如图5所示。结果表明，Line1，Line2，Line3株系真菌相对生物量显著低于野生型。以真菌CsGPA1基因定量引物CsGPA1-QF/QR，以真菌tubulin基因为内参，以侵染材料RNA反转的cDNA为模板计算对靶基因CsGPA1的沉默效果，结果如图6所示。结果表明转基因株系靶基因的表达量被显著下调。

NbActin-F：5’-tcacagaagctcctcctaatcca-3’(SEQ ID NO.15)；

NbActin-R：5’-gagggaaagaacagcctgaatg-3’(SEQ ID NO.16)；

Tubulin-F：5’-ttggatttgctcctttgaccag-3’(SEQ ID NO.17)；

Tubulin-R：5’-agcggccatcatgttcttagg-3’(SEQ ID NO.18)；

CsGPA1-QF：5’-gctcatctgaatttatacccacacc-3’(SEQ ID NO.19)；

CsGPA1-QR：5’-cccgagtctttgagagcgtt-3’(SEQ ID NO.120)。

以上结果表明，以桑实杯盘菌SiCsGPA1为靶点，通过宿主诱导基因沉默技术获得的转基因烟草能够显著提高烟草对于桑实杯盘菌的耐受能力，同时本发明还为通过宿主诱导基因沉默技术提高其他物种桑实杯盘菌抗性提供了靶点。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默载体及其应用和方法

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1068

<212> DNA

<213> 桑实杯盘菌(Hyphomycete Morus)

<400> 1

atgggggctt gtatgagctc gaatgtggaa gatacggaac agaggaagag aagtcaaagg 60

attgataaga cgttggagga ggactcgaaa agacttcgac gagaatgcaa aatccttcta 120

ctaggttcgg gcgagagtgg taaatcaacg atagtcaagc agatgaaaat catacaccag 180

aatgggtaca ccgtagacga gttagctttg tatcgattga cgatctataa aaatttgatt 240

gattgtgcaa aagcattagt cggtgcaatg cgacagatgg agatcgagcc aacgaatccg 300

gcaaataagg agtacggttc atttctatta gagtatatcg tcgacccaga tcctcataca 360

ccacttaatc ccagggttgg caccgctgtg gcatcggtat ggaaggatgg atctatggaa 420

cgtttgttag caagacagag tgaattctat ttgatggatt cagcaccata cttcttcgaa 480

gaagctggaa ggatagcagc acacgactac atccctacgg aagccgatgt tttgagggcc 540

agaacaaaga caactggtat ctacgagaca agattcacca tgggctcatt gagtatacac 600

atgtttgatg tgggtggaca aagaagtgag agaaagaagt ggattcattg ctttgagaat 660

gtcacctcaa tcatcttttg tgttgctttg agtgaatatg atcaggttct tttggaggag 720

agtaatcaga accgtatgat ggagagtctg gtcttatttg attcggtcgt gaactcaaga 780

tggtttatgc gaaccagtat tattctattc ctcaataaag ttgatttgtt caaacaaaag 840

cttggtcgat cacctctcga gaattacttc ccggattatt ctggtggaaa tgatctgaat 900

agagcagcaa agtatttact ttggagattc aatcaagtta acagagctca tctgaattta 960

tacccacacc ttacacaagc caccgatact tcgaatattc gactcgtatt cgctgctgtt 1020

aaagagacga tattacaaaa cgctctcaaa gactcgggca tactttaa 1068

<210> 2

<211> 321

<212> DNA

<213> 桑实杯盘菌(Hyphomycete Morus)

<400> 2

gaagctggaa ggatagcagc acacgactac atccctacgg aagccgatgt tttgagggcc 60

agaacaaaga caactggtat ctacgagaca agattcacca tgggctcatt gagtatacac 120

atgtttgatg tgggtggaca aagaagtgag agaaagaagt ggattcattg ctttgagaat 180

gtcacctcaa tcatcttttg tgttgctttg agtgaatatg atcaggttct tttggaggag 240

agtaatcaga accgtatgat ggagagtctg gtcttatttg attcggtcgt gaactcaaga 300

tggtttatgc gaaccagtat t 321

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtttgatg tgggtggaca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttaaagtatg cccgagtctt 20

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgctcgagg aagctggaag gatagcagc 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggggtacca atactggttc gcataaacc 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcggatccg aagctggaag gatagcagc 29

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cccaagctta atactggttc gcataaacc 29

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccgctcgagg aagctggaag gatagcagc 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cccaagctta atactggttc gcataaacc 29

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cggggtaccg aagctggaag gatagcagc 29

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggaagatcta atactggttc gcataaacc 29

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggtgccctga atgaactgca 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggtagccaac gctatgtcct 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcacagaagc tcctcctaat cca 23

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gagggaaaga acagcctgaa tg 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttggatttgc tcctttgacc ag 22

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agcggccatc atgttcttag g 21

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gctcatctga atttataccc acacc 25

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cccgagtctt tgagagcgtt 20

Claims (9)

1.一种沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默载体，包括表达载体以及插入所述表达载体的含正向沉默片段和反向沉默片段的表达框，其特征在于：所述表达载体为pBin19和pCAMBIA1300，所述正向沉默片段如SEQ ID NO.2所示；所述反向沉默片段如SEQID NO.2的反相互补序列所示。

2.根据权利要求1所述沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默载体，其特征在于：所述表达载体为pBin19，所述表达框构建方法如下：SEQ ID NO.2所示序列通过KpnⅠ和XhoⅠ连入pHANNIBAL质粒，得到中间载体pHANNIBAL-SiCsGPA1-F，然后将SEQ ID NO.2所示序列通过XbaⅠ和HindIII反向连入中间载体pHANNIBAL-SiCsGPA1-F，得到载体pHANNIBAL-SiCsGPA1-FR，用SacI和SpeⅠ酶切得到表达框。

3.根据权利要求1所述沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默载体，其特征在于：所述表达载体为pCAMBIA1300；所述表达框构建方法如下：将SEQ ID NO.2所示序列通过XhoⅠ和HindIII连接入pSilent-1质粒，得到pSilent-SiCsGPA1-U质粒，将SEQ ID NO.2所示的反相片段通过KpnⅠ和BglⅡ连入pSilent-CsGPA1-U质粒，得到载体pSilent-SiCsGPA1-UD。

4.权利要求1或2所述沉默载体在降低桑实杯盘菌致病力中的应用。

5.权利要求1或3所述沉默载体在提高植物对桑实杯盘菌抗性中的应用。

6.一种提高植物对桑实杯盘菌抗性的方法，其特征在于：通过在植物中转化权利要求1或3所述沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默载体，使转基因植物内表达沉默片段，获得转基因植物为对桑实杯盘菌抗性的植物，所述桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：转化沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默载体方法为：将所述沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默载体通过农杆菌介导转化入植物中，筛选阳性植株即可。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述农杆菌为LBA4404。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述植物为烟草或桑树。

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