CN102174569B - 一种利用水稻作为生物反应器的蛋白渔药及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程，具体的说是一种利用水稻作为生物反应器的蛋白渔药及其制备方法和应用。以中国明对虾血细胞总RNA的反转录产物为模板，采用引物PF1和PR1进行PCR扩增，SEQ ID No.1所示的扩增产物经修饰后转入水稻中，携带扩增产物的转基因再生苗种植后的米糠即为渔药。将上述制备所得渔药即携带转基因抗菌肽的再生苗种植后所得的米糠加入饲料中投喂给鱼，其中米糠的加入量为饲料质量的15-20％，可以有效治疗鱼类的细菌感染病害。

Description

一种利用水稻作为生物反应器的蛋白渔药及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程，具体的说是一种利用水稻作为生物反应器的蛋白渔药及其制备方法和应用。

背景技术

利用高等植物反应器表达功能蛋白进而开发渔药，具有极大创新和实际意义。与原核生物相比，发酵罐需要电能，而植物直接利用太阳能；植物细胞具有完整的真核细胞表达系统，能对表达的外源蛋白进行翻译后加工，使表达产物具有生物活性；如果选择可直接食用的植物生产功能性产品，还可省去费用昂贵的纯化过程；与转基因动物相比，植物可以大田栽培，产量高，繁殖成本低，更适合规模化生产；植物本身不含有潜在的导致人类疾病的微生物，对人类十分安全；转基因植物也可有效避免动物生物反应器可能存在的伦理学问题。对于生产具有强烈抗菌抑菌活性的抗菌肽类物质，使用植物生物反应器可以避免产物本身对原核和真核工程菌的裂解，从而无需增加保护性基团即可直接表达，保证了产物活性，减少了工艺步骤，降低了生产成本，从而表现出独特优势。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用水稻作为生物反应器的蛋白渔药及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种利用水稻作为生物反应器的蛋白渔药：以中国明对虾血细胞总RNA的反转录产物为模板，采用引物PF1和PR1进行PCR扩增，SEQID No.1所示的扩增产物经修饰后转入水稻中，携带扩增产物的转基因再生苗种植后的米糠即为渔药。

将转入水稻中的SEQ ID No.1所示的扩增产物按如下步骤修饰后再转入水稻中；

1)通过T4连接酶将SEQ ID No.1所示的扩增产物连接入pMD 18-T载体上待用；

2)用SalI和XbaI分别双酶切携带penaeidin(SEQ ID No.1)的上述T-载体和pBluscript空载体，得到连接有SEQ ID No.1所示的酶切片段和线性化的pBluscript空载体，待用；

3)通过T4连接酶将步骤2)连接有SEQ ID No.1所示的酶切片段连接入到用SalI和XbaI分别双酶切的pBluscript空载体中，在连接后pBluscript-penaeidin质粒中SEQ ID No.1上游引入KpnI酶切位点，待用；

4)用KpnI和XbaI分别酶切上述步骤3)引入酶切位点的pBluscript-penaeidin质粒和已经连接有35S启动子和终止子的植物表达载体pCAMBIA1305.2，得到连接有SEQ ID No.1所示的酶切片段和线性化的pCAMBIA1305.2空载体，待用；

5)通过T 4连接酶将步骤4)酶切后携带SEQ ID No.1的片段连接到步骤4)酶切后植物表达载体pCAMBIA1305.2，得到植物表达载体pCAMBIA1305-penaeidin5-3。

所述引物PF1和PR1分别为：PF1：agcctcacctgcagagaccg PR1：tgcacttacatcccacat。

利用水稻作为生物反应器的蛋白渔药的制备方法：以中国明对虾血细胞总RNA的反转录产物为模板，采用引物PF1和PR1进行PCR扩增，SEQ ID No.1所示的扩增产物经修饰后通过农杆菌介导法转入水稻中，携带扩增产物的转基因再生苗的米糠即为渔药；所述引物PF1和PR1分别为：PF1：agcctcacctgcagagaccg PR1：tgcacttacatcccacat。

将转入水稻中的SEQ ID No.1所示的扩增产物按如下步骤修饰后再转入水稻中；

1)通过T4连接酶将SEQ ID No.1所示的扩增产物连接入pMD 18-T载体上待用；

2)用SalI和XbaI分别双酶切携带penaeidin的上述T-载体和pBluscript空载体，得到连接有SEQ ID No.1所示的酶切片段和线性化的pBluscript空载体，待用；

3)通过T4连接酶将步骤2)连接有SEQ ID No.1所示的酶切片段连接入到用SalI和XbaI分别双酶切的pBluscript空载体中，在连接后pBluscript-penaeidin质粒中SEQ ID No.1上游引入KpnI酶切位点，待用；

4)用KpnI和XbaI分别酶切上述步骤3)引入酶切位点的pBluscript-penaeidin质粒和已经连接有35S启动子和终止子的植物表达载体pCAMBIA1305.2，得到连接有SEQ ID No.1所示的酶切片段和线性化的pCAMBIA1305.2空载体，待用；

5)通过T 4连接酶将步骤4)酶切后携带SEQ ID No.1的片段连接到步骤4)酶切后植物表达载体pCAMBIA1305.2，得到植物表达载体pCAMBIA1305-penaeidin5-3。

利用水稻作为生物反应器的蛋白渔药的应用：将上述制备所得渔药即携带转基因抗菌肽的再生苗种植后所得的米糠加入饲料中投喂给鱼，其中米糠的加入量为饲料质量的15-20％。所述渔药对养殖大菱鲆的病害具有防治作用。

本发明所具有的优点：

1、节约能源。转基因水稻一经培育成功即可扩大种植规模，不需要昂贵发酵设备，因此更加节约能源。

2、安全性高。水稻本身即是一种粮食作物，与大肠杆菌和毕赤酵母等表达载体相比，对人畜具有更大的安全性。

3、提高农作物附加值。米糠本身是饲料工业的重要原料，经过本发明赋予其抗菌抑菌效果，有助于提高其附加值。

4、本发明有一举双得的特点。本发明涉及的转基因水稻不仅能够提高饲料的防病治病效果，而且转基因水稻本身的抗病性有所提高，更加易于种植。

附图说明

图1为本发明实施例提供的中国明对虾抗菌肽的RT-PCR产物和以基因组DNA为模板获得的PCR产物(1：Mark；2：RT-PCR产物；3：以基因组DNA为模板获得的PCR产物)。

图2为本发明实施例提供的转基因水稻的PCR检测图。

图3为本发明实施例提供的penaeidin5-3转基因T1代小苗在大田中种植图。

图4本发明实施例提供的转基因后代的RT-PCR分析图。

具体实施方式

实施例1

1.抗菌肽基因的克隆

取中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)作为材料，采用Trizol法提取血细胞总RNA，以oligo(dT)18作为引物对总RNA进行反转录。根据GenBank中收录的抗菌肽序列合成下列引物PF1：agcctcacctgcagagaccg PR1：tgcacttacatcccacat。以反转录产物为模板，用PF1和PR1进行PCR扩增获得抗菌肽基因的cDNA序列，扩增程序为：94℃变性2min；94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸30s，5个循环；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。

将上述RT-PCR产物通过凝胶电泳，电泳条件为琼脂糖凝胶浓度1％，电压100V，电泳40min。得到大小接近500bp的条带，即为penaeidin5-3，参见SEQ ID No.1所示的碱基序列(参见图1)，克隆后测序。测序的结果在GenBank进行序列比对的结果显示，该序列与GenBank中收录的中国明对虾抗菌肽序列AY669323有98％的同源性，确定为中国明对虾一种抗菌肽cDNA。该基因命名为penaeidin5-3，已在GenBank登陆，登录号为DQ308407。同时将PCR产物经过纯化后克隆到pMD 18-T载体(TaKaRa)中进行序列测定。

序列表1

ttccttcccgtgtccgtc atgcgt ctc gtg gtc tgc ctg gtc ttc ttg gcc tcc ttc gcc ctg gtc tgc cga ggc caa ggg tac aag agt ggt cac aca ggc cca tac ccc aga cca ctc tat gga tcc cga cct att ggc ctt cgt cca atc act cgt cca gac cct agt tgc gct gga tgc cgc att ctt acc tta gat gat gct att gct tgc tgc agg cgg tta gga cgc tgt tgt tct gca tta aag gga tag actggctgatggagaagacaacgaaatcctggctttacagcgtgttaattggactcatagatgaagagacggcgaccttgattttgaaccgtatttttccgttccattttcttacttttccttctggaaaggatgtaggtatttggtctatactggcaaggaagcgccaaagatcttccag

(a)序列特征：

●长度：439bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：双链DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)

(f)特异性名称：penaeidin5-3

根据上述cDNA序列编码的蛋白序列包含79个氨基酸。该蛋白序列包含一个保守性很强的N端信号肽(MRLVVCLVFLASFALVCRG)。成熟蛋白具有抗菌肽的典型特征，即N端富含脯氨酸(P)和甘氨酸(G)，C端含有6个半胱氨酸(C)，可以形成3个二硫键。该抗菌肽成熟蛋白序列的分子量为6445.56Da，等电点为pI9.34。该抗菌肽与其它抗菌肽进行多序列比对的结果显示该抗菌肽与GenBank中收录的中国明对虾抗菌肽penaeidin(AY669323)、pen5-1(DQ153253)分别有98.7％和97.5％的同源性，与其它抗菌肽的同源性都在50～65％之间。经过酵母重组表达验证，该抗菌肽对水产病原菌具有很强的抑菌效果。

2.携带抗菌肽penaeidin5-3的植物表达载体的构建

1)通过T4连接酶将SEQ ID No.1所示的扩增产物连接入pMD 18-T载体上待用；

2)用SalI和XbaI分别双酶切携带penaeidin(SEQ ID No.1)的上述T-载体和pBluscript空载体，得到连接有SEQ ID No.1所示的酶切片段和线性化的pBluscript空载体，待用；

3)通过T4连接酶将步骤2)连接有SEQ ID No.1所示的酶切片段连接入到用Sal I和Xba I分别双酶切的pBluscript空载体中，在连接后pBluscript-penaeidin质粒中SEQ ID No.1上游引入KpnI酶切位点，待用；

4)用KpnI和Xba I分别酶切上述步骤3)引入酶切位点的pBluscript-penaeidin质粒和已经连接有35S启动子和终止子的植物表达载体pCAMBIA1305.2，得到连接有SEQ ID No.1所示的酶切片段和线性化的pCAMBIA1305.2空载体，待用；

5)通过T 4连接酶将步骤4)酶切后携带SEQ ID No.1的片段连接到步骤4)酶切后植物表达载体pCAMBIA1305.2，得到植物表达载体pCAMBIA1305-penaeidin5-3，，用于植物遗传转化。。

3.水稻转基因及检测

通过高效农杆菌介导法将对虾抗菌肽基因pCAMBIA-penaeidin5-3转入水稻中，获得携带抗菌肽基因的转基因再生苗，将再生苗种植所得米糠即作为渔药。将上述再生苗经过PCR鉴定，鉴定引物为P5F：GGTCATGCGCCTCGTGGTC；P5R：AGGTCGCCGTCTCTTCATCTAT。以转基因水稻基因组DNA为模板，用P5F和P5R进行PCR扩增，扩增程序为：94℃变性2mi n；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖，80V电压下电泳40min检查PCR结果，阳性植株可见310bp的扩增条带(参见图2)，结果显示对虾抗菌肽基因已经整合到植物基因组中。而后将上述再生苗经过对自交T1代(即正常的水稻种植，结子和种植)植株的选育，获得了携带抗菌肽的转基因纯合株系，即验证penaeidin5-3在转基因水稻中的遗传稳定性。验证方法为PCR法，条件同上。

具体为将上述再生苗在2008年经过对自交T1代植株的选育(参见图3)，获得了携带抗菌肽的转基因纯合株系。2009年继续验证了penaeidin5-3在转基因水稻中的遗传稳定性。对2千多株转基因水稻后代进行了PCR验证，证明多数penaeidin5-3能够在水稻中稳定遗传。验证方法为PCR法，条件同上。对转基因后代提取其RNA，反转录为cDNA，用引物P5F和P5R进行RT-PCR分析，条件同上述PCR反应，表明对虾素已经在水稻中表达(参见图4)。

所述高效农杆菌介导法按照2003年6月江西农业大学学报第25卷第3期，农杆菌介导籼稻Xa21基因的转化及其遗传研究进行操作或浙江大学博士论文，刘梅，利用生防木霉基因提高水稻抗病性研究。

应用例

将上述实施例制备所得渔药即携带转基因抗菌肽的再生苗种植后所得的米糠加入饲料中投喂给鱼。

实验用大菱鲆从养殖场购得，体长10-15cm，体重100-150g的体制健壮的大菱鲆，放在120×80×80的水族箱中暂养一周。每缸30尾，每组设3个平行。每天分两次投喂饲料，日换水量为水体的1/2，实验水温28±2℃。

特异性饲料的制备：将商用通威集团生产的大菱鲆饲料粉碎以后，添加饲料重量百分比为分别为0％，5％，10％，15％，20％的转基因抗菌肽米糠，重新制备成颗粒饲料。

攻毒：取迟钝爱德华氏菌单菌落制成菌悬液，按每尾大菱鲆(平均体重500克/尾)0.05mL的剂量，注射到大菱鲆背部肌肉，进行感染。另取与实验组数目相同的健康大菱鲆按照0.05mL/尾的剂量在相同部位注射无菌的1.5％NaCl溶液作为对照组。注射后，带菌组大部分鱼均出现腹水病症状，对照组正常。

抗菌肽饲料的防治效果：对感染组鱼分别饲喂不同含量抗菌肽米糠(0，5％，10％，15％，20％)饲料，观察记录各组死亡情况。

结果参见表1：在最初的15天内，对照组平均死亡率为92.3％，实验组死亡率分别为(93.3％，92.3％，35.7％和32.3％)，可见抗菌肽饲料对大菱鲆迟钝爱德华氏菌感染起到了防治作用。但是转基因米糠需要达到一定的含量，10％以下含量几乎不能起到防治作用，15％和20％含量有明显的治疗效果，而且2组之间差别不大，可见15％含量已经达到预期效果。

表1抗菌肽转基因水稻米糠对大菱鲆细菌感染的保护效果

注：对照不含转基因米糠，组1含5％转基因米糠，组2含10％转基因米糠，组3含15％转基因米糠，组4含20％转基因米糠。

Claims (2)

1.一种利用水稻作为生物反应器的蛋白渔药，其特征在于：以中国明对虾血细胞总RNA的反转录产物为模板，采用引物PF1和PR1进行PCR扩增，SEQ ID No.1所示的扩增产物经修饰后转入水稻中，携带扩增产物的转基因再生苗种植后的米糠即为渔药；

将转入水稻中的SEQ ID No.1所示的扩增产物按如下步骤修饰后再转入水稻中；

1)通过T4连接酶将SEQ ID No.1所示的扩增产物连接入pMD18-T载体上待用；

2)用SalI和XbaI双酶切携带SEQ ID No.1所示序列的上述pMD18-T载体和pBluscript空载体，得到连接有SEQ ID No.1所示扩增产物的酶切片段和线性化的pBluscript空载体，待用；

3)通过T4连接酶将步骤2)连接有SEQ ID No.1所示扩增产物的酶切片段连接到用SalI和XbaI双酶切的pBluscript空载体中，在连接后pBluscript-penaeidin质粒中SEQ ID No.1上游引入KpnI酶切位点，待用；

4)用KpnI和XbaI分别酶切上述步骤3)引入酶切位点的pBluscript-penaeidin质粒和已经连接有35S启动子和终止子的植物表达载体pCAMBIA1305.2，得到连接有SEQ ID No.1所示扩增产物的酶切片段和线性化的pCAMBIA1305.2空载体，待用；

5)通过T4连接酶将步骤4)酶切后携带SEQ ID No.1所示序列的片段连接到步骤4)酶切后植物表达载体pCAMBIA1305.2，得到植物表达载体pCAMBIA1305-penaeidin5-3；

所述引物PF1和PR1分别为：PF1：agcctcacctgcagagaccg PR1：tgcacttacatcccacat。

2.一种权利要求1所述的利用水稻作为生物反应器的蛋白渔药的制备方法，其特征在于：以中国明对虾血细胞总RNA的反转录产物为模板，采用引物PF1和PR1进行PCR扩增，SEQ ID No.1所示的扩增产物经修饰后通过农杆菌介导法转入水稻中，携带扩增产物的转基因再生苗的米糠即为渔药；所述引物PF1和PR1分别为：PF1：agcctcacctgcagagaccg PR1：tgcacttacatcccacat；

将转入水稻中的SEQ ID No.1所示的扩增产物按如下步骤修饰后再转入水稻中；

1)通过T4连接酶将SEQ ID No.1所示的扩增产物连接入pMD18-T载体上待用；

2)用SalI和XbaI双酶切携带SEQ ID No.1所示序列的上述pMD18-T载体和pBluscript空载体，得到连接有SEQ ID No.1所示扩增产物的酶切片段和线性化的pBluscript空载体，待用；

3)通过T4连接酶将步骤2)连接有SEQ ID No.1所示扩增产物的酶切片段连接到用SalI和XbaI双酶切的pBluscript空载体中，在连接后pBluscript-penaeidin质粒中SEQ ID No.1上游引入KpnI酶切位点，待用；

4)用KpnI和XbaI分别酶切上述步骤3)引入酶切位点的pBluscript-penaeidin质粒和已经连接有35S启动子和终止子的植物表达载体pCAMBIA1305.2，得到连接有SEQ ID No.1所示扩增产物的酶切片段和线性化的pCAMBIA1305.2空载体，待用；

5)通过T4连接酶将步骤4)酶切后携带SEQ ID No.1所示序列的片段连接到步骤4)酶切后植物表达载体pCAMBIA1305.2，得到植物表达载体pCAMBIA1305-penaeidin5-3。

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