CN108651388A - 一种培育不飞行瓢虫的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种培育不飞行瓢虫的方法，采用基因干扰的方法，干扰瓢虫翅发育关键基因vestigial或ultrabithorax的表达，培育不飞行瓢虫，具体包括注射dsRNA、饲喂dsRNA/纳米载体或将dsRNA/纳米载体/表面活性助剂浸泡、喷雾或滴加到瓢虫体表三种方法。本发明通过三种潜在的基因干扰的方法，培育不飞行瓢虫，该方法高效稳定，能够彻底解决人工释放天敌瓢虫在防治区域内难以定殖的难题，具有重要的理论和实际意义；通过将饲喂法和体壁渗透法应用到基因干扰中，彻底改变了传统方法耗时耗力的现状，大幅度提升其效率和成功率，降低成本和操作难度；该方法社会效益和经济价值明显，无潜在生态风险。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种培育不飞行瓢虫的方法。
背景技术
瓢虫种类繁多，在昆虫分类系统中隶属于鞘翅目多食亚目扁甲总科。目前，已知的瓢虫有500属5000种左右，其中，捕食性瓢虫约占瓢虫种类的80％，以捕食介壳虫、蚜虫、粉虱、叶螨以及其它节肢动物为主，多为农林害虫的重要天敌，其中，异色瓢虫(Harmoniaaxyridis)是受到广泛关注的捕食性瓢虫之一，与其他捕食性瓢虫相比，其具有易饲养、捕食能力强、取食量大等特点，较强的环境适应性使得异色瓢虫成为捕食蚜虫的优势性天敌。
虽然瓢虫在防治蚜虫等有害生物方面有着诸多优势，但是在田间释放的实际操作过程中往往面临着许多问题，如释放时期、释放次数和释放量等，但是其中最重要的是如何保证人工释放的瓢虫品种在防治区域内不飞走和成功定殖。瓢虫成虫一般具有较强的飞行能力，能够远距离迁移，通过筛选飞行能力弱的品种可以从根源上解决这一问题。目前，法国学者已经从异色瓢虫的自然种群中筛选出了飞行能力低下的瓢虫和不能飞行的雌雄成虫，用于温室等封闭环境的害虫防治工作，但是通过传代筛选的方式往往需要十几代才能获得稳定品系，且存活力和繁殖力都会出现大幅度的下降，在自然环境中容易被野生型同化，不适合大田释放。随着遗传操作和表观调控等技术的发展，在幼虫阶段，通过调节瓢虫翅发育的关键基因，以获得无飞行能力的翅缺陷成虫已经成为可能。
RNA干扰(RNA interference，RNA干扰)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA分子)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，这些特殊设计的外源dsRNA分子，能够特异、高效且持久地降低特定基因的表达，对于研究未知基因功能、调控昆虫的发育和行为和保护植物免受病毒侵害具有重要意义。RNA干扰已作为一种重要手段，被广泛应用于各类基因功能鉴定、功能基因表达调控领域，同时，由于dsRNA分子高度的特异性、释放后易降解等特性，使其成为一种专门靶向害虫的、对非靶标生物安全的遗传学控制策略。
近年来，纳米科技迅猛发展，在农业领域应用迅速发展，其中之一就是利用纳米载体的靶向传输与控释功能，递送核酸药物(DNA或RNA)至昆虫体内，打破昆虫体内的器官基底膜和细胞膜屏障和肠道围食膜屏障，促进细胞吸收外源核酸分子，提高外源核酸分子的作用效率。目前有潜在的注射法，饲喂法，以及体壁渗透法三种办法实现基因干扰(RNAi)；其中，借助纳米载体递送dsRNA分子能够大幅度提升对昆虫基因的干扰效率。
利用RNA干扰技术与纳米载体相结合的方法，培育出不飞行瓢虫，可以解决人工释放的天敌昆虫在防治区域内的定殖难题、推动天敌昆虫在农业防治工作中应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种培育不飞行瓢虫的方法。
本发明采用如下技术方案：
一种培育不飞行瓢虫的方法，采用基因干扰的方法，干扰瓢虫翅发育关键基因vestigial或ultrabithorax的表达，培育不飞行瓢虫。
在上述技术方案中，所述基因干扰的方法为注射dsRNA，具体包括以下步骤：
S1、利用dsRNA合成试剂盒合成瓢虫vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA；
S2、对瓢虫幼虫注射vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA。
优选地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA的注射量分别为10-100ng；所述瓢虫幼虫为4龄第1天的幼虫。
具体地，所述瓢虫为异色瓢虫时，所述注射位置为腹部第三节与第四节节间膜处。
在上述技术方案中，所述基因干扰的方法为饲喂dsRNA/纳米载体，具体包括以下步骤：
S1、利用dsRNA合成试剂盒合成瓢虫vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA；
S2、将vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA与纳米载体溶液混合得到dsRNA/纳米载体，随后将dsRNA/纳米载体与人工饲料混匀得到瓢虫饲料；
S3、采用瓢虫饲料饲喂瓢虫幼虫。
在混合过程中，所述vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA与纳米载体通过静电作用、氢键和范德华力的作用结合成为稳定的dsRNA/纳米载体分子复合体；在纳米载体的作用下，dsRNA分子穿透昆虫肠道围食膜和肠细胞膜的能力大大提升，干扰效率也随之提高。
在本发明中，所述人工饲料可由市售的猪肝、酵母、蔗糖和蜂蜜按质量比10：3：4：4的比例混合配制而成。
优选地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA与纳米载体溶液的电荷比为1:8-8:1，优选为1:1。
优选地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述dsRNA/纳米载体与所述人工饲料的体积比为1:5-1:20，优选为1:10。
优选地，在上述技术方案中，步骤S3中，所述饲喂阶段为瓢虫的整个幼虫阶段。
在上述技术方案中，所述基因干扰的方法为将dsRNA/纳米载体/表面活性助剂浸泡、喷雾或滴加到瓢虫体表，具体包括以下步骤：
S1、利用dsRNA合成试剂盒合成瓢虫vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA；
S2、将vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA，与纳米载体溶液和表面活性助剂混合，得到复合体药液；
S3、将复合体药液浸泡、喷雾或滴加到瓢虫体表。
在混合过程中，所述vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA与纳米载体通过静电作用、氢键和范德华力的作用结合成为稳定的dsRNA/纳米载体分子复合体；同时，借助表面活性助剂发挥的浸润和除脂作用，溶化瓢虫体表的蜡质层，降低表皮抗御性，使所得到的复合体药液液滴易于吸附至瓢虫体表并穿透瓢虫体壁进入体腔、组织和细胞内，从而高效干扰靶标基因的表达。
优选地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA与纳米载体溶液的电荷比为1:8-8:1，优选为1:1。
优选地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述表面活性助剂在所述复合体药液中所占的体积比例为4.5-18％，优选为10％。
在本发明中，所述vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA为能够特异性降解同源mRNA(信使RNA)的双链RNA分子，不限于其片段大小和二级结构种类。
在上述技术方案中，所述纳米载体为内部具有空腔结构，且表面携带正电荷的纳米载体。
优选地，在上述技术方案中，所述纳米载体为具有高密度亲水性官能团的纳米载体。
在本发明中，所述纳米载体的内部空腔结构和高密度官能团结构有利于vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA分子的装载，形成稳定复合体，同时保护dsRNA分子生物大分子免受生物体内酸、碱环境的损害和酶的降解；所述纳米载体的递送作用能促进瓢虫肠道内的dsRNA穿透肠壁细胞进入体腔、组织和细胞，同时也能促进体表均匀展布的dsRNA分子穿透昆虫体壁进入体腔、组织和细胞。
在本发明中，所述表面活性助剂可为各类表面活性剂或油剂的混合物。所述表面活性助剂一方面可以破坏瓢虫的防御蜡质层，增加药液的渗透力；另一方面可以降低水相药液的表面张力，在喷洒和滴加时，更易于瓢虫体壁的吸附和展布，扩大其受药面积。
本发明的优点：
(1)本发明通过三种潜在的基因干扰的方法，将vestigial dsRNA和ultrabithorax dsRNA导入瓢虫体内，影响瓢虫翅发育，培育了不飞行瓢虫，所述方法高效且稳定，能够彻底解决人工释放天敌瓢虫在防治区域内难以定殖的难题，对推广应用天敌瓢虫防治害虫具有重要的理论和实际意义；
(2)本发明将传统纳米材料载体技术和基因干扰技术等最新遗传操控技术相结合，应用于瓢虫不飞行品系的培育，意义重大；
(3)本发明通过将饲喂法和体壁渗透法应用到基因干扰中，彻底改变了传统多代连续筛选的耗时且耗力的现状，大幅度提升基因干扰的效率和基因编辑的成功率，同时降低了经济成本，简化了操作难度，有效保证了不飞行瓢虫品系的大批量培育；
(4)本发明的不飞行天敌瓢虫的培育研发和应用，社会效益和经济价值明显，同时，本发明的培育方法的应用，所释放的瓢虫只是短期改变基因表达水平，不改变瓢虫的遗传结构，和野生瓢虫杂交后即丧失基因干扰能力，恢复为野生型，不造成潜在的生态风险。
附图说明
图1为本发明实施例1中瓢虫的表型示意图，其中，第一行图为野生型瓢虫，第二行图为vestigial基因干扰后的瓢虫表型；图中第一列为瓢虫背面观，第二列为前翅，第三列为后翅；
图2为本发明实施例2中瓢虫的表型示意图，其中，第一行图为野生型瓢虫，第二行图为vestigial基因干扰后的瓢虫表型；图中第一列为瓢虫背面观，第二列为瓢虫腹面观，第三列为后翅；
图3为本发明实施例3中瓢虫的表型示意图，其中，第一行图为野生型瓢虫，第二行图为vestigial基因干扰后的瓢虫表型；图中第一列为瓢虫背面观，第二列为前翅，第三列为后翅。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
实施例1
本发明实施例提供了一种培育不飞行瓢虫的方法，具体如下：
1、原料
dsRNA：针对异色瓢虫翅发育关键基因进行干扰的vestigial dsRNA。
按照Promega提供的体外合成dsRNA标准方法，采用该公司提供的T7RiboMAXExpress RNAi System试剂盒合成dsRNA，dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2、方法
培育不飞行瓢虫的方法，具体步骤包括：
(1)将dsRNA配制成浓度为50.0ng/ul的dsRNA溶液；
(2)取4龄第1天的幼虫，将1ul上述dsRNA溶液从其腹部第三节与第四节节间膜处进行注射；
(3)用蚜虫或人工饲料饲喂幼虫直至其羽化，得到不飞行异色瓢虫，如图1所示。
实施例2
本发明实施例提供了一种培育不飞行瓢虫的方法，具体如下：
1、原料
(1)纳米载体：本发明实施例以公开号为CN103172776A公开的荧光纳米载体分子为例，载体内部的荧光核具有高荧光量子产率，良好的光、热和化学稳定性，有利于在生物体内示踪，各个侧链之间形成很好的空腔结构以及带有大量特异性官能团有利于dsRNA分子的结合和组装，并形成稳定dsRNA/纳米载体复合体，整个复合体具备良好昆虫细胞亲和性，有利于dsRNA分子快速进入细胞靶向靶标基因。
(2)dsRNA：针对异色瓢虫翅发育关键基因进行干扰的vestigial dsRNA。
按照Promega提供的体外合成dsRNA标准方法，采用该公司提供的T7RiboMAXExpress RNAi System试剂盒合成dsRNA，dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
(3)无菌水：一般市售产品。
(4)人工饲料：由猪肝、酵母、蔗糖和蜂蜜按质量比10：3：4：4的比例配制而成。
2、方法
培育不飞行瓢虫的方法，具体步骤包括：
(1)采用无菌水将纳米载体配制成浓度为1.0mg/mL的纳米载体溶液；
(2)将dsRNA配制成浓度为1ug/ul的dsRNA溶液；
(3)取1.5ul的纳米载体溶液与1.0ul的dsRNA溶液于离心管中混合，通过涡旋振荡使两种物质充分接触，两种分子通过静电作用、氢键和范德华力作用下结合成为稳定的dsRNA/纳米载体分子复合体药液；
(4)将上述dsRNA/纳米载体分子复合体药液与人工饲料按1:10的比例混合，得到瓢虫饲料；
(5)采用瓢虫饲料饲喂异色瓢虫幼虫至其羽化，获得不飞行异色瓢虫，如图2所示。
实施例3
本发明实施例提供了一种培育不飞行瓢虫的方法，具体如下：
1、原料
(1)纳米载体：本发明实施例以公开号为CN103172776A公开的荧光纳米载体分子为例，载体内部的荧光核具有高荧光量子产率，良好的光、热和化学稳定性，有利于在生物体内示踪，各个侧链之间形成很好的空腔结构以及带有大量特异性官能团有利于dsRNA分子的结合和组装，并形成稳定dsRNA/纳米载体复合体，整个复合体具备良好昆虫细胞亲和性，有利于dsRNA分子快速进入细胞靶向靶标基因。
(2)dsRNA：针对异色瓢虫翅发育关键基因进行干扰的vestigial dsRNA。
按照Promega提供的体外合成dsRNA标准方法，采用该公司提供的T7RiboMAXExpress RNAi System试剂盒合成dsRNA，dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
(3)表面活性助剂：市售可得的金鱼洗涤剂和Trion X-100的1：1混合溶液。
2、方法
培育不飞行瓢虫的方法，具体步骤包括：
(1)采用无菌水将纳米载体配制成浓度为1.0mg/mL的纳米载体溶液；
(2)将dsRNA配制成浓度为1ug/ul的dsRNA溶液；
(3)取1.5ul的纳米载体溶液与1.0ul的dsRNA溶液于离心管中混合，通过涡旋振荡使两种物质充分接触，两种分子通过静电作用、氢键和范德华力作用下结合成为稳定的dsRNA/纳米载体分子复合体药液；
(4)按体积比加入10％的表面活性助剂，用枪头吹打混合至均匀，以便降低后续药液液滴的表面张力，形成小体积的药液液滴，滴加至3龄异色瓢虫幼虫的体表；
(5)用蚜虫或人工饲料饲喂幼虫至其羽化，获得不飞行异色瓢虫，如图3所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种培育不飞行瓢虫的方法
<130> KHP181110837.0
<141> 2018-02-28
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agttggccga tacatattgc gctcgtgagc cactgggttc ttgggaatcc tcgtcgtcac 60
cttggtgatg atcgtctgtg ctactccttc cgtgcaaact gcaatcttct tctttgccta 120
tcctcagcgg gctggagggt gatactccgc ccgtcgaact gaccgaacct ccagaactat 180
gtgctgaccc ttgaaggtat atactgtgac ccgccagcgg gtgagtttct gcgagtccac 240
cgatcgtagc accgacgcta ctcgtcgcac tcgtctgtgg taaggagtgt gcttcttgta 300
gtctttgtac attgaatctt tcatattgat gtgtggcagc aaaaggtgaa ctaaaaggtc 360
cggtcctggg taccggatgg gctgaaacag gtggagcagc 400
<210> 2
<211> 449
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctggggtac atgctgaagg tcgcactgga cctgccaagc tgttggccaa atttgcacca 60
ccaccggtgg cagcgctttg ccaaacgtcc tttacagctt gtgctgcaac tacagaagcg 120
tatccgtttt ggtctgcgtt tcctttagag cagtctggtt tcgtgtttcc ggaactgctg 180
taggaatttt gttggctttc tgatgaagag tatagtttac aggctgctgc tacagaagcg 240
tcgtaaggag aatcttgcgg aggtctggct tggtgcaggg aatggtgatg atggtgctgc 300
gtggaggcgt acggtgacat ccccagactt agcgggaaag atctgtaagc ggctgcagcc 360
gctgcactct gatcatggtg atgggcccct gttacagacc cggcaccctg gtggtggtgg 420
cccccgtaga agccaccctg ttcgaagta 449
Claims (10)
1.一种培育不飞行瓢虫的方法，其特征在于，采用基因干扰的方法，干扰瓢虫翅发育关键基因vestigial或ultrabithorax的表达，培育不飞行瓢虫。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因干扰的方法为注射dsRNA，具体包括以下步骤：
S1、利用dsRNA合成试剂盒合成瓢虫vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA；
S2、对瓢虫幼虫注射vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA的注射量分别为10-100ng；所述瓢虫幼虫为4龄第1天的幼虫。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因干扰的方法为饲喂dsRNA/纳米载体，具体包括以下步骤：
S1、利用dsRNA合成试剂盒合成瓢虫vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA；
S2、将Vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA与纳米载体溶液混合得到dsRNA/纳米载体，随后将dsRNA/纳米载体与人工饲料混匀得到瓢虫饲料；
S3、采用瓢虫饲料饲喂瓢虫幼虫。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA与纳米载体溶液的电荷比为1:8-8:1，优选为1:1；所述dsRNA/纳米载体与所述人工饲料的体积比为1:5-1:20，优选为1:10。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述饲喂阶段为瓢虫的整个幼虫阶段。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因干扰的方法为将dsRNA/纳米载体/表面活性助剂浸泡、喷雾或滴加到瓢虫体表，具体包括以下步骤：
S1、利用dsRNA合成试剂盒合成瓢虫vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA；
S2、将vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA，与纳米载体溶液和表面活性助剂混合，得到复合体药液；
S3、将复合体药液浸泡、喷雾或滴加到瓢虫体表。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA与纳米载体溶液的电荷比为1:8-8:1，优选为1:1；所述表面活性助剂在所述复合体药液中所占的体积比例为4.5-18％，优选为10％。
9.根据权利要求4-8任一项所述的方法，其特征在于，所述纳米载体为内部具有空腔结构，且表面携带正电荷的纳米载体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述纳米载体为具有高密度亲水性官能团的纳米载体。
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