CN105075991A - 检测胃毒性杀虫化合物对白符跳潜在毒性影响的试验方法 - Google Patents

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李云河
杨艳
林克剑
陈秀萍
彭于发
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Abstract

本发明提供了一种检测胃毒性杀虫化合物对白符跳潜在毒性影响的试验方法。该方法通过把杀虫剂或转基因杀虫蛋白均匀地混入酵母粉(饲料)中直接饲喂给白符跳，并以混入蛋白酶抑制剂75μg？E-64/g酵母为阳性对照处理，以没有混入任何杀虫化合物的饲料为阴性对照处理，通过比较处理组和对照组白符跳生存率、头宽、体长和产卵量等重要生命参数评估受试杀虫化合物对跳虫的潜在毒性。采用本方法测定了白符跳对不同浓度砷酸钾(PA)，E-64和雪花凝集素(GNA)的生物学反应。结果发现：白符跳的不同生命参数随PA，E-64，GNA浓度的变化显示出明显的剂量-效应关系，证明了该方法的有效性和灵敏性。

Description

检测胃毒性杀虫化合物对白符跳潜在毒性影响的试验方法
技术领域
本发明涉及检测胃毒性杀虫化合物(包括转基因杀虫蛋白如Bt蛋白)对土壤跳虫白符跳潜在毒性影响的试验方法。
背景技术
跳虫，又称弹尾虫，是分布极广的一类小型土壤节肢动物，是土壤生态系统中重要的分解者，是自然界物质循环的原动力之一，对调节土壤营养物质循环发挥着十分重要的作用。由于跳虫对土壤质量及土壤中有毒化学物质十分敏感，因此，跳虫的多样性以及群落结构、物种组成对土壤质量和污染状况能起到很好的指示作用。
白符跳(Folsomiacandida)是跳虫中最常见的一种，是对化学物质最敏感的一种跳虫，孤雌生殖且易于人工饲养，因此，其作为模式生物被广泛用于土壤中农药残留和土壤质量检测。另外，转基因抗虫作物的种植可通过根部分泌、植物残体和花粉飘落向土壤中释放转基因杀虫蛋白如Bt蛋白。因此，转基因抗虫作物的种植对土壤非靶标节肢动物可能带来的负面影响引起了相关科学家的广泛关注，评价转基因抗虫植物对土壤节肢动物潜在影响已成为了转基因植物环境安全评价的一个重要内容。由于白符跳可通过取食植物残株直接地暴露于转基因植物产生的外源杀虫蛋白。因此，以该土壤节肢动物种作为指示性生物评价转基因抗虫植物产生的外源杀虫蛋白对土壤非靶标节肢动物的潜在影响是比较合适的，已经被研究者广泛认可(Michelleetal.,2005；Yuanetal.,2011,2013；Baietal.,2011；Simsetal.,1997；Bakonyietal.,2011；Michelleetal.,2004；Romeisetal.,2003)。尽管如此，以往的工作主要集中在通过田间调查研究转基因抗虫植物种植后对跳虫群落动态影响方面，目前还没有比较完善的可用于评价杀虫剂或转基因杀虫蛋白对白符跳直接毒性影响的试验体系。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测胃毒性杀虫化合物对白符跳潜在毒性影响的试验方法，是一种可用于检测胃毒性杀虫剂及转基因杀虫蛋白如Bt蛋白对土壤跳虫白符跳潜在毒性影响的试验技术，此技术可以为农药及转基因抗虫植物环境安全研究提供技术支撑。
本发明提供的检测胃毒性杀虫化合物对白符跳潜在毒性影响的试验方法(所述杀虫化合物为杀虫剂或转基因杀虫蛋白)，通过把杀虫剂或转基因杀虫蛋白均匀地混入人工饲料中直接饲喂给白符跳，并设置对照处理，通过比较处理组和对照组白符跳生命参数评估受试杀虫化合物对白符跳的潜在毒性，其特征在于，所述人工饲料为酵母粉，选用9-14天白符跳虫开始检测试验。
所述检测试验持续15-30天为佳。
所述检测试验优选持续20-28天。
优选10-12天白符跳虫开始检测试验。
优选地，以混入阳性对照化合物的饲料作为阳性对照，所述阳性对照化合物为砷酸钾或E-64或雪花凝集素，以没有混入任何杀虫化合物的饲料作为阴性对照处理。
更优选地，以混入蛋白酶抑制剂E-64的饲料为阳性对照处理，浓度为70-250μgE-64/g酵母。
所选用的白符跳优选用如下方法饲养而得：将新产的卵块转移到具有基底的培养皿内，把培养皿置于人工气候箱内饲养，所述人工气候箱的条件为：温度：20±1℃，相对湿度：70±5％，无光照，在虫快孵化前在培养皿底部中央加入酵母粉，每周更换酵母粉，同时加水保持基底湿润。
所述检测试验优选按如下方法进行：把受试的杀虫化合物溶入蒸馏水中，把酵母粉混入溶液，酵母粉：溶液按1：5重量比，充分搅拌后，真空冷冻干燥，分装后置于-20℃冰箱待用；采用同样的方法，将酵母粉以1：5重量比混入蒸馏水，冷冻干燥后置于-20℃冰箱保存，作为阴性对照饲料，将随机选取的白符跳虫置于具有基底的培养皿中，将制备好的对照或杀虫化合物处理饲料置于培养皿底部中央饲喂跳虫，饲料每隔2天更换一次，每个处理设多个重复，生物测定试验在培养箱中进行，培养条件为：温度：20±1℃，相对湿度：70±5％，光照:12:12H。
更优选地，所述基底的形成方法为：把石膏：活性炭：水按9：1：10重量比混匀，倒入培养皿，室温下凝固形成3-5mm基底，培养皿直径与酵母粉加入量的比值为40-50mm：1mg。
本发明的方法简单、易行，可快速检测胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白如Bt蛋白对跳虫的潜在毒性影响，通过生物学反应试验证实了有效性和灵敏性。
附图说明
图1.利用本发明提供的方法测得的取食含不同浓度砷酸钾(PA)、蛋白酶抑制剂(E-64)或雪花莲凝集素(GNA)饲料的白符跳存活图。
图2.利用本发明提供的试验方法测得的取食含Cry1C、Cry2A杀虫蛋白和E-64饲料的白符跳生存曲线图。
具体实施方式
1毒性测定体系的构建
下面说明本发明提供的检测胃毒性杀虫化合物(包括转基因杀虫蛋白如Bt蛋白)对土壤跳虫白符跳潜在毒性影响的试验方法的具体实施方式。
白符跳饲料：建立测定杀虫化合物对受试昆虫的直接毒性，首先需要一个合适的昆虫饲料，通过该饲料把杀虫化合物饲喂给受试昆虫。在该毒性测定体系中，所采用的饲料必须能满足所测定昆虫的正常生长发育(一般要求存活率>80％)(Romeisetal.,2011；Lietal.,2013)。通过实验研究发现，以酵母粉(梅山，河北马利食品有限公司)作为饲料，白符跳的存活率>85％(图1)，满足建立毒性测定体系的基本要求。
白符跳饲喂方法：把石膏：活性炭：水按9：1：10重量比混匀，适量倒入塑料培养皿(直径：90mm；高：15mm)，室温下凝固形成基底(3-5mm)。用毛笔小心的将新产的卵块转移到培养皿内。把培养皿置于人工气候箱(RXZ-380A，宁波江南仪器厂)(温度：20±1℃，相对湿度：70±5％，无光照)内饲养。一般一星期后卵开始孵化，在虫快孵化前在培养皿底部中央加入2mg酵母粉(梅山，河北马利食品有限公司)，每周更换酵母粉，同时加入适量水保持基底湿润。
生物测定试验方法：
生物测定实验中一般包括以下处理：
1)阴性对照组：酵母中不添加受试化合物；
2)处理组：酵母中按一定浓度(根据需要)均匀混入受试杀虫剂或转基因杀虫蛋白；
3)阳性对照组：酵母中均匀混入E-64(浓度一般为70-250μg/g酵母粉)。
把受试化合物如Bt蛋白或阳性对照化合物如E-64溶入适量蒸馏水中，然后把适量酵母粉混入溶液(酵母粉：溶液按1：5重量比)，充分搅拌后，真空冷冻干燥，分装后置于-20℃冰箱待用。采用同样的方法，将酵母粉按比例混入蒸馏水，冷冻干燥后置于-20℃冰箱保存，作为阴性对照饲料。一般选用10-12天白符跳虫进行生物测定试验。如上述方法，随机选取10头跳虫置于培养皿中，将制备好的对照或杀虫化合物处理饲料置于具有基底的培养皿(形成基底的方法与前面所述一样)底部中央饲喂跳虫。为了降低受试化合物的降解，保持受试杀虫化合物的生物活性，饲料每隔2天更换一次。每个处理设5个重复，共用50头跳虫。生物测定试验在培养箱(温度：20±1℃，相对湿度：70±5％，光照:12:12H)中进行。
试验持续28天，每天上午9点和下午9点观察白符跳生长发育，记录跳虫死亡率、产卵数，并每隔7天测量跳虫头宽、体长。所得数据采用合适的生物统计方法进行分析，比较各处理组白符跳不同生命参数的差异。为了明确试验过程中跳虫实际暴露于受试化合物的浓度，一般需要采用相应技术检测饲料及跳虫体内受试化合物的浓度。比如，如果检测Bt蛋白对白符跳的潜在毒性，一般采用酶联免疫法(ELISA)监测饲料中Bt蛋白的浓度及跳虫取食饲料后体内Bt蛋白的含量。
2阳性对照化合物筛选及体系有效性验证
为了验证该所建立的白符跳毒性测定体系的有效性和灵敏性，即生测试验是否能彰显受试化合物可能的毒性。通过所建立的试验方法，把已知对白符跳有毒的砷酸钾(potassiumarsenate,PA；KH2AsO4)、蛋白酶抑制剂(E-64)和雪花莲凝集素(Galanthusnivalisagglutinin，GNA)按照以下浓度0，4.5，9，36μg/g，0，25，75，225μg/g，0，100，1000μg/g酵母粉均匀混入酵母。三个化合物均购置于美国Sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO)。按照上述方法测定取食含不同浓度PA，E-64，GNA饲料对白符跳生长发育的影响。
结果如下：对照组跳虫存活率为86.6％。然而，随着PA，E-64，GNA浓度的升高，幼虫存活率逐渐下降。存活率分析显示：PA浓度在4.5μg/g时，白符跳存活率与对照组无明显差异(P>0.05)；当PA的浓度为9和36μg/g饲料时，跳虫存活率相对于对照组显著降低(P<0.05)。同样，E-64浓度在25μg/g时，白符跳存活率与对照组无明显差异(P>0.05)；而当E-64浓度在75μg/g和225μg/g时，跳虫存活率相对于对照组显著降低(P<0.01)；GNA浓度在100μg/g和1000μg/g时，跳虫存活率与对照组相比存在极显著差异(P<0.01)(图1)。同样，白符跳体长、头宽、产卵前期、产卵数等其它生命参数也随毒性化合物的浓度提高表现出明显的剂量-效应关系。
这里，对本发明的试验体系做如下说明：上面所述的孵化、饲养和检测条件都是经过大量试验和调整后得到的优化方案，许多参数的变化都会对检测的灵敏性和可靠性带来影响，而且许多参数之间会相互影响，再加上相互之间的影响并没有显著的规律可循，发明人付出了大量的探索性劳动才得出了本发明的优化体系。举例来说，优选10-12天跳虫是很重要的一步，发明人试验了9-14天跳虫，也试验了少于9天和多于14天的跳虫，结果表明，无论对E-64的敏感性还是线性相关性，都是选用10-12天跳虫表现最好。这里所说的10-12天，相应地关联到启动光照的时间和开始检测试验的时间。当然，以上仅是举例，其它许多相互关联的条件和参数，例如选用酵母粉作为人工饲料，孵化、饲喂和检测方法、检测持续时间和阳性对照的选取，等等，都相当重要，而且容易想到这些条件和参数对于一个完整试验体系的重要性，这里不再赘述。
基于以上生物测定试验结果，可以得出以下结论：
1)三种毒性化合物PA，E-64和GNA均可作为本发明所设计的生物测定实验体系所需要的阳性对照化合物，但考虑到PA有微弱的接触毒性，GNA较为昂贵且毒性相对较弱，因此，优选采用E-64作为阳性对照化合物用于本测定体系，浓度设为70-250μg/g饲料比较合适；
2)白符跳对不同浓度PA，E-64和GNA的生物学反应试验证实所建立的白符跳毒性测定方法的有效性和灵敏性；
3)本发明提供的试验方法简单、易行，可快速检测胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白如Bt蛋白对跳虫的潜在毒性影响。
取食含Cry1C、Cry2A杀虫蛋白和E-64饲料的白符跳生存率测试
利用本发明提供的上述试验方法测试了取食含Cry1C、Cry2A杀虫蛋白和E-64饲料的白符跳生存率，如图2所示。由图2可知，取食含Cry1C、Cry2A杀虫蛋白饲料的白符跳生存率曲线与阴性对照非常接近，与阳性对照相差甚远，因此，表明Cry1C、Cry2A杀虫蛋白对白符跳无显著潜在毒性影响。

Claims (10)

1.检测胃毒性杀虫化合物对白符跳潜在毒性影响的试验方法，所述杀虫化合物为杀虫剂或转基因杀虫蛋白，该方法通过把杀虫剂或转基因杀虫蛋白均匀地混入人工饲料中直接饲喂给白符跳，并设置对照处理，通过比较处理组和对照组白符跳生命参数评估受试杀虫化合物对白符跳的潜在毒性，其特征在于，所述人工饲料为酵母粉，选用9-14天白符跳虫开始检测试验。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测试验持续15-30天。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测试验持续20-28天。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，选用10-12天白符跳虫开始检测试验。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以混入阳性对照化合物的饲料作为阳性对照，所述阳性对照化合物为砷酸钾或E-64或雪花凝集素，以没有混入任何杀虫化合物的饲料作为阴性对照处理。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以混入蛋白酶抑制剂E-64的饲料为阳性对照处理，浓度为70-250μgE-64/g酵母。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所选用的白符跳用如下方法饲养而得：将新产的卵块转移到具有基底的培养皿内，把培养皿置于人工气候箱内饲养，所述人工气候箱的条件为：温度：20±1℃，相对湿度：70±5％，无光照，在虫快孵化前在培养皿底部中央加入酵母粉，每周更换酵母粉，同时加水保持基底湿润。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测试验按如下方法进行：把受试的杀虫化合物溶入蒸馏水中，把酵母粉混入溶液，酵母粉：溶液按1：5重量比，充分搅拌后，真空冷冻干燥，分装后置于-20℃冰箱待用；采用同样的方法，将酵母粉以1：5重量比混入蒸馏水，冷冻干燥后置于-20℃冰箱保存，作为阴性对照饲料，将随机选取的白符跳虫置于具有基底的培养皿中，将制备好的对照或杀虫化合物处理饲料置于培养皿底部中央饲喂跳虫，饲料每隔2天更换一次，每个处理设多个重复，生物测定试验在培养箱中进行，培养条件为：温度：20±1℃，相对湿度：70±5％，光照:12:12H。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述基底的形成方法为：把石膏：活性炭：水按9：1：10重量比混匀，倒入培养皿，室温下凝固形成3-5mm基底，培养皿直径与酵母粉加入量的比值为40-50mm：1mg。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白符跳生命参数包括存活率、体长、头宽、产卵前期和产卵数中的一种或多种。
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