CN109892289A - 转基因作物表达的杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫安全性评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种转基因作物表达的杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫安全性评价方法，由杀虫蛋白微注射寄主幼虫体系构建，Tier‑1毒性测定试验，蛋白传递规律三部分组成。由杀虫蛋白微注射寄主幼虫体系确定注射转基因杀虫蛋白的体积、浓度以及接入与取出麦蛾柔茧蜂的时间；由Tier‑1毒性测定试验评价转基因杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫的潜在毒性；由蛋白传递规律评价麦蛾柔茧蜂幼虫暴露于Bt蛋白的途径和程度。本发明根据以上数据综合评估了转基因抗虫作物表达的杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫是安全的。本发明建立了一套系统、科学的评价方法，对完善转基因杀虫作物对外寄生天敌影响以及确定转基因作物种植的生态安全性具有重要意义。

Description

转基因作物表达的杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫安全性评价 方法

技术领域

本发明属于转基因作物生态风险评价技术领域,具体涉及一种转基因抗虫作物表达的杀虫蛋白对寄生性天敌麦蛾柔茧蜂幼虫安全性评价方法。

背景技术

转基因作物的种植给人类带来了可观的社会、经济和环境效益，如有效控制了靶标害虫的发生，极大的减少了对广谱化学杀虫剂的依赖，不仅增加了农民的收入，更保护了人类健康和农业生态环境(Huang et al 2005)。与此同时，任何一种转基因抗虫植物在其商业化种植以前，依据个案原则，必须对其进行严格、系统、科学的安全性评价。目前，转基因抗虫植物的环境安全性研究主要集中在：对靶标害虫的抗性监测及治理；对非靶标生物和生物多样性的影响；基因漂移问题；对土壤微生物的影响等(韩兰芝2006)。寄生性天敌在生物防治，害虫种群控制方面具有非常重要的生态功能。这些功能被认为是不可以被任何新的害虫防治技术的引进所破坏的(Niensted et al 2012，Sanvido et al 2012)。因而，转基因抗虫水稻对寄生性天敌的非靶标影响是转基因作物环境安全性评价中至关重要的部分。

目前，Bt蛋白对寄生性天敌不利影响的报道主要集中靶标生物的寄生性天敌，而对非靶标害虫的寄生性天敌无负面影响报道(宋贤利等2002，张晖等2003，姜永厚等2004,2005，ChulerTH et al.，2000，Baur et al 2003，Sims et al.2005，Barraclough et al2009，Gao et al 2010)。同时用花粉、蜂蜜水等进行的二类试验，也表明Bt蛋白对寄生性天敌成虫无负面影响(吴研等2008，Han et al 2015)。然而，并没有发现关于转基因抗虫作物所表达的外源转基因杀虫蛋白对寄生性天敌幼虫直接毒性研究的相关报道，且无法排除这种负面影响是否是“猎物质量介导效应”造成的。

在评价转基因抗虫植物对非靶标生物潜在的影响方面，“分阶段评价体系”被广大风险评价工作者和转基因生物安全监管部门所接受和认可(Romeis et al2004,2011,2013)。第一阶段实验(Tier-1)是“分阶段评价体系”中的第一阶段试验。该方法既可以提高了检测到潜在风险的可能性，也可以尽可能降低风险。同时，由于其结论具有普遍性，因此该阶段的评价实验对于环境风险评价非常有价值，为进一步评价奠定了理论基础(Romeiset al 2013)。

印度谷螟Plodia interpunctella(Hubner)是重要的鳞翅目仓储害虫(吴永刚等，2005)，是转基因水稻存储过程中重要的靶标性昆虫。麦蛾柔茧蜂Habrobracon hebtor Say是一种世界性分布的外寄生天敌，可以用来防治印度谷螟等鳞翅目害虫。麦蛾柔茧蜂幼虫在寄生过程中可能摄取到杀虫蛋白，有存在生态风险的可能性，并无法排除“猎物质量介导效应”可能造成的负面影响。那么，建立一套系统评价杀虫蛋白对寄生性天敌麦蛾柔茧蜂幼虫是否安全的方法尤为重要。

发明内容

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种安全有效的转基因作物表达的杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫安全性评价方法。

本发明目的的实现方式为，转基因作物表达的杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫安全性评价方法，具体步骤如下：

1)杀虫蛋白微注射寄主幼虫体系构建：确定了注射杀虫蛋白的体积、浓度以及接入与取出麦蛾柔茧蜂的时间；

将200头3龄印度谷螟幼虫饥饿48小时后，接入到表达杀虫蛋白的转基因稻谷粉中，2天后收集未死亡虫；用对应杀虫蛋白试剂盒中的1x Extraction buffer洗涤未死亡虫三次，去除体表吸附的杀虫蛋白，剪破其尾足，在冰上，用毛细血管取其血淋巴至离心管中；采用ELISA技术检测稻谷粉与取食转基因稻谷粉印度谷螟血淋巴中杀虫蛋白的真实含量；

确定注射杀虫蛋白后48h内印度谷螟幼虫血淋巴中杀虫蛋白降解动态与均匀性，以确保麦蛾柔茧蜂的幼虫都能够暴露于高剂量杀虫蛋白，即高于麦蛾柔茧蜂在真实情况下可能接触到的杀虫蛋白含量的十倍；给单头4-5龄印度谷螟幼虫腹部末端按高于麦蛾柔茧蜂在真实情况下可能接触到的杀虫蛋白含量的10-40倍剂量注射杀虫蛋白，共注射300头，分别在0、0.5h、1.5h、4.5h、13.5h、40.5h取40头活4-5龄印度谷螟幼虫；40头活4-5龄印度谷螟幼虫中，其中20头取近注射端腹部的血淋巴，一个重复6头，共三个重复；另外20头取远离注射端头部的血淋巴，一个重复6头，共三个重复；用ELISA方法测血淋巴中杀虫蛋白的浓度；

在上述降解动态试验采用的剂量下，设置70nl、140nl、210nl、280nl、350nl、420nl不同的注射体积；并分别用等体积ddH2O作对照；每个处理共3个重复，一个重复注射30头4-5龄印度谷螟幼虫；观察7天内存活率；同时平行开展另外一组试验，每个体积注射30头4-5龄印度谷螟幼虫，根据上述实验结果，于13.5h后取4-5龄印度谷螟幼虫血淋巴存于-20℃冰箱中，每6头4-5龄印度谷螟幼虫的血淋巴为一个重复，共3个重复；ELISA方法测其血淋巴中杀虫蛋白的浓度；对照及处理的存活率均在80％以上的，确认为单头注射杀虫蛋白的剂量与体积；

确认单头注射杀虫蛋白的剂量与体积后，注射相同剂量与体积的雪花莲凝集素蛋白与牛血清蛋白；每个处理共3个重复，一个重复注射30头4-5龄印度谷螟幼虫；观察7天内存活率，作为后续试验中的阳性与阴性对照；以确定接入麦蛾柔茧蜂与接入麦蛾柔茧蜂的时间；

2)Tier-1毒性测定试验：评价转基因作物表达的杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫的潜在毒性；

按1对新羽化麦蛾柔茧蜂雌雄成虫与15头4-5龄印度谷螟幼虫的密度将麦蛾柔茧蜂与4-5龄印度谷螟幼虫接入粗玻璃管中，饲养时玻璃管管口用白布罩封口，每日添加10％的蜂蜜水润湿白布，供麦蛾柔茧蜂成虫取食直至印度谷螟幼虫被寄生；保持饲养条件至下一代麦蛾柔茧蜂成虫出现；粗玻璃管置于温度27±3℃，相对湿度70±5％，光周期14L:10D的气候箱内培养；

用三种处理的4-5龄印度谷螟幼虫作为麦蛾柔茧蜂的寄主，三种处理的4-5龄印度谷螟幼虫为：

(1)注射杀虫蛋白的4-5龄印度谷螟幼虫，注射量保证4-5龄印度谷螟幼虫血淋巴中杀虫蛋白的浓度在麦蛾柔茧蜂幼虫寄生过程中，高于步骤1)所确定的注射杀虫蛋白的剂量的10倍以上；

(2)注射雪花莲凝集素蛋白的4-5龄印度谷螟幼虫作为阳性对照；

(3)注射牛血素蛋白的4-5龄印度谷螟幼虫作为阴性对照；

取两种蛋白注射对照4-5龄印度谷螟幼虫，蛋白注射剂量同杀虫蛋白；

取15头4-5龄印度谷螟幼虫，将蛋白注射入其体内，然后接入玻璃管中，到步骤1)所确定的时间后接入1对羽化12h以内，且充分交配24h后的麦蛾柔茧蜂成虫产卵，到步骤1)所确定的时间后移出麦蛾柔茧蜂成虫；在体视镜下挑出已被寄生的4-5龄印度谷螟幼虫，移除多余的卵，使1头4-5龄印度谷螟幼虫上只保留1粒麦蛾柔茧蜂卵；再将这些被寄生的4-5龄印度谷螟幼虫放入培养皿中，每天观察麦蛾柔茧蜂的发育进度并记录相应参数；麦蛾柔茧蜂化蛹后，随机取30头蛹，每2头蛹称重；羽化后，记录成虫的性别，每2头雌成虫、每4头雄成虫称重，20个重复；

阴性对照与阳性对照处理方法同上；

试验中通过ELISA和敏感昆虫生测技术全程监测杀虫蛋白的浓度、稳定性以及生物活性；

选择麦蛾柔茧蜂卵孵化率、幼虫发育历期、蛹重、成虫性比及体重以及雌虫产卵量作为评价参数指标，对其进行统计分析，以评价杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫的毒性影响；

3)蛋白传递规律：通过ELISA检测手段检测麦蛾柔茧蜂幼虫暴露于杀虫蛋白的途径和程度；

分别将步骤2)所得的被寄生的4-5龄印度谷螟幼虫作为麦蛾柔茧蜂的寄主，分别对被寄生4-5龄印度谷螟血淋巴10±2mg、麦蛾柔茧蜂低龄幼虫20±2mg、麦蛾柔茧蜂高龄幼虫20±2mg、麦蛾柔茧蜂蛹20±2mg、麦蛾柔茧蜂雌雄成虫20±2mg进行取样，各4个重复；

采用ELISA技术，分别对上述样品进行取样，对取样中杀虫蛋白的含量进行检测，确定通过寄生印度谷螟幼虫麦蛾柔茧蜂幼虫暴露于杀虫蛋白的程度。

本发明通过最终通过杀虫蛋白微注射寄主幼虫体系确定了杀虫蛋白的注射体积、浓度以及接入与移除麦蛾柔茧蜂的时间；Tier-1毒性测定试验评价了杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫的潜在毒性；蛋白传递规律评价麦蛾柔茧蜂幼虫暴露于杀虫蛋白的途径和程度。

本发明根据三个方面的数据综合评估了转基因抗虫作物表达的杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫是安全的。

本发明建立了一套系统、科学的评价方法，对完善转基因抗虫作物对外寄生天敌影响的研究以及确定转基因作物种植的生态安全性具有重要意义。

附图说明

图1为注射17.5ng Cry1C蛋白后，48h内印度谷螟幼虫血淋巴中蛋白降解情况图，

图2为注射70ng Cry1C蛋白后，48h内印度谷螟幼虫血淋巴中蛋白降解情况图，

图3、4、5、6、7、8为单头注射70ng Cry1C蛋白，不同注射体积条件下印度谷螟幼虫7天内的存活率图，

图9单头注射70ng GNA与BSA蛋白时，印度谷螟幼虫7天内的存活率图，

图10单头注射70ng Cry1C蛋白的印度谷螟幼虫被茧蜂寄生后其血淋巴中蛋白降解情况图，

图11为取食血淋巴中含Cry1C蛋白、GNA以及BSA印度谷螟幼虫的麦蛾柔茧蜂生存曲线图。

具体实施方式

本发明的转基因抗虫水稻选择转cry1C基因水稻T1C-19，其对鳞翅目害虫有很高的抗性，非转基因亲本选择对照明恢63水稻，水稻种子均由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室提供。

本发明的供试印度谷螟采集自武汉中储粮滠口粮库，在华中农业大学城市有害生物防治研究所养虫室用以小麦为主的半人工饲料纯化5代以上。麦蛾茧蜂由华中农业大学城市有害生物防治研究所养虫室提供虫源。挑选羽化12h以内的成虫，雌雄配对，并用10％的蜂蜜水饲喂成虫，24h后待用。饲养条件为温度(27±3℃)，相对湿度(70±5％)，光暗比(L14h:D 10h)。

本发明的评价方法由杀虫蛋白微注射寄主幼虫体系构建，Tier-1毒性测定试验，蛋白传递规律3个部分组成。下面分别进行详细说明。

1)杀虫蛋白微注射寄主幼虫体系构建：确定了注射杀虫蛋白的体积、浓度以及接入与取出麦蛾柔茧蜂的时间。

先了解确定现实情况中，麦蛾柔茧蜂可能接触到的杀虫蛋白含量，本发明以此结果量的十倍作为最低的接触浓度。

将200头3龄印度谷螟幼虫饥饿48小时后，接入到表达杀虫蛋白的转基因稻谷粉中，2天后收集未死亡虫。用对应杀虫蛋白试剂盒中的1x Extraction buffer洗涤未死亡虫三次以去除体表吸附的杀虫蛋白，剪破其尾足，在冰上，用毛细血管取其血淋巴至离心管中。采用ELISA技术检测稻谷粉与取食转Cry1C稻谷粉印度谷螟血淋巴中Cry1C蛋白含量分别为97.59±11.33ng/g和1.72±0.18ng/g。

确定注射杀虫蛋白后48h内印度谷螟幼虫血淋巴中杀虫蛋白降解动态与均匀性，以确保麦蛾柔茧蜂的幼虫都能够暴露于高剂量杀虫蛋白，即高于麦蛾柔茧蜂在真实情况下可能接触到的杀虫蛋白含量的10-40倍。10-40倍的剂量需要确保注射杀虫蛋白后13.5h，4-5龄印度谷螟幼虫血淋巴中杀虫蛋白含量高于麦蛾柔茧蜂在真实情况下可能接触到的杀虫蛋白含量的十倍。

给单头4-5龄印度谷螟幼虫腹部末端按0.25ng/nl、70nl共17.5ng的Cry1C蛋白(高于麦蛾柔茧蜂在真实情况下可能接触到的杀虫蛋白含量的十倍)；0.5ng/nl、140nl共70ng的Cry1C蛋白(高于麦蛾柔茧蜂在真实情况下可能接触到的杀虫蛋白含量的40倍)。用显微注射仪(WPI,USA)进行注射，注射部位为腹部末端，共注射300头。分别在0、0.5h、1.5h、4.5h、13.5h、40.5h取40头活印度谷螟幼虫。40头活印度谷螟幼虫中，其中20头取近注射端腹部的血淋巴，一个重复6头，共三个重复；另外20头取远离注射端头部的血淋巴，一个重复6头，共三个重复。

单头4-5龄印度谷螟幼虫注射浓度为0.25ng/nl、70nl Cry1C蛋白和注射浓度为0.5ng/nl、140nl Cry1C蛋白时，印度谷螟血淋巴中Cry1C蛋白含量均先急速下降，后缓慢下降(见图1、图2)。

单头4-5龄印度谷螟幼虫注射浓度为0.25ng/nl、70nl Cry1C蛋白时，注射1.5h后，4-5龄印度谷螟幼虫血淋巴中Cry1C含量为12.85±3.20ng/g(平均数±标准误)(见图1)。单头4-5龄印度谷螟幼虫注射浓度为0.5ng/nl、注射体积为140nl Cry1C蛋白时，注射40.5h时4-5龄印度谷螟幼虫血淋巴中Cry1C含量为34.47±1.60ng/g(平均数±标准误)；注射40.5h内印度谷螟血淋巴中Cry1C含量均高于取食转Cry1C稻谷两天后印度谷螟血淋巴中Cry1C蛋白含量(1.72±0.18ng/g)的10倍(见图2)。且注射近端印度谷螟血淋巴中Cry1C蛋白在注射0.5h后与注射远端印度谷螟血淋巴中Cry1C蛋白含量无显著差异(P＝0.983)(图2)，表明注射0.5h后Cry1C蛋白在印度谷螟血淋巴中均一存在。

故本发明根据实验，确定在单头4-5龄印度谷螟幼虫注射浓度为0.5ng/nl、140nlCry1C蛋白后0.5h接入麦蛾柔茧蜂，注射13.5h后取出麦蛾柔茧蜂。

单头注射4-5龄印度谷螟幼虫Cry1C蛋白70ng，设置70nl、140nl、210nl、280nl、350nl、420nl六种注射体积。分别用等体积ddH20作对照每个处理共3个重复，一个重复注射30头4-5龄印度谷螟幼虫。观察7天内存活率。同时平行开展另外一组试验，每个体积注射30头4-5龄印度谷螟幼虫，根据上述实验结果，于13.5h后取幼虫血淋巴存于-20℃冰箱中，每6头4-5龄印度谷螟幼虫的血淋巴为一个重复，共3个重复。ELISA方法测的单头注射70ngCry1C蛋白的浓度，不同注射体积条件下，注射后13.5h时印度谷螟血淋巴中的蛋白含量均高于实际暴露者(1.72±0.18ng/g)的10倍，如表1所示；

表1

从表1可见，单头印度谷螟注射Cry1C蛋白剂量为70ng时，70nl＜注射体积<350nl时，7天后印度谷螟存活高于80％(见图4、5、6)；注射体积＜70nl时，7天后印度谷螟存活低于80％(见图3)。原因可能是注射浓度过高，血淋巴中的瞬间反应过激。注射体积＞350nl时，对照组存活率也低于80％(图7、8)，原因可能是注射体积过高而致死。注射体积为140、210、280nl时，能保证供试生物存活率超过80％。故本发明确定单头注射4-5龄印度谷螟幼虫Cry1C蛋白浓度为0.5ng/nl、0.3ng/nl、/0.25ng/nl，注射体积(nl)为140nl、210nl、280nl。

确认上述单头4-5龄印度谷螟幼注射杀虫蛋白的剂量与体积后，单头4-5龄印度谷螟幼注射浓度为0.5ng/nl、体积为140nl的雪花莲凝集素与牛血清。每个处理注射30头4-5龄印度谷螟幼虫，3个重复。观察7天内存活率。单头4-5龄印度谷螟幼注射浓度为0.5ng/nl、注射体积为140nl牛血清时，7天内印度谷螟幼虫存活率均高于80％，可作为阴性对照(见图9)。单头注射浓度为0.5ng/nl、注射体积为140nl雪花莲凝集素时，5天内印度谷螟幼虫存活率均高于80％。为了排除注射雪花莲凝集素对印度谷螟幼虫造成的影响，实验时挑选注射雪花莲凝集素后13.5h内被寄生的未死亡印度谷螟幼虫作为阳性对照。

综上所述：本发明构建了杀虫蛋白微注射4-5龄印度谷螟幼虫体系。Cry1C蛋白的注射浓度为0.5ng/nl、注射体积为140nl。在注射后0.5h接入麦蛾柔茧蜂，13.5h取出麦蛾柔茧蜂。

2)Tier-1毒性测定试验：评价了转基因所表达的杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫的潜在毒性；

将经步骤1)新羽化麦蛾柔茧蜂与4-5龄印度谷螟幼虫按1:15的密度接入直径2.5cm×高7.5cm粗玻璃管中，饲养时玻璃管管口用白布罩封口，每日添加10％的蜂蜜水润湿白布，供麦蛾柔茧蜂成虫取食直至印度谷螟幼虫被寄生。保持饲养条件至下一代麦蛾柔茧蜂成虫出现即可。粗玻璃管置于温度27±3℃，相对湿度70±5％，光周期14L:10D的智能人工气候箱内培养。

用三种处理的4-5龄印度谷螟幼虫作为麦蛾柔茧蜂的寄主，三种处理的4-5龄印度谷螟幼虫为：

(1)取15头4-5龄印度谷螟幼虫，将浓度为0.5ng/nl、注射体积为140nl的Cry1C蛋白注射入4-5龄印度谷螟幼虫体内；

(2)注射雪花莲凝集素蛋白的4-5印度谷螟幼虫作为阳性对照，注射量同(1)；

(3)注射牛血素蛋白的印度谷螟幼虫作为阴性对照，注射量同(1)。

然后接入直径2.5cm×高7.5cm玻璃管中，0.5h接入1对羽化12h以内且充分交配24h后麦蛾柔茧蜂成虫产卵，13.5h后移出麦蛾柔茧蜂成虫。在体视镜下挑出已被寄生的印度谷螟幼虫，移除多余的卵，使1头印度谷螟幼虫上只保留1粒麦蛾柔茧蜂卵。

然后将这些被寄生的印度谷螟幼虫放入直径9cm培养皿中，每天观察麦蛾柔茧蜂的发育进度并记录相应参数。麦蛾柔茧蜂化蛹后，随机取30头蛹，每2头蛹用万分之一电子天平称重；羽化后，记录成虫的性别，每2头雌成虫、每4头雄成虫用万分之一电子天平称量。重复数20。阴性对照与阳性对照处理同Cry1C蛋白处理。

雌性率＝麦蛾柔茧蜂羽化雌蜂数/总羽化数

卵孵化率＝麦蛾柔茧蜂幼虫数/产卵量

此外，将上述三种处理的羽化12h以内的成虫，雌雄配对，并用10％的蜂蜜水饲喂成虫，每24h补充一次蜂蜜水。然后单对转入直径2.5cm×高7.5cm玻璃管中。产卵一天后移出麦蛾柔茧蜂至内有15头4-5龄印度谷螟幼虫，直径2.5cm×高7.5cm另一玻璃管中，挑出寄生的4-5龄印度谷螟幼虫，显微镜下检查麦蛾柔茧蜂卵粒数。重复上述处理直至产卵第6天。20个重复。

寄生含上述三种蛋白的4-5龄印度谷螟幼虫的麦蛾柔茧蜂生命表参数如表2所示：

表2

从表2可见，与注射牛血清对照相比，以单头注射浓度为0.5ng/nl、注射体积为140nl Cry1C蛋白的4-5龄印度谷螟幼虫作为食物的麦蛾柔茧蜂所测各项生命表参数(卵孵化率、卵至成虫发育历期、雌性率、蛹重、初羽化雌雄成虫体重、雌虫6天总产卵数以及成虫寿命均无显著性差异(P>0.05)。而阳性对照处理中，麦蛾柔茧蜂的卵孵化率、初羽化雌雄成虫体重雌虫6天总产卵数以及成虫寿命有显著性差异。

Kaplan-Meier生存分析结果表明：以单头注射浓度为0.5ng/nl、注射体积为140nlCry1C蛋白的4-5龄印度谷螟幼虫作为食物的麦蛾柔茧蜂与对照处理之间的存活率无显著性差异(P＝0.9077)(见图10)。

利用ELISA技术检测被茧蜂寄生0、1、3、5、7天的4-5龄印度谷螟幼虫其血淋巴中Cry1C蛋白含量在均高于1.72±0.18ng/g的10倍且保持稳定(图11)。而未被麦蛾柔茧蜂寄生的印度谷螟幼虫血淋巴Cry1C蛋白含量在0、1、3、5、7天不断降解，第7天低于1.72±0.18ng/g的10倍。该结果表明单头注射浓度为0.5ng/nl、注射体积为140nl Cry1C蛋白至4-5龄印度谷螟幼虫后，寄生的麦蛾柔茧蜂可始终暴露于含有Cry1C蛋白的血淋巴中，且高于实际暴露量(1.72±0.18ng/g)的10倍。取被茧蜂寄生第7天的4-5龄印度谷螟幼虫血淋巴，按照ELISA试剂盒说明书，提取血淋巴中的Cry1C蛋白，并检测血淋巴中Cry1C蛋白的含量。4-5龄印度谷螟人工饲料的配方为：麦粉8.3g、面粉10.06g、酵母0.67g、山梨酸0.03g、对羟基苯甲酸甲酯0.03g、甘油2g、蜂蜜2g、水5-7ml。其中的水分别用注射Cry1C蛋白并寄生7天时的4-5龄印度谷螟血淋巴和正常饲养条件下的4-5龄印度谷螟血淋巴代替配置两种处理的2.5g饲料。

ELISA检测饲料中的Cry1C蛋白含量。每个处理接入24头印度谷螟初孵幼虫，3个重复。7天后记录幼虫存活情况。结果表明：单头注射浓度为0.5ng/nl、注射体积为140nlCry1C蛋白的4-5龄印度谷螟幼虫被茧蜂寄生7天时其血淋巴中Cry1C蛋白浓度为69.012±13.158ng/ml。所配饲料中Cry1C蛋白浓度为0.0272±0.002ug/g。含注射过蛋白且被茧蜂寄生7天时的4-5龄印度谷螟幼虫的血淋巴的人工饲料，对4-5龄印度谷螟初孵幼虫的死亡率为41.7±0.087％，远低于含正常4-5龄印度谷螟血淋巴的人工饲料的存活率0.801±0.037％，表明麦蛾柔茧蜂幼虫整个寄生过程中，Cry1C蛋白都具有较高的杀虫活性。综上所述，麦蛾柔茧蜂幼虫暴露于高剂量且具有杀虫活性的Cry1C蛋白，表明其对Cry1C蛋白不敏感。

3)蛋白传递规律：通过ELISA检测手段检测麦蛾柔茧蜂幼虫暴露于杀虫蛋白的途径和程度；

按照步骤2)Tier-1毒性测定试验所述操作进行试验，获取同样三种处理的4-5龄印度谷螟幼虫作为麦蛾柔茧蜂的寄主，分别对被寄生印度谷螟血淋巴10±2mg、麦蛾柔茧蜂低龄幼虫20±2mg、麦蛾柔茧蜂高龄幼虫20±2mg、麦蛾柔茧蜂蛹20±2mg、麦蛾柔茧蜂雌雄成虫20±2mg进行取样，各4个重复。

结果如表4所示：4-5龄印度谷螟血淋巴中Cry1C蛋白含量为61.40±10.81ng/g，麦蛾柔茧蜂低龄幼虫体内Cry1C蛋白含量为12.26±3.13ng/g，麦蛾柔茧蜂高龄幼虫体内Cry1C蛋白含量为20.65±4.42ng/g，而麦蛾柔茧蜂雌成虫、雄成虫体内Cry1C蛋白含量低于检测下限值。4-5龄印度谷螟血淋巴中Cry1C蛋白含量显著高于麦蛾柔茧蜂体内Cry1C蛋白含量(P<0.0001)。

表4

以上结果表明，未脱离4-5龄印度谷螟幼虫时，Cry1C蛋白在麦蛾柔茧蜂体内可不断累积，脱离4-5龄印度谷螟幼虫时，Cry1C蛋白在麦蛾柔茧蜂体内不断降解。

综合杀虫蛋白微注射寄主幼虫体系构建，Tier-1毒性测定试验，蛋白传递规律三部分试验结果，本发明证明了通过显微注射Cry1C蛋白至4-5龄印度谷螟幼虫体内，可用于构建并评估外寄生天敌麦蛾柔茧蜂幼虫的Tier-1安评体系。且该Tier-1实验表明Cry1C蛋白对麦蛾柔茧蜂无负面影响，转基因抗虫作物表达的杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫是安全的。

Claims (5)

1.转基因作物表达的杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫安全性评价方法，其特征在于：具体步骤如下：

1)杀虫蛋白微注射寄主幼虫体系构建：确定了注射杀虫蛋白的体积、浓度以及接入与取出麦蛾柔茧蜂的时间；

将200头3龄印度谷螟幼虫饥饿48小时后，接入到表达杀虫蛋白的转基因稻谷粉中，2天后收集未死亡虫；用对应杀虫蛋白试剂盒中的1x Extraction buffer洗涤未死亡虫三次，去除体表吸附的杀虫蛋白，剪破其尾足，在冰上，用毛细血管取其血淋巴至离心管中；采用ELISA技术检测稻谷粉与取食转基因稻谷粉印度谷螟血淋巴中杀虫蛋白的真实含量；

确定注射杀虫蛋白后48h内印度谷螟幼虫血淋巴中杀虫蛋白降解动态与均匀性，以确保麦蛾柔茧蜂的幼虫都能够暴露于高剂量杀虫蛋白，即高于麦蛾柔茧蜂在真实情况下可能接触到的杀虫蛋白含量的十倍；给单头4-5龄印度谷螟幼虫腹部末端按高于麦蛾柔茧蜂在真实情况下可能接触到的杀虫蛋白含量的10-40倍剂量注射杀虫蛋白，共注射300头，分别在0、0.5h、1.5h、4.5h、13.5h、40.5h取40头活4-5龄印度谷螟幼虫；40头活4-5龄印度谷螟幼虫中，其中20头取近注射端腹部的血淋巴，一个重复6头，共三个重复；另外20头取远离注射端头部的血淋巴，一个重复6头，共三个重复；用ELISA方法测血淋巴中杀虫蛋白的浓度；

在上述降解动态试验采用的剂量下，设置70nl、140nl、210nl、280nl、350nl、420nl不同的注射体积；并分别用等体积ddH2O作对照；每个处理共3个重复，一个重复注射30头4-5龄印度谷螟幼虫；观察7天内存活率；同时平行开展另外一组试验，每个体积注射30头4-5龄印度谷螟幼虫，根据上述实验结果，于13.5h后取4-5龄印度谷螟幼虫血淋巴存于-20℃冰箱中，每6头4-5龄印度谷螟幼虫的血淋巴为一个重复，共3个重复；ELISA方法测其血淋巴中杀虫蛋白的浓度；对照及处理的存活率均在80％以上的，确认为单头注射杀虫蛋白的剂量与体积；

确认单头注射杀虫蛋白的剂量与体积后，注射相同剂量与体积的雪花莲凝集素蛋白与牛血清蛋白；每个处理共3个重复，一个重复注射30头4-5龄印度谷螟幼虫；观察7天内存活率，作为后续试验中的阳性与阴性对照；以确定接入麦蛾柔茧蜂与接入麦蛾柔茧蜂的时间；

2)Tier-1毒性测定试验：评价转基因作物表达的杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫的潜在毒性；

按1对新羽化麦蛾柔茧蜂雌雄成虫与15头4-5龄印度谷螟幼虫的密度将麦蛾柔茧蜂与4-5龄印度谷螟幼虫接入粗玻璃管中，饲养时玻璃管管口用白布罩封口，每日添加10％的蜂蜜水润湿白布，供麦蛾柔茧蜂成虫取食直至4-5龄印度谷螟幼虫被寄生；保持饲养条件至下一代麦蛾柔茧蜂成虫出现；粗玻璃管置于温度27±3℃，相对湿度70±5％，光周期14L:10D的气候箱内培养；

用三种处理的4-5龄印度谷螟幼虫作为麦蛾柔茧蜂的寄主，三种处理的4-5龄印度谷螟幼虫为：

(1)注射杀虫蛋白的4-5龄印度谷螟幼虫，注射量保证4-5龄印度谷螟幼虫血淋巴中杀虫蛋白的浓度在麦蛾柔茧蜂幼虫寄生过程中，高于步骤1)所确定的注射杀虫蛋白的剂量的10倍以上；

(2)注射雪花莲凝集素蛋白的4-5龄印度谷螟幼虫作为阳性对照；

(3)注射牛血素蛋白的4-5龄印度谷螟幼虫作为阴性对照；

取两种蛋白注射对照4-5龄印度谷螟幼虫，蛋白注射剂量同杀虫蛋白；

取15头4-5龄印度谷螟幼虫，将蛋白注射入其体内，然后接入玻璃管中，到步骤1)所确定的时间后接入1对羽化12h以内，且充分交配24h后的麦蛾柔茧蜂成虫产卵，到步骤1)所确定的时间后移出麦蛾柔茧蜂成虫；在体视镜下挑出已被寄生的4-5龄印度谷螟幼虫，移除多余的卵，使1头4-5龄印度谷螟幼虫上只保留1粒麦蛾柔茧蜂卵；再将这些被寄生的4-5龄印度谷螟幼虫放入培养皿中，每天观察麦蛾柔茧蜂的发育进度并记录相应参数；麦蛾柔茧蜂化蛹后，随机取30头蛹，每2头蛹称重；羽化后，记录成虫的性别，每2头雌成虫、每4头雄成虫称重，20个重复；

阴性对照与阳性对照处理方法同上；

试验中通过ELISA和敏感昆虫生测技术全程监测杀虫蛋白的浓度、稳定性以及生物活性；

选择麦蛾柔茧蜂卵孵化率、幼虫发育历期、蛹重、成虫性比及体重以及雌虫产卵量作为评价参数指标，对其进行统计分析，以评价杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫的毒性影响；

3)蛋白传递规律：通过ELISA检测手段检测麦蛾柔茧蜂幼虫暴露于杀虫蛋白的途径和程度；

分别将步骤2)所得的被寄生的4-5龄印度谷螟幼虫作为麦蛾柔茧蜂的寄主，分别对被寄生4-5龄印度谷螟血淋巴10±2mg、麦蛾柔茧蜂低龄幼虫20±2mg、麦蛾柔茧蜂高龄幼虫20±2mg、麦蛾柔茧蜂蛹20±2mg、麦蛾柔茧蜂雌雄成虫20±2mg进行取样，各4个重复；

采用ELISA技术，分别对上述样品进行取样，对取样中杀虫蛋白的含量进行检测，确定通过寄生4-5龄印度谷螟幼虫麦蛾柔茧蜂幼虫暴露于杀虫蛋白的程度。

2.根据权利要求1所述的转基因作物表达的杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫安全性评价方法，其特征在于：步骤1)给单头4-5龄印度谷螟幼虫腹部末端按0.25ng/nl、70nl共17.5ng的Cry1C蛋白；0.5ng/nl、140nl共70ng的Cry1C蛋白；用显微注射仪进行注射，注射部位为腹部末端。

3.根据权利要求1所述的转基因作物表达的杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫安全性评价方法，其特征在于：步骤1)构建杀虫蛋白微注射4-5龄印度谷螟幼虫体系；Cry1C蛋白的注射浓度为0.5ng/nl、注射体积为140nl，注射后0.5h接入麦蛾柔茧蜂，13.5h取出麦蛾柔茧蜂。

4.根据权利要求1或3所述的转基因作物表达的杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫安全性评价方法，其特征在于：

步骤2)接入直径2.5cm×高7.5cm的粗玻璃管中。

5.根据权利要求1所述的转基因作物表达的杀虫蛋白对麦蛾柔茧蜂幼虫安全性评价方法，其特征在于：步骤2)将被寄生的4-5龄印度谷螟幼虫放入直径9cm的培养皿中。