CN109463356A - 一种评价待测物质对红颈常室茧蜂安全性的生物测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种评价待测物质对红颈常室茧蜂安全性的生物测定方法。本发明方法包括(1)分别设置检测组、阴性、阳性对照组，每组均取等量雌雄成对的红颈常室茧蜂成虫及其饲料、等量的绿盲蝽若虫及其食物共同置于封闭空间；待测物质仅在检测组的红颈常室茧蜂的饲料中添加；(2)饲养一段时间后，将绿盲蝽若虫全部移出封闭空间，同时向封闭空间补充新的绿盲蝽若虫，如此反复直至红颈常室茧蜂雌性成虫死亡，统计移出封闭空间的绿盲蝽若虫数和其体内寄生蜂幼虫数量；(3)记录寄生蜂成虫存活时间、寄生率、寄生蜂产卵量，评价待测物质是否对红颈常室茧蜂具有安全性。本发明测定方法准确性高，实用性强。
Description
技术领域
本发明涉及植物保护技术领域，具体地说涉及一种绿盲蝽的天敌红颈常室茧蜂在施用时，评价转基因植物中的抗虫蛋白或其他农药等具有虫毒属性的待测物质是否对红颈常室茧蜂的安全性构成影响的生物测定方法。
背景技术
近年来，随着广谱性高毒化学农药使用量的减少以及作物种植结构的调整，绿盲蝽Apolygus lucorum等盲蝽类害虫逐渐发展成为我国棉田中的重要害虫，并波及枣、葡萄、樱桃、茶等重要经济作物，成为影响多种作物安全生产的主要害虫。目前，针对绿盲蝽的防治措施主要以化学防治为主，但化学农药的大量使用不仅可能引发绿盲蝽的抗药性发展，还会造成环境污染、自然天敌受损、食品安全等一系列问题。因此，寻求安全、有效的防治措施，提高对绿盲蝽的持续控害能力，对绿盲蝽的绿色综合防控具有十分重要的意义。如开发新型对绿盲蝽高效、对天敌安全的特异杀虫剂等。因此，建立有效的评价待测物质对天敌影响的生物测定方法是筛选对高效、安全的杀虫物质的基础。、
寄生性天敌作为农田生态系统中能够对害虫种群数量进行有效、持续控制的一种自然资源，在害虫综合防治中发挥着不可替代的重要作用。红颈常室茧蜂Peristenusspretus属膜翅目(Hymenoptera)，茧蜂科(Braconidae)，是近年来发现的我国特有的一种绿盲蝽寄生蜂，主要寄生绿盲蝽若虫，其卵和幼虫在绿盲蝽体内发育，取食寄主体内的营养物质，发育到高龄幼虫后、寄生蜂钻出寄主体表，到土壤中化蛹。被寄生的绿盲蝽若虫在寄生蜂幼虫钻出后，约2天左右死亡。红颈常室茧蜂对绿盲蝽的室内寄生率可以高达70％，是一种非常宝贵的生物防治资源。
由于红颈常室茧蜂幼虫在绿盲蝽体内发育，不能直接接触到自然环境中的有毒物质，所以一般测定有毒物质对红颈常室茧蜂成虫的影响都采用药膜法，但常规的药膜法只能让成虫接触到少量的待测物，适合评价具有触杀性活性的待测物质，这种方法很难让寄生蜂取食到待测物质，因此无法准确评价那些具有内吸性或胃毒性杀虫活性的毒性物质。在田间寄生蜂不仅会接触有毒物质，而且会通过取食接触到到具有内吸性或胃毒性杀虫活性的毒性物质，例如转基因植物中表达的蛋白等只能通过取食才能到达昆虫体内。因此，建立客观、准确地反映有内吸性或胃毒性杀虫活性的待测物质对于寄生蜂是否安全的方法非常重要。因此迫切需要一种通过让寄生蜂直接取食待测物质来评价有毒物质对成虫影响的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过让红颈常室茧蜂直接取食待测物质来评价该待测物质对红颈常室茧蜂安全性的生物测定方法。
本发明提供的一种评价待测物质对红颈常室茧蜂安全性的生物测定方法，包括步骤：
(1)分别设置检测组、阴性、阳性对照组；每组均取等量的雌雄成对的红颈常室茧蜂及其饲料、等量的绿盲蝽若虫及其食物共同置于封闭空间；仅在所述检测组的红颈常室茧蜂正常饲料中添加待测物质；
(2)饲养一段时间后，将各组中全部绿盲蝽若虫移出封闭空间，同时再向所述封闭空间补充各组等量的新的绿盲蝽若虫，如此反复直至寄生蜂红颈常室茧蜂雌性成虫死亡，则停止供应绿盲蝽，期间统计各组全部使用过的绿盲蝽若虫数和其体内寄生蜂幼虫数量；
(3)记录检测组、阴性、阳性对照组中寄生蜂存活时间、寄生率、寄生蜂产卵量数据根据检测组分别与阴性对照组、阳性对照组前述数据的统计学差异，评价检测组中待测物质对红颈常室茧蜂的安全性，如果存活时间、寄生率或寄生蜂产卵量中任何一个指标与对照差异显著都表示待测物质对红颈常室茧蜂安全性有影响。
步骤(2)中，若雌蜂先死亡则停止供应绿盲蝽，但继续提供寄生蜂饲料，以便统计剩余雄性寄生蜂寿命；若雄蜂先死亡，则每天继续提供绿盲蝽和寄生蜂饲料，因为剩下的雌蜂已经交配过，还有寄生能力，还会寄生绿盲蝽。
本发明所述的生物测定方法中，步骤(1)阳性对照组中，正常饲料中添加对红颈常室茧蜂有杀虫活性的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
所述正常饲料是浓度为5％-10％的蜂蜜水或糖水；所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂为N-[反式-环氧丁二酰基]-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺(E-64)，在阳性对照组中，其在正常饲料的终浓度为2-8μg/g。
所述绿盲蝽若虫食物为本领域内公知的绿盲蝽喜好采食的作物，如新鲜玉米。
所述红颈常室茧蜂成虫为羽化后2-24小时内的红颈常室茧蜂。
本申请实施例中所用的封闭空间为养虫盒，圆形，直径10厘米，高8厘米，养虫盒口用湿润的无菌纱布封紧。本申请实施例中选择的绿盲蝽若虫为2龄，作为红颈常室茧蜂(寄生蜂)的产卵寄主。
本发明的生物测定方法中，检测组中红颈常室茧蜂正常饲料含待测物质，待测物质浓度是推荐使用农药浓度或转基因植物中表达蛋白的10-20倍。
本申请实施例中，是将待测物质以上述规定的浓度添加到红颈常室茧蜂成虫食物——5％-10％蜂蜜水中，将医用脱脂棉蘸取蜂蜜水，用手捏成塔状提供给供试寄生蜂，以不往下滴蜂蜜水为宜。
本发明提供的生物测定方法步骤(1)中，绿盲蝽若虫与红颈常室茧蜂成虫的数量比为10:1-30:1。
上述生物测定方法步骤(2)中，饲养24小时后，将绿盲蝽若虫移出封闭空间。
本发明的实施例是在每饲养24小时后，移出绿盲蝽若虫，更换新的绿盲蝽若虫。
步骤(2)饲养过程中，饲养条件为温度24-26℃，湿度65％-75％，每日光照14小时，黑暗10小时。
本发明所述的生物测定方法，步骤(2)中移出封闭空间绿盲蝽若虫再继续用绿盲蝽食物饲养2-6天后，解剖绿盲蝽，统计被寄生的绿盲蝽数以及其体内的寄生蜂幼虫数；
步骤(3)，统计检测组、阴性对照组、阳性对照组各自的寄生蜂成虫存活时间、寄生率、寄生蜂产卵量，根据检测组分别与阴性对照组、阳性对照组前述结果的统计学差异，评价检测组的待测物质对红颈常室茧蜂的安全性。
本发明中使用的红颈常室茧蜂成虫饲料在0-4℃的条件下储存，储存时间不超过7天。
本发明提供了上述生物测定方法在植物保护中的应用。
本发明提供的评价待测物质对红颈常室茧蜂成虫安全性的生物测定方法，适用范围广，可以直接、有效地评价具有胃毒、内吸作用的有毒物质或能够溶于红颈常室茧蜂成虫饲料的化学物质对该寄生蜂的影响。解决了寄生蜂成虫难于直接、有效地接触到有毒物质、不确定测试寄生蜂是否取食了人工饲料所带来的检测结果不准确等问题。通过本发明方法，不仅可以确保红颈常室茧蜂能够取食到混合均匀的待测物质，评价待测物质对成虫存活的影响；而且通过解剖绿盲蝽若虫，直接对寄生率、寄生蜂产卵量计数，不需等寄生蜂结茧，节约了试验时间；同时设置有效的阴性和阳性对照，保证生测结果的有效性和准确性。因此，本方法能够准确地评价待测物质对红颈常室茧蜂的安全性，具有很强的实用性。
附图说明
图1为Cry2Ab对红颈常室茧蜂存活率和寄生率的影响效果图。红颈常室茧蜂雌虫、雄虫在不同饲料上的存活率和寄生率(被雌寄生蜂产卵寄生的绿盲蝽的百分率)，不同处理间红颈常室茧蜂存活率和寄生率的不同是由饲料中有无有毒物质或添加有毒物质的不同而导致的。注：利用SPSS(version20)分析试验数据，用Dunnett’s test检测进行多重比较；*表示:P<0.05，**表示:P<0.01；图中数值为平均值±标准误。
图2为Cry1Ac对红颈常室茧蜂存活率和寄生率的影响效果图。
图3为Cry1F对红颈常室茧蜂存活率和寄生率的影响效果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1评价Cry2Ab蛋白对红颈常室茧蜂成虫的安全性
制备10％蜂蜜水25mL作为红颈常室茧蜂成虫食物，将其放入4℃冰箱中储存备用。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂(N-[反式-环氧丁二酰基]-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺，E-64)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)，用去离子水配制成5mg/ml的母液，储存于-20℃冰箱备用。
在配制好的糖水中加入Cry2Ab(Envirologix Inc，Portland,ME,USA)，使其在饲料中的终浓度为400μg/g；以不添加其他物质的人工饲料作为阴性对照；以含有2μg/g半胱氨酸蛋白酶抑制剂(N-[反式-环氧丁二酰基]-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺，E-64)的处理饲料作为阳性对照。
检测组、阴性对照组(CK)和E-64阳性对照组分别接入1对羽化24小时的红颈常室茧蜂成虫，并用湿润的双层医用纱布和橡胶圈封口防止其逃逸。接入30头2龄绿盲蝽若虫(作为寄生蜂的产卵寄主)，放入新鲜玉米(绿盲蝽的若虫食物)和一个蘸有蜂蜜水的脱脂棉塔(寄生蜂的食物)，养虫盒口用湿润的双层医用纱布封紧，之后置于温度25±1℃，湿度70±5％，光照14h，黑暗10h的条件下进行培养。24小时后，用软毛刷将绿盲蝽若虫转移到新的养虫盒中，继续用新鲜玉米饲养，4天后解剖绿盲蝽若虫，统计寄生的绿盲蝽数和体内的寄生蜂幼虫数；每24小时更换新的30头2龄绿盲蝽若虫供寄生蜂产卵，直至寄生蜂成虫死亡。每15对红颈常室茧蜂为一组处理，试验重复4次。
记录寄生蜂成虫存活时间、寄生率、寄生蜂产卵量，评价有毒物质是否对红颈常室茧蜂成虫的安全性存在影响。
不同处理组的红颈常室茧蜂成虫生命表参数见表1和图1显示的寄生率。相关结果表明：与取食不加任何其他物质糖水的对照组相比，取食含有2μg/g E-64饲料的红颈常室茧蜂，雌、雄虫寿命、存活率、寄生率及雌虫产卵量都极显著性降低，表明该生测体系中选择的阳性对照物质有效且灵敏。而取食含有Cry2Ab杀虫蛋白的处理饲料对红颈常室茧蜂的各项生命表参数与阴性对照相比，均无显著性影响，说明该种杀虫蛋白对红颈常室茧蜂是安全的。
表1不同处理组的红颈常室茧蜂生命表参数
注：利用SPSS(version20)分析试验数据，用Dunnett’s test检测进行多重比较；*表示:P<0.05，**表示:P<0.01；表中所列数值为平均值±标准误。
实施例2评价Cry1Ac蛋白对红颈常室茧蜂成虫的安全性
具体实施方法同实施例1，红颈常室茧蜂饲料中的Cry1Ac(Envirologix Inc，Portland,ME,USA)终浓度为400μg/g。
相关结果表明(表2、图2)：取食Cry1Ac处理饲料的红颈常室茧蜂雌、雄虫寿命、寄生率及雌虫产卵量与阴性对照相比，无显著性差异，而取食阳性对照处理饲料(E-64)的红颈常室茧蜂各项生命表参数与阴性对照相比，均显著降低，说明该测定杀虫蛋白对红颈常室茧蜂是安全的。
表2 Cry1Ac对红颈常室茧蜂生命表参数的影响
实施例3评价Cry1F蛋白对红颈常室茧蜂成虫的安全性
具体实施方法同实施例1，红颈常室茧蜂饲料中的Cry1F(Envirologix Inc，Portland,ME,USA)终浓度为400μg/g。
表3和图3结果表明：与阳性对照组相比，取食Cry1F处理饲料对红颈常室茧蜂雌、雄虫寿命、寄生率及雌虫产卵量没有显著性影响，但取食阳性对照处理饲料(E-64)却能使红颈常室茧蜂各项生命表参数均显著降低，说明Cry1F杀虫蛋白对红颈常室茧蜂是安全的。
表3 Cry1F对红颈常室茧蜂生命表参数的影响
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种评价待测物质对红颈常室茧蜂安全性的生物测定方法，其特征在于，包括步骤：
(1)分别设置检测组、阴性、阳性对照组；每组均取等量的雌雄成对的红颈常室茧蜂成虫及其正常饲料、等量的绿盲蝽若虫及其食物共同置于封闭空间；待测物质仅在所述检测组的红颈常室茧蜂正常饲料中添加；
(2)饲养一段时间后，将各组中全部绿盲蝽若虫移出封闭空间，同时再向所述封闭空间补充各组等量的新的绿盲蝽若虫，如此反复直至寄生蜂红颈常室茧蜂雌性成虫死亡，则停止供应绿盲蝽，期间统计各组全部使用过的绿盲蝽若虫数和其体内寄生蜂幼虫数量；
(3)记录检测组、阴性、阳性对照组中寄生蜂存活时间、寄生率、寄生蜂产卵量数据根据检测组分别与阴性对照组、阳性对照组前述数据的统计学差异，评价检测组中待测物质对红颈常室茧蜂的安全性，如果存活时间、寄生率或寄生蜂产卵量中任何一个指标与对照差异显著都表示待测物质对红颈常室茧蜂安全性有影响。
2.根据权利要求1所述的生物测定方法，其特征在于，步骤(1)阳性对照组中，正常饲料中添加对红颈常室茧蜂有杀虫活性的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
3.根据权利要求2所述的生物测定方法，其特征在于，所述正常饲料是浓度为5％-10％的蜂蜜水或糖水；所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂为N-[反式-环氧丁二酰基]-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺，在阳性对照组中，其在正常饲料的终浓度为2-8μg/g。
4.根据权利要求1所述的生物测定方法，其特征在于，所述红颈常室茧蜂成虫为羽化后2-24小时内的红颈常室茧蜂。
5.根据权利要求1所述的生物测定方法，其特征在于，检测组中红颈常室茧蜂正常饲料含待测物质，待测物质浓度是推荐使用农药浓度或转基因植物中表达蛋白表达量的10-20倍。
6.根据权利要求1-5所述的生物测定方法，其特征在于，步骤(1)中，绿盲蝽若虫与红颈常室茧蜂成虫的数量比为10:1-30:1。
7.根据权利要求1-6所述的生物测定方法，其特征在于，步骤(2)中，饲养24小时后，将绿盲蝽若虫移出封闭空间，更换新的一组绿盲蝽若虫。
8.根据权利要求1-6任一所述的生物测定方法，其特征在于，步骤(2)饲养过程中，饲养条件为温度24-26℃，湿度65％-75％，每日光照14小时，黑暗10小时。
9.根据权利要求1-6任一所述的生物测定方法，其特征在于，步骤(2)中移出封闭空间绿盲蝽若虫再继续用绿盲蝽食物饲养2-6天后，解剖绿盲蝽，统计被寄生的绿盲蝽数以及其体内的寄生蜂幼虫数。
10.权利要求1-9任一所述的生物测定方法在植物保护中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN115316344A (zh) * | 2022-04-21 | 2022-11-11 | 云南农业大学 | 测定杀虫剂胁迫下寄生蜂类天敌生命表的装置及使用方法 |
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