CN103609877B - 胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对龟纹瓢虫毒性影响的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种简单灵敏的检测胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对龟纹瓢虫直接毒性影响的测定方法。该方法通过把杀虫剂或转基因杀虫蛋白均匀地混入所建立的以花粉为基础的饲料直接饲喂给龟纹瓢虫，并以混入蛋白酶抑制剂E-64的饲料（225μg E-64/g花粉）为阳性对照，以没有混入任何杀虫化合物的饲料为阴性对照，通过比较处理组和对照组瓢虫生存率、发育历期、体重和产卵量等重要生命指标评价杀虫化合物的潜在毒性。采用本方法测定了龟纹瓢虫对不同浓度E-64的生物学反应，龟纹瓢虫的不同生命参数随E-64浓度的变化显示出明显的剂量-效应关系，证明了该方法的有效性和灵敏性。

Description

胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对龟纹瓢虫毒性影响的测定方法

技术领域

本发明涉及胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对龟纹瓢虫毒性影响的测定方法。

背景技术

捕食性瓢虫（Coleoptera:Coccinellidae)是多种作物如棉花、玉米、水稻、蔬菜等田间生态系统中常见的重要天敌昆虫，在作物害虫防治中发挥着重要的作用。因此，在杀虫剂及转基因植物环境安全影响研究中，该类天敌昆虫一直备受关注。特别是近些年，转基因抗虫作物的广泛种植，其可能对天敌昆虫带来的负面影响引起了相关科学家的广泛关注。转基因抗虫作物如Bt作物对瓢虫类天敌昆虫的潜在影响也成为了转基因抗虫作物环境安全评价的一个重要内容（Duan et al.,2002;Lundgren and Wiedenmann,2002;Bai et al.,2005;Schmidt et al.,2009;Li et al.,2010a,2011a,b;álvarez-Alfageme et al.,2009,2011;Porcaret al.,2010）。

龟纹瓢虫（Propylea japonica Thunberg)是我国多种农业生态体系中十分常见的捕食性天敌昆虫，其成虫和幼虫均可捕食蚜虫、甲壳虫、飞虱、螨类、螟蛾类幼虫等害虫。除了捕食害虫，在作物开花期，其还有取食花粉的习性。这样，在作物田龟纹瓢虫可能通过取食猎物间接地暴露于杀虫剂或转基因抗虫作物如Bt棉花表达的外源杀虫蛋白；通过取食花粉而直接地暴露于这些杀虫化合物。因此，该天敌昆虫作为指示性生物已被广泛用于杀虫剂及转基因抗虫植物环境安全研究。然而，目前还没有相对完善的可用于评价杀虫剂或转基因杀虫蛋白对龟纹瓢虫直接毒性影响的技术体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种能简单灵敏地检测胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对龟纹瓢虫直接毒性影响的生物测定方法。

本发明提供的胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对龟纹瓢虫毒性影响的测定方法，通过把胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白均匀地混入龟纹瓢虫饲料直接饲喂龟纹瓢虫，通过直接观察龟纹瓢虫的生命指标评价胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对龟纹瓢虫毒性影响，所述龟纹瓢虫饲料的主要成分为花粉。

所述花粉优选为油菜花粉，也可采用其它如玉米、水稻等花粉。

饲喂龟纹瓢虫的饲喂体系优选为：在龟纹瓢虫幼虫每个龄期第一天仅提供花粉，之后采用花粉和大豆蚜混合饲料饲喂瓢虫直至下一龄期，当瓢虫孵化后，鉴定瓢虫雌雄后配对，单对饲养，采用仅花粉饲料与花粉和大豆蚜混合饲料隔天交替饲喂。

花粉直接撒于培养皿底部提供给瓢虫，花粉如果是蜜蜂采集的颗粒状花粉，需要粉碎。

大豆蚜提供方法为把覆满大豆蚜的大豆苗剪成段提供，所述花粉和大豆蚜混合饲料中花粉和大豆蚜的都为足量供应。

所述饲喂体系可以通过将1%琼脂水溶液凝固后与饲料一起提供给瓢虫，给瓢虫提供水源。

优选地，选择蛋白酶抑制剂E-64为阳性对照化合物，以没有混入任何杀虫化合物的饲料作为阴性对照处理。

阳性对照处理蛋白酶抑制剂E-64的用量可以为200-400μg E-64/g花粉。优选为225μgE-64/g花粉。

优选地，每个处理至少测试幼虫45头，成30对，饲料每天更换，测试在26±1℃，75±5%RH，光照16:8H的培养箱中进行，每天分早晚两次观测生命指标。

所述生命指标可以包括生存率、发育历期、新羽化成虫体重和雌虫产卵量中的两种或多种。

采用本方法测定了龟纹瓢虫对不同浓度已知毒性化合物E-64的生物学反应，龟纹瓢虫的不同生命参数随E-64浓度的变化显示出明显的剂量-效应关系，证明了该方法的有效性和灵敏性。本发明所提供的方法简单可行，能有效地测定不同胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白如Bt蛋白对瓢虫类天敌昆虫的直接毒性影响。

附图说明

图1.利用本发明提供的饲喂体系瓢虫幼虫在不同龄期取食花粉量的情况；

图2.利用本发明提供的方法测得的取食含不同浓度蛋白酶抑制剂E-64饲料的龟纹瓢虫生存曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种简单灵敏地检测胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对龟纹瓢虫直接毒性影响的测定方法。该方法通过把杀虫剂或转基因杀虫蛋白均匀地混入所建立的以花粉为基础的饲料直接饲喂给龟纹瓢虫，并以混入蛋白酶抑制剂E-64的饲料（225μg E-64/g花粉）为阳性对照，以没有混入任何杀虫化合物的饲料为阴性对照，通过比较处理组和对照组瓢虫生存率、发育历期、体重和产卵量等重要生命指标评价杀虫化合物的潜在毒性。采用本方法测定了龟纹瓢虫对不同浓度E-64的生物学反应，龟纹瓢虫的不同生命参数随E-64浓度的变化显示出明显的剂量-效应关系，证明了该方法的有效性和灵敏性。本发明所提供的方法简单可行，能有效地测定不同胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白如Bt蛋白对瓢虫类天敌昆虫的直接毒性影响。

1毒性测定体系的构建

下面说明本发明提供的胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对龟纹瓢虫毒性影响的测定方法的一种具体实施方式。

建立测定杀虫化合物对受试昆虫的直接毒性，首先需要一个合适的昆虫饲料，通过该饲料把杀虫化合物饲喂给受试昆虫（Romeis et al.,2011;Li et al.,2013）。基于龟纹瓢虫取食花粉的习性，发展了一个以油菜花粉为基础的龟纹瓢虫饲料。在该饲喂体系中，在龟纹瓢虫幼虫每个龄期第一天仅提供花粉，之后采用花粉和大豆蚜混合饲料饲喂瓢虫直至下一龄期。当瓢虫孵化后，鉴定瓢虫雌雄后配对，单对饲养。采用仅花粉饲料与花粉和大豆蚜混合饲料隔天交替饲喂。花粉提供方法为市售的颗粒状油菜花粉先用研钵磨碎后，直接撒在培养皿底部；大豆蚜虫提供方法为把覆满大豆蚜的大豆苗剪成2cm的小段，直接置于培养皿中。花粉和大豆蚜都为足量提供。为给瓢虫提供水源，1%的琼脂熔解后，加入1.5ml的去盖离心管，凝固后与饲料一起提供给瓢虫。

基于所建立的瓢虫饲喂体系，建立了杀虫化合物对瓢虫毒性影响的测定体系，测定体系包括以下处理：1）阴性对照处理：花粉中不添加受试化合物；2）花粉中按一定浓度（根据需要）均匀混入受试杀虫剂或转基因杀虫蛋白；3）阳性对照：花粉中均匀混入E-64（浓度一般为200-400μg/g花粉）。初孵幼虫单头饲养于塑料培养皿中(6.0cm直径,1.5cm高)，每个处理推荐至少测试45头瓢虫幼虫。如果检测杀虫化合物对瓢虫繁殖力的影响，新羽化的瓢虫成虫配对饲养于上述培养皿中，每个培养皿中放置3-5个折叠纸条（10cm长，1cm宽）作为瓢虫产卵介质。每个处理至少测试30对瓢虫。如上述方式提供瓢虫幼虫和成虫饲料。饲料每天更换，保证测试化合物生物活性。试验在26±1℃，75±5%RH，光照16:8H的培养箱中进行。每天上午9点和下午9点观察瓢虫生长发育，记录死亡率、生长历期、新羽化成虫体重和雌虫产卵量等生命参数。获得数据后，采用合适的生物统计方法分析比较处理组和阴性对照组瓢虫不同生命参数的差异。

2以花粉为基础的饲喂体系有效性验证

2.1花粉摄入量测定

在本毒性测定体系中，油菜花粉作为杀虫剂或转基因杀虫蛋白的载体，因此瓢虫只有足量取食到花粉才能起到把受试化合物有效传递给瓢虫的作用。为了验证所建立的饲喂体系瓢虫能够取食到大量花粉以满足把足量受试杀虫化合物传递给瓢虫的需要，开展了花粉取适量检测试验，实验步骤为：1）采用上述方法饲喂瓢虫幼虫；2）在每个龄期瓢虫幼虫取食花粉1天后，收集10头幼虫；3）解剖幼虫，取出瓢虫幼虫整个消化道；4）把瓢虫消化道中的花粉粒均匀混入一定量品红溶液中，提取一定量溶液，在解剖镜下查花粉粒的数量，然后计算整个幼虫消化道中的花粉粒数。再根据油菜花粉粒的平均干质量9.8ng/粒，计算不同龄期幼虫体内含油菜花粉量。

结果发现：龟纹瓢虫幼虫从1龄到4龄分别取食6.9±1.1,15.8±3.1,47.8±6.5and155.7±15.9μg油菜花粉（图1）。这说明通过该饲喂体系，龟纹瓢虫能取食到大量花粉，这样就可把足量的混入花粉的受试杀虫化合物传递给瓢虫。

2.2花粉饲料对瓢虫生长发育的影响

在该毒性测定体系中，所采用的饲料必须能满足所测定昆虫基本的正常生长发育（一般要求存活率>80%）(Romeis et al.,2011;Li et al.,2013)。试验检测了毒性测定体系中所采用饲料对瓢虫生长发育的影响。试验设立两个处理：1）瓢虫从孵化到成虫，持续取食大豆蚜；2）瓢虫取食花粉和蚜虫。花粉和蚜虫供应方式如上述。每个处理测试75个虫子。每天上午9点和下午9点观察瓢虫生长发育，记录死亡率、生长历期、新羽化成虫体重和雌虫产卵量等生命参数。试验在26±1℃，75±5%RH，光照16:8H的培养箱中进行。

生物测定结果显示：取食花粉和蚜虫的瓢虫幼虫化蛹率达92%，羽化率达90%，与取食蚜虫的瓢虫组均无明显差异(P>0.05)。同样，羽化成虫体重方面，两个处理间也没有显著差异。然而，与持续取食蚜虫的瓢虫相比，取食花粉和蚜虫的瓢虫幼虫发育历期有所延长（P<0.001），而雌虫产卵量显著提高(P<0.01)(表1)。结果说明，取食花粉和蚜虫饲料，瓢虫幼虫历期虽有所延长，但生存率（>80%）与持续取食蚜虫的瓢虫没有差异，且取食该饲料的瓢虫成虫的繁殖力明显增强。因此，所建立的瓢虫饲喂体系适合用于杀虫化合物对瓢虫毒性影响的测定体系。

表1.取食不同饲料的瓢虫生命表参数

^a卡方检验；^b Mann-Whitney U检验；^c学生t检验.平均值后面加“*”表示与对照（大豆蚜处理）间有显著性差异（P<0.05）

3毒性测定方法的有效性和灵敏性验证

为了验证该所建立的瓢虫毒性测定方法的有效性和灵敏性，即试验体系是否能彰显受试化合物的毒性。通过所建立的测定体系，把已知对龟纹瓢虫有毒的蛋白酶抑制剂E-64按照以下浓度0，75，225，450μg/g花粉均匀混入花粉。每个饲料处理设立45个重复，即45头瓢虫幼虫，按照上述方法饲喂瓢虫，研究不同E-64处理对瓢虫不同生命参数的影响。

结果如下：对照组有95%幼虫发育至成虫。然而，随着E-64浓度的升高，幼虫存活率逐渐下降。生存曲线分析显示：E-64浓度在75μg/g时，瓢虫存活率与对照组无明显差异(P=0.23)；而当E-64浓度在225μg/g和450μg/g时，存活率与对照比明显降低(both P<0.001)(图2)。同样，瓢虫化蛹率、羽化率、幼虫发育历期等参数也存在相似的剂量反应。结果表明，本发明提供龟纹瓢虫毒性影响测定体系具有较高的灵敏性，可有效用于检测不同胃毒杀虫剂或转基因杀虫蛋白对瓢虫的潜在负面影响。

基于以上生物测定试验，可以得出以下结论：

1)所发展的以花粉为基础的饲料能满足瓢虫的正常生长发育，完成整个生活史。在该饲喂体系，花粉可作为载体把受试杀虫剂或转基因杀虫蛋白足量地传递给龟纹瓢虫；

2)通过用E-64作为模式毒性化合物验证了所建立的龟纹瓢虫毒性测定方法有效性和灵敏性；

3)本发明提供一种简单可行、可有效测定胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白如Bt蛋白对瓢虫类天敌昆虫的毒性影响的试验方法。

Claims (5)

1.胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对龟纹瓢虫毒性影响的测定方法，其特征在于，通过把胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白均匀地混入龟纹瓢虫饲料直接饲喂龟纹瓢虫，通过直接观察龟纹瓢虫的生命指标评价胃毒性杀虫剂或转基因杀虫蛋白对龟纹瓢虫毒性影响，所述龟纹瓢虫饲料的主要成分为花粉，所述花粉为油菜花粉，饲喂龟纹瓢虫的饲喂体系为：在龟纹瓢虫幼虫每个龄期第一天仅提供花粉，之后采用花粉和大豆蚜混合饲料饲喂瓢虫直至下一龄期，当瓢虫孵化后，鉴定瓢虫雌雄后配对，单对饲养，采用仅花粉饲料与花粉和大豆蚜混合饲料隔天交替饲喂，花粉直接撒于培养皿底部提供给瓢虫，大豆蚜提供方法为把覆满大豆蚜的大豆苗剪成段提供，所述花粉和大豆蚜混合饲料中花粉和大豆蚜都为足量供应，在该测定方法中，选择蛋白酶抑制剂E-64为阳性对照化合物，以没有混入任何杀虫化合物的饲料作为阴性对照处理，阳性对照处理蛋白酶抑制剂E-64的用量为200-400μg E-64/g花粉。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述饲喂体系通过将1％琼脂水溶液凝固后与饲料一起提供给瓢虫，给瓢虫提供水源。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，阳性对照化合物蛋白酶抑制剂E-64的用量为225μg E-64/g花粉。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，每个处理至少测试幼虫45头瓢虫，成虫至少30对，饲料每天更换，测试在26±1℃，75±5％RH，光照16:8H的培养箱中进行，每天分早晚两次观测生命指标。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述生命指标包括生存率、发育历期、新羽化成虫体重和雌虫产卵量中的两种或多种。