CN103039720A - 中华草蛉幼虫人工饲料及杀虫化合物对草蛉幼虫毒性影响的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中华草蛉幼虫人工饲料及杀虫化合物对草蛉幼虫毒性影响的测定方法，该方法利用混入了需要检测的杀虫化合物的人工饲料饲喂中华草蛉幼虫，通过中华草蛉幼虫生长发育指标评价所述杀虫化合物对中华草蛉幼虫的潜在毒性。中华草蛉幼虫生长发育指标可以选自中华草蛉幼虫的生存率、历期和体重的一种或多种。该方法采用无机化合物砷酸二氢钾36μg/g饲料和/或有机化合物雪花凝聚素1重量％饲料作为阳性对照化合物；纯饲料处理作为阴性对照。利用本发明提供的中华草蛉幼虫人工饲料，草蛉幼虫的生存率、幼虫体重、生长历期都显示出明显的剂量-效应关系，本发明提供的测定方法具有较高的灵敏度，适合用于评价外源杀虫蛋白对中华草蛉的潜在毒性。
Description
技术领域
本发明涉及中华草蛉幼虫人工饲料及杀虫化合物对草蛉幼虫毒性影响的测定方法。
背景技术
草蛉如普通草蛉(Chrysoperla carnea Stephens)和中华草蛉(Chrysoperla sinicaTjeder)的地理分布非常广泛，是多种粮食和经济作物上重要的捕食性昆虫天敌。另外，由于草蛉容易在实验室条件下规模化饲养，便宜试验操作，因此其常作为指示性生物被用于杀虫剂和转基因抗虫作物的环境风险评价。
当评价杀虫剂和转基因抗虫作物对非靶标生物影响时，首要的工作是研究杀虫剂或转基因抗虫作物表达的外源杀虫蛋白(以下统称杀虫化合物)对所选非靶标生物的直接毒性。开展这样的试验工作，需要发展一种可以把杀虫化合物直接饲喂给受试生物的生物测定体系。当前，评价杀虫化合物对草蛉成虫(如C. carnea和C. sinica)直接毒性影响的试验体系已经建立起来，并已成功的用于转基因抗虫植物环境风险评价试验中。然而，截至目前，还没有一种适合于评价杀虫化合物对草蛉幼虫直接毒性的试验方法。因此，通过建立一种合适的草蛉幼虫人工饲料，基于该人工饲料发展一个可以快速评价杀虫化合物对草蛉幼虫潜在毒性影响的试验模型是十分必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种中华草蛉幼虫人工饲料及能够快速评价杀虫化合物对中华草蛉潜在毒性的测定方法。
本发明提供的杀虫蛋白对中华草蛉幼虫潜在毒性影响的测定方法，利用混入了需要检测的杀虫化合物的人工饲料饲喂中华草蛉幼虫，通过中华草蛉幼虫生长发育指标评价所述杀虫化合物对中华草蛉幼虫的潜在毒性，所述人工饲料含有如下有效成分：
| 成分 | 重量份 | 成分 | 重量份 |
| 新鲜牛肉 | 20-25 | 头孢霉素 | 0.03-0.08 |
| 新鲜猪肝 | 5-10 | 烟酸 | 0.0003-0.0005 |
| 鸡蛋黄 | 15-25 | 泛酸钙 | 0.001-0.002 |
| 蔗糖 | 2-5 | 核黄素 | 0.0001-0.0003 |
| 酵母 | 3-5 | 盐酸吡哆辛 | 0.00005-0.00015 |
| 蜂蜜 | 1-2 | 盐酸硫胺 | 0.00005-0.00015 |
| 麦胚油 | 0.2-0.3 | 叶酸 | 0.00005-0.00015 |
| 山梨酸钾 | 0.1-0.2 | 生物素 | 0.00005-0.00015 |
| 抗坏血酸 | 0.1-0.15 | 氰钴胺素 | 0.0000005-0.0000015 |
| 硫酸链霉素 | 0.03-0.08 |
所述有效成分的较佳用量如下：
| 成分 | 重量份 | 成分 | 重量份 |
| 新鲜牛肉 | 22-23 | 头孢霉素 | 0.03-0.08 |
| 新鲜猪肝 | 7-8 | 烟酸 | 0.0003-0.0005 |
| 鸡蛋黄 | 18-22 | 泛酸钙 | 0.001-0.002 |
| 蔗糖 | 3-4.5 | 核黄素 | 0.0001-0.0003 |
| 酵母 | 3.5-4.5 | 盐酸吡哆辛 | 0.00005-0.00015 |
| 蜂蜜 | 1.2-1.5 | 盐酸硫胺 | 0.00005-0.00015 |
| 麦胚油 | 0.2-0.3 | 叶酸 | 0.00005-0.00015 |
| 山梨酸钾 | 0.1-0.2 | 生物素 | 0.00005-0.00015 |
| 抗坏血酸 | 0.1-0.15 | 氰钴胺素 | 0.0000005-0.0000015 |
| 硫酸链霉素 | 0.03-0.08 |
例如，所述有效成分的用量如下：
较佳地，所述人工饲料采用如下方法配置而成：
1)将烟酸、泛酸钙、核黄素、盐酸吡哆辛、盐酸硫胺、叶酸、生物素、氰钴胺素按照上述重量份配置维生素复合液，并配置蜂蜜水，4℃冰箱保存；2)将新鲜牛肉和新鲜猪肝加入重量为两者重量和的0.2-1.5倍的蒸馏水，置于搅拌机中粉碎搅拌成糊状，得到组分A，3)称取蔗糖、酵母粉、山梨酸钾、抗坏血酸、硫酸链霉素、头孢霉素和麦胚油，然后与维生素复合液及蜂蜜水混合，把最终混合液加入组分A；4)取鸡蛋黄置于容器中，加入重量为其0.4-1.2倍的蒸馏水，搅拌均匀，在水浴锅中80-90℃加热2-4分钟，边加热边搅拌，得到组分B；5)待组分B冷至室温，与组分A混合物混合，使各有效组分的用量如表所示，并且水的总加入量为15-70重量份，即得所述人工饲料。
更具体地，所述人工饲料例如采用如下方法配置而成：
1)配置维生素复合液，其中，每100ml水中含有烟酸0.31g，泛酸钙1.31g，核黄素0.15g，盐酸吡哆辛0.08g，盐酸硫胺0.08g，叶酸0.08g，生物素0.06g，氰钴胺素0.0006g，并配置40％蜂蜜水，4℃冰箱保存；
2)称取新鲜牛肉和新鲜猪肝，加入适量蒸馏水，置于搅拌机中粉碎搅拌，得到组分A；
3)称取蔗糖、酵母粉、山梨酸钾、抗坏血酸、硫酸链霉素、头孢霉素和麦胚油溶解于适量蒸馏水中，然后与维生素复合液及40％的蜂蜜水混合，把最终混合液加入组分A；
4)取新鲜鸡蛋一个，敲一小洞，待蛋清自然流尽，称取一定量鸡蛋黄置于100ml小烧杯中，加入适量蒸馏水，搅拌均匀，在水浴锅中85℃加热3分钟，边加热边搅拌，得到组分B；
5)待组分B冷至室温，与组分A混合物混合，充分搅拌均匀，-20℃保存；
6)饲料提供给草蛉幼虫前需要制成胶囊：将石蜡封口膜剪成1cm方块，拉伸3倍后，包上饲料，把封口捏紧，制成胶囊，即成所述人工饲料，
其中，以上各组分中的相对含量如下：
所述中华草蛉幼虫生长发育指标选自中华草蛉幼虫的存活率、历期和体重的一种或多种。
该方法可以采用无机化合物砷酸二氢钾36μg/g饲料和/或有机化合物雪花凝聚素1重量％饲料作为阳性对照化合物；纯饲料处理作为阴性对照。
较佳地，该方法按如下步骤进行操作：
1)配制所述人工饲料；
2)把需要检测的杀虫蛋白溶入蒸馏水，直接加入人工饲料，充分搅匀；
3)采用无机化合物砷酸二氢钾36μg/g饲料或有机化合物雪花凝聚素1重量％饲料作为阳性对照化合物，纯饲料处理作为阴性对照；
4)将初孵中华草蛉幼虫单头接入饲养容器中，每个处理至少设35个重复，饲料每两天更换一次；
5)每天上午固定时点和晚上固定时点观察草蛉生长发育情况，记录死亡率、七天幼虫体重和幼虫生长历期，直至成虫羽化，
6)通过比较阴性对照组、处理组和阳性对照组中华草蛉幼虫的生长发育参数测定受试杀虫化合物对草蛉幼虫的潜在毒性。
上述任一种测定方法中用到的人工饲料都是本发明要保护的中华草蛉幼虫人工饲料。
利用本发明提供的中华草蛉幼虫人工饲料，草蛉幼虫的生存率、幼虫体重、生长历期都显示出明显的剂量-效应关系，表明本发明利用该人工饲料所建立的毒性测定方法具有较高的灵敏度，适合用于评价转基因抗虫作物表达的外源杀虫蛋白对草蛉的潜在毒性。
附图说明
图1取食含不同浓度砷酸二氢钾饲料的中华草蛉幼虫生存曲线(取食时间的单位为天)。
具体实施方式
1.简介
当评价杀虫剂和转基因抗虫作物对非靶标生物影响时，首要的工作是研究杀虫剂或转基因抗虫作物表达的外源杀虫蛋白(以下统称杀虫化合物)对所选非靶标生物的直接毒性。开展这样的试验工作，需要发展一种可以把杀虫化合物直接饲喂给受试生物的生物测定体系。本发明提供一种高效的中华草蛉幼虫人工饲料，基于该人工饲料，建立了评价杀虫化合物对草蛉幼虫潜在毒性影响的试验模型。下面对发明所提供的草蛉幼虫人工饲料和毒性测定模型进行详细说明。
2.材料与方法
2.1供试虫源
基于前人报道的用于饲养普通草蛉幼虫(C. carnea)和饲养日本通草蛉幼虫(C. nippoensis)的两例半固体人工饲料配方(Sattar et al.，2007；Li et al.，2010)，发展了一种能满足中华草蛉幼虫营养需求的半液体人工饲料(表1)。
下面例举本发明用到的人工饲料的配方和制备方法。
表1.草蛉幼虫人工饲料配方
注：维生素液配方包括烟酸(0.31g)，泛酸钙(1.31g)，核黄素(0.15g)，盐酸吡哆辛(0.08g)，盐酸硫胺(0.08g)，叶酸(0.08g)，生物素(0.06g)，氰钴胺素(0.0006g)，蒸馏水(100ml).
制备方法：
1)首先配置维生素液复合液和40％蜂蜜水，4℃冰箱保存；
2)称取新鲜牛肉和新鲜猪肝，加入适量蒸馏水，置于搅拌机中粉碎搅拌，得到组分A；
3)称取蔗糖、酵母粉、山梨酸钾、抗坏血酸、硫酸链霉素、头孢霉素和麦胚油溶解于适量蒸馏水中，然后与维生素复合液及40％的蜂蜜水混合，把最终混合液加入组分A；
4)取新鲜鸡蛋一个，敲一小洞，待蛋清自然流尽，称取一定量鸡蛋黄置于100ml小烧杯中，加入适量蒸馏水，搅拌均匀，在水浴锅中85℃加热3分钟，边加热边搅拌，得到组分B；
5)待组分B冷至室温，与组分A混合物混合，充分搅拌均匀，-20℃保存；
6)饲料提供给草蛉幼虫前需要制成胶囊：将石蜡封口膜(parafilm M，USA)剪成1cm方块，拉伸3倍后，包上50ul左右饲料，把封口捏紧，制成胶囊。
2.3人工饲料的有效性
为了检验所发明的人工饲料是否能保证草蛉幼虫的正常生长发育，适合用于建立毒性检测模型，我们开展了草蛉幼虫生存适合度试验。试验设两个饲料处理：处理一，草蛉幼虫取食自然饲料，将布满蚜虫的豆芽剪成合适长度，放入玻璃指形管中(直径1.2cm，长7.5cm)，将初孵草蛉幼虫单头置于指形管，塞上棉塞。蚜虫每天更换，保证食物足量供应；处理二，与处理一相似，把蚜虫换成用石蜡膜包裹的人工饲料，饲料每两天更换一次。每个处理设35个重复，共用初孵草蛉幼虫70头。生测试验在人工气候箱内(26±1℃；RH75±5％；光照L∶D=16∶8h)进行。每天上午9点和晚上9点观察草蛉生长发育情况，记录死亡率、生长历期和7天幼虫体重。
2.4毒性测定方法
理论上建立一个高效的毒力测定模型需要满足以下几个要求：1)所采用的人工饲料能保证受试生物的正常生长发育，对于幼虫人工饲料，一般要求整个幼虫生育期死亡率小于20％；2)杀虫化合物能均匀地混入饲料中；3)化合物在饲料中能保持相对稳定性和生物活性；4)设立合适的已知毒性化合物作为阳性对照；5)选择合适的受试生物生命参数作为评价指标。根据这些要求和我们试验结果，我们构建了评价杀虫化合物对中华草蛉幼虫潜在毒性的测定方法：
1)按照人工饲料配方要求配置中华草蛉幼虫人工饲料(配置饲料时，需要留出适量蒸馏水以溶解测试化合物)；
2)把测试杀虫化合物如Bt杀虫蛋白溶入蒸馏水，直接加入人工饲料，充分搅匀；
3)以不加杀虫化合物的纯人工饲料作为阴性对照，以含无机化合物砷酸二氢钾(Potassium arsenate，PA；36μg/g饲料)或有机化合物雪花凝聚素(GNA；1％饲料)的饲料作为阳性对照处理；
4)把单个饲料胶囊至于指形管中(直径1.2cm，长7.5cm)，每个指形管接入一头初孵草蛉幼虫。每个处理至少设35个重复，饲料每两天更换一次；
5)每天上午9点和下午9点观察草蛉生长发育情况，记录死亡率、七天幼虫体重和幼虫生长历期，直至成虫羽化。
6)通过比较阴性对照组、处理组和阳性对照组草蛉幼虫的生长发育参数测定受试杀虫化合物对草蛉幼虫的潜在毒性。
2.5毒性测定方法的有效性验证
为了验证所构建毒力测定模型的有效性和敏感性，本研究以砷酸二氢钾为模式毒性化合物，基于所建立的试验模型，检测不同浓度砷酸二氢钾对中华草蛉幼虫的毒性影响。按照2.4的要求，把PA分别按照以下浓度0，12，24和48μg/g四个浓度混入饲料。把制成胶囊的饲料单个至于玻璃指形管中(直径1.2cm，长7.5cm)，每个指形管接入一头初孵草蛉幼虫。每个饲料处理设32至35个重复。饲料每两天更换一次。生测试验在人工气候箱内(26±1℃；RH75±5％；光照L∶D=16∶8h)进行。每天上午9点和晚上9点观察草蛉生长发育情况，记录幼虫死亡率、生长历期和7天幼虫体重。
2.6数据处理
草蛉幼虫化蛹率和成虫羽化率采用卡方检验法分析；草蛉发育历期用Mann-Whitney或Kruskal Wallis检验分析；幼虫体重数据符合正态分布，适合参数分析的要求，采用Student-t检验或One-way ANOVA方法分析。所有的分析都用SPSS软件分析(版本13.0)。
3.结果与分析
3.1取食人工饲料的草蛉幼虫适合度
试验结果表明，取食人工饲料的草蛉幼虫与取食蚜虫的7天幼虫体重、幼虫历期、化蛹率和羽化率均无显著性差异(P>0.05)，且幼虫生存率在90％以上，说明人工饲料能满足草蛉的正常生长发育，符合建立性毒性测定模型的要求(表2)。
表2.取食蚜虫和人工饲料的草蛉幼虫生命表参数
a卡方检验；b学生t检验；cU检验。相同纵栏中数值后跟相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)。
3.2毒力测定模型敏感性验证
试验结果显示：随着饲料中PA浓度的增加，草蛉幼虫的生存率、体重和历期都呈现明显的剂量反应关系。PA浓度提高，幼虫生存率下降、体重减轻、历期延长。当PA浓度达到48μg/g饲料时，没有幼虫能化蛹(表3和图1)。
表3.取食含不同浓度PA人工饲料的草蛉幼虫生命表参数
a卡方检验；bone-way ANOVA；cU检验。相同纵栏中数值后跟相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)。
4.讨论
当评价杀虫剂和转基因抗虫作物对非靶标生物的影响时，首要的工作是研究杀虫剂或转基因抗虫作物表达的外源杀虫蛋白(以下统称杀虫化合物)对所选非靶标生物的直接毒性。开展这样的工作，需要发展一种可以把杀虫化合物直接饲喂给受试生物的试验体系。本发明提供了一种用于中华草蛉幼虫饲养的半液体人工饲料及一套评价不同胃毒性杀虫化合物对草蛉幼虫毒性影响的试验体系。通过生物测定试验，证明了本发明所提供的人工饲料能维持草蛉幼虫的正常生长发育，满足了建立毒性测定模型的要求；另外，用PA作为模式化合物，验证的毒性测定体系的有效性，适合用于评价传统杀虫剂及转基因抗虫作物表达的外源杀虫蛋白对草蛉幼虫的潜在毒性影响。
Claims (9)
1.杀虫化合物对草蛉幼虫毒性影响的测定方法，利用混入了需要检测的杀虫化合物的人工饲料饲喂中华草蛉幼虫，通过中华草蛉幼虫生长发育指标评价所述杀虫化合物对中华草蛉幼虫的潜在毒性，其特征在于，所述人工饲料含有如下有效成分：
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述有效成分的用量如下：
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述有效成分的用量如下：
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述人工饲料采用如下方法配置而成：1)将烟酸、泛酸钙、核黄素、盐酸吡哆辛、盐酸硫胺、叶酸、生物素、氰钴胺素按照上述重量份配置维生素复合液，并配置蜂蜜水，4℃冰箱保存；2)将新鲜牛肉和新鲜猪肝加入重量为两者重量和的0.2-1.5倍的蒸馏水，置于搅拌机中粉碎搅拌成糊状，得到组分A，3)称取蔗糖、酵母粉、山梨酸钾、抗坏血酸、硫酸链霉素、头孢霉素和麦胚油，然后与维生素复合液及蜂蜜水混合，把最终混合液加入组分A；4)取鸡蛋黄置于容器中，加入重量为其0.4-1.2倍的蒸馏水，搅拌均匀，在水浴锅中80-90℃加热2-4分钟，边加热边搅拌，得到组分B；5)待组分B冷至室温，与组分A混合物混合，使各有效组分的用量如表所示，并且水的总加入量为15-70重量份，即得所述人工饲料。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述人工饲料采用如下方法配置而成：
1)配置维生素复合液，其中，每100ml水中含有烟酸0.31g，泛酸钙1.31g，核黄素0.15g，盐酸吡哆辛0.08g，盐酸硫胺0.08g，叶酸0.08g，生物素0.06g，氰钴胺素0.0006g，并配置40％蜂蜜水，4℃冰箱保存；
2)称取新鲜牛肉和新鲜猪肝，加入适量蒸馏水，置于搅拌机中粉碎搅拌，得到组分A；
3)称取蔗糖、酵母粉、山梨酸钾、抗坏血酸、硫酸链霉素、头孢霉素和麦胚油溶解于适量蒸馏水中，然后与维生素复合液及40％的蜂蜜水混合，把最终混合液加入组分A；
4)取新鲜鸡蛋一个，敲一小洞，待蛋清自然流尽，称取一定量鸡蛋黄置于100ml小烧杯中，加入适量蒸馏水，搅拌均匀，在水浴锅中85℃加热3分钟，边加热边搅拌，得到组分B；
5)待组分B冷至室温，与组分A混合物混合，充分搅拌均匀，-20℃保存；
6)饲料提供给草蛉幼虫前需要制成胶囊：将石蜡封口膜剪成1cm方块，拉伸3倍后，包上饲料，把封口捏紧，制成胶囊，即成所述人工饲料，
其中，以上各组分中的相对含量如下：
6.根据权利要求1-5任一项所述的测定方法，其特征在于，所述中华草蛉幼虫生长发育指标选自中华草蛉幼虫的存活率、历期和体重的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，该方法采用无机化合物砷酸二氢钾36μg/g饲料或有机化合物雪花凝聚素1重量％饲料作为阳性对照化合物；纯饲料处理作为阴性对照。
8.根据权利要求1-5任一项所述的测定方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)配制所述人工饲料；
2)把需要检测的杀虫蛋白溶入蒸馏水，直接加入人工饲料，充分搅匀；
3)采用无机化合物砷酸二氢钾36μg/g饲料或有机化合物雪花凝聚素1重量％饲料作为阳性对照化合物，纯饲料处理作为阴性对照；
4)将初孵中华草蛉幼虫单头接入饲养容器中，每个处理至少设35个重复，饲料每两天更换一次；
5)每天上午固定时点和晚上固定时点观察草蛉生长发育情况，记录死亡率、七天幼虫体重和幼虫生长历期，直至成虫羽化；
6)通过比较阴性对照组、处理组和阳性对照组中华草蛉幼虫的生长发育参数测定受试杀虫化合物对草蛉幼虫的潜在毒性。
9.一种中华草蛉幼虫人工饲料，其特征在于，该中华草蛉幼虫人工饲料为权利要求1-6任一项所述的测定方法中用到的所述人工饲料。
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