CN102608307A

CN102608307A - 杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性影响的测定方法

Info

Publication number: CN102608307A
Application number: CN2012100638850A
Authority: CN
Inventors: 林克剑; 王增霞; 李云河; 刘泽文; 彭于发
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-03-12
Filing date: 2012-03-12
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2032-03-12
Also published as: CN102608307B

Abstract

本发明提供了杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其首先确立了对灰飞虱毒性测定体系有效的人工饲料，发展了把不同有机或无机杀虫化合物加入人工饲料的技术和方法，筛选了适合可用于测定体系的阳性对照化合物(蛋白酶抑制剂E-64或无机化合物砷酸二氢钾PA)，经试验研究提出了适合的灰飞虱毒性影响评价指标，并利用E-64和PA作为模式化合物，通过剂量反应生测试验验证了所建立灰飞虱毒性测定方法的有效性和敏感性，最终建立了系统、敏感的评价杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性影响的测定方法。本发明可以用于评价转基因抗虫作物表达的外源杀虫蛋白对灰飞虱的潜在毒性、筛选对灰飞虱具有抗性的新型杀虫蛋白基因、也可用于测定不同杀虫剂对灰飞虱的潜在影响。

Description

杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性影响的测定方法

技术领域

本发明涉及杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法。

背景技术

自1996年转基因Bt植物在美国首次商业化种植以来，转基因作物在全球的种植面积持续快速增长。根据ISAAA公布的数据表明，2010年全球转基因作物种植面积已达到了1.48亿公顷(James，2010)，其中具有抗虫特性的转基因作物0.586亿公顷，占总种植面积的37.5％。转Bt抗虫植物的种植能有效减少广谱化学杀虫剂的使用，降低了农药对环境的污染，保护了人类健康。

转基因抗虫植物的利用是作物害虫防治技术的一次巨大绿色变革。然而，像其他害虫防治措施一样，其为人类带来利益的同时，也可能会对环境造成潜在的生态风险。转基因抗虫作物对非靶标生物的潜在影响是有关转基因作物环境风险评价中关注的一个焦点。目前，在转基因植物的非靶标生物影响方面，国际上已逐渐形成了一套被风险评估工作者广泛采用的分层次评价程序(Romeis et al.，2008；王圆圆等，2011)。在该评价程序中，第一步(层)需要鉴定转基因作物表达的杀虫蛋白对受试非靶标生物的潜在毒性，被称之为Tier-1毒性测定试验。简单的说，就是发展合适的人工饲料或其它杀虫蛋白载体把高剂量的、具有杀虫活性的杀虫蛋白传递给受试生物，设立合适的阴性和阳性对照，通过比较杀虫蛋白处理和阴性和阳性对照处理间的受试生物生长发育及其它生理生化参数，评价杀虫化合物对该生物的潜在毒性。这样的毒性测定模型不但可以用于评价转基因抗虫作物对非靶标受试生物的潜在风险，还有可以用于筛选对受试昆虫具有杀虫活性的新基因(Li et al.，2011)。

灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallén)属半翅目飞虱科，主要分布于从菲律宾至西伯利亚与欧洲的温带地区，在我国分布十分广泛，尤其是在长江流域及华北地区。它不仅直接刺吸危害水稻、小麦、玉米、高粱等作物。更重要的是传播水稻条纹叶枯病、黑条矮缩病及玉米粗缩病等病毒病害。在亚洲，长期化学防治已导致该虫对有机氯、有机磷及氨基甲酸酯类等多种杀虫剂产生了抗性。发展转基因抗虫作物可能是防治稻飞虱的有效措施。然而，当前培育的转基因抗虫水稻都只对鳞翅目害虫有较好抗性，至今还没有发现对飞虱有高效抗性的杀虫基因。

发明内容

为了高效筛选对该类害虫有抗性效果的杀虫基因，并评价当前已经培育成功的转基因抗虫水稻表达的外源杀虫蛋白及不同杀虫剂对灰飞虱的潜在影响，专利申请人通过试验研究，其首先确立了对灰飞虱毒性测定体系有效的人工饲料，发展了把不同有机或无机杀虫化合物加入人工饲料的技术和方法，筛选了适合可用于测定体系的阳性对照化合物(蛋白酶抑制剂E-64或无机化合物砷酸二氢钾PA)，经试验研究提出了适合的灰飞虱毒性影响评价指标，并利用E-64和PA作为模式化合物，通过剂量反应生测试验验证了所建立灰飞虱毒性测定方法的有效性和敏感性，最终建立了系统、敏感的评价杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性影响的测定方法。本发明提供的一套杀虫化合物(纯杀虫蛋白或其它毒性化合物)对灰飞虱潜在毒性的测定方法，以期为新型杀虫基因的筛选、转基因抗虫植物的环境安全评价及杀虫剂毒性测定提供技术支撑。

本发明提供的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法利用混入了需要检测的杀虫化合物的人工饲料供灰飞虱取食，通过选择合适的灰飞虱生长发育指标评价所述杀虫化合物对灰飞虱的潜在毒性，所述人工饲料为含有氨基酸、维生素、无机盐和蔗糖的水溶液，以mg/100ml为浓度单位，所述氨基酸包括如下组分：L-盐酸精氨酸150-200，L-天冬酰胺酸200-250，L-谷氨酸220-280，L-谷氨酰胺180-230，L-组氨酸65-85，L-蛋氨酸65-85，L-亮氨酸210-270，L-赖氨酸盐酸盐180-210，L-苯丙氨酸180-220，L-丝胺酸350-450，L-缬氨酸260-330。

较佳地，以mg/100ml为浓度单位，所述氨基酸还包括如下组分：L-丙氨酸100-150，L-天冬氨酸90-110，L-异亮氨酸90-110，L-脯氨酸90-110，L-苏氨酸100-150，L-色氨酸90-120。

较佳地，以mg/100ml为浓度单位，所述氨基酸还包括如下组分：甘氨酸25-35，L-半胱氨酸70-90，L-胱氨酸盐酸盐15-25，γ-氨基丁酸8-12，L-酪氨酸8-12。

较佳地，所述维生素包括如下组分：生物素0.03-0.07，泛酸钙3-7，氯化胆硷40-60，叶酸0.3-0.7，肌醇45-55，烟酸12-18，盐酸吡哆辛2-3，核黄素0.3-0.7，盐酸硫胺素2-3，维生素C 80-120；所述无机盐还包括如下组分：CaCl₂·2H₂O 3-3.3，CuCl₂·2H₂O 0.2-0.35，FeCl₃·6H₂O 2-2.5，MnCl₂·4H₂O 0.5-1，氯化锌0.3-0.5，六水氯化镁180-220，磷酸二氢钾450-550；所述蔗糖的浓度为6000-12000。

更佳地，所述人工饲料中含有的氨基酸、维生素、无机盐和蔗糖的组分和浓度如下：

1.氨基酸	mg/100ml	L-脯氨酸	95-105	盐酸吡哆辛	2.2-2.8
						甘氨酸	28-32	L-赖氨酸盐酸盐	190-210	核黄素	0.4-0.6
L-丙氨酸	125-135	L-苯丙氨酸	190-210	盐酸硫胺素	2.2-2.8
						L-盐酸精氨酸	170-180	L-丝胺酸	380-410	维生素C	95-105
L-天冬酰胺酸	220-240	L-苏氨酸	125-135	3.无机盐	mg/100ml
						L-天冬氨酸	95-105	L-色氨酸	100-110	CaCl₂·2H₂O	3-3.2
L-半胱氨酸	75-85	L-酪氨酸	9-11	CuCl₂·2H₂O	0.2-0.3
						L-胱氨酸盐酸盐	18-22	L-缬氨酸	290-310	FeCl₃·6H₂O	2.1-2.3
γ-氨基丁酸	9-11	2.维生素	mg/100ml	MnCl₂·4H₂O	0.7-0.9

L-谷氨酸	240-260	生物素	0.04-0.06	氯化锌	0.3-0.5
						L-谷氨酰胺	200-210	泛酸钙	4-6	六水氯化镁	190-210
L-组氨酸	75-82	氯化胆硷	48-52	磷酸二氢钾	480-520
						L-蛋氨酸	68-75	叶酸	0.4-0.6
L-异亮氨酸	95-105	肌醇	48-52	4.	mg/100ml
						L-亮氨酸	230-250	烟酸	13-17	蔗糖	8000-10000

例如，所述人工饲料中含有的氨基酸、维生素、无机盐和蔗糖的组分和浓度如下：

1.氨基酸	mg/100ml	L-脯氨酸	100	盐酸吡哆辛	2.5
						甘氨酸	30	L-赖氨酸盐酸盐	200	核黄素	0.5
L-丙氨酸	130	L-苯丙氨酸	200	盐酸硫胺素	2.5
						L-盐酸精氨酸	175	L-丝胺酸	400	维生素C	100.0
L-天冬酰胺酸	230	L-苏氨酸	130	3.无机盐	mg/100ml
						L-天冬氨酸	100	L-色氨酸	105	CaCl₂·2H₂O	3.1
L-半胱氨酸	80	L-酪氨酸	10	CuCl₂·2H₂O	0.27
						L-胱氨酸盐酸盐	20	L-缬氨酸	300	FeCl₃·6H₂O	2.23
γ-氨基丁酸	10	2.维生素	mg/100ml	MnCl₂·4H₂O	0.8
						L-谷氨酸	250	生物素	0.05	氯化锌	0.4
L-谷氨酰胺	204	泛酸钙	5.0	六水氯化镁	200
						L-组氨酸	80	氯化胆硷	50.0	磷酸二氢钾	500
L-蛋氨酸	70	叶酸	0.5
						L-异亮氨酸	100	肌醇	50.0	4.	mg/100ml
L-亮氨酸	240	烟酸	15.0	蔗糖	9000

所述灰飞虱生长发育指标可以选自灰飞虱若虫的生存率、若虫历期和新羽化的成虫体重的一种或多种。

该方法可以以含有机化合物蛋白酶抑制剂E-64或无机化合物砷酸二氢钾的人工饲料作为生物测定阳性对照，以纯饲料处理作为阴性对照。

较佳地，该方法包括以下步骤：1)配制人工饲料母液；2)把需要检测的可溶性化合物溶解于适量的蒸馏水或溶液中；3)把毒性化合物溶液混入人工饲料母液，用蒸馏水定容至需要的浓度；4)同样根据前三个步骤配制含一定浓度有机化合物蛋白酶抑制剂E-64或无机化合物砷酸二氢钾的人工饲料作为生物测定阳性对照；5)纯饲料处理作为阴性对照；将初孵灰飞虱若虫单头接入饲养容器中，每个处理设25个以上重复，饲料1-3天更换一次，观察记录灰飞虱生长发育情况，评价各处理对灰飞虱的潜在毒性。

本发明提供的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法能够高度敏感地彰显毒性化合物的毒性。试验结果显示，按照本发明提供的方法，取食不同浓度的E-64或PA，灰飞虱若虫的生存率显示出明显的剂量-效应关系。表明本试验建立的Tier-1毒性测定模型具有较高的灵敏度，可以用于评价转基因抗虫作物表达的外源杀虫蛋白对灰飞虱潜在毒性或用于筛选对灰飞虱具有抗性的新型杀虫基因。

附图说明

图1为取食纯饲料或混入不同浓度E64饲料的灰飞虱生存曲线；

图2为取食纯饲料或混入不同浓度PA饲料的灰飞虱生存曲线。

具体实施方式

本发明提供了杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其首先确定了对灰飞虱毒性测定体系有效的人工饲料，确立把不同有机或无机杀虫化合物加入人工饲料的技术和方法，筛选了适合可用于测定体系的阳性对照化合物(蛋白酶抑制剂E-64或无机化合物砷酸二氢钾PA)，经试验研究提出了适合的灰飞虱毒性影响评价指标，并利用E-64和PA作为模式化合物，通过剂量反应生测试验验证了所建立灰飞虱毒性测定方法的有效性和敏感性，最终建立了系统、敏感的评价杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性影响的测定方法。下面进行详细说明。

1 供试虫源

试验中所用灰飞虱种群采自江苏南京附近稻田，在室内光照培养箱中用‘武育粳3号’感虫品种饲养。饲养条件为温度(27±1℃)，相对湿度(65±5％)，光照比(16∶8(L∶D)h)。试验中所用试虫都是刚孵化出来的若虫。

2 人工饲料

设置三个灰飞虱人工饲料配方和一个对比配方，具体如表1-表4所示。

表1.灰飞虱人工饲料配方一

1.氨基酸	mg/100ml	L-脯氨酸	100	盐酸吡哆辛	2.5
						甘氨酸	30	L-赖氨酸盐酸盐	200	核黄素	0.5
L-丙氨酸	130	L-苯丙氨酸	200	盐酸硫胺素	2.5
						L-盐酸精氨酸	175	L-丝胺酸	400	维生素C	100.0
L-天冬酰胺酸	230	L-苏氨酸	130	3.无机盐	mg/100ml
						L-天冬氨酸	100	L-色氨酸	105	CaCl₂·2H₂O	3.1
L-半胱氨酸	80	L-酪氨酸	10	CuCl₂·2H₂O	0.27
						L-胱氨酸盐酸盐	20	L-缬氨酸	300	FeCl₃·6H₂O	2.23
γ-氨基丁酸	10	2.维生素	mg/100ml	MnCl₂·4H₂O	0.8
						L-谷氨酸	250	生物素	0.05	氯化锌	0.4
L-谷氨酰胺	205	泛酸钙	5.0	六水氯化镁	200

L-组氨酸	80	氯化胆硷	50.0	磷酸二氢钾	500
						L-蛋氨酸	70	叶酸	0.5
L-异亮氨酸	100	肌醇	50.0	4.	mg/100ml
						L-亮氨酸	240	烟酸	15.0	蔗糖	9000

表2.灰飞虱人工饲料配方二

1.氨基酸	mg/100ml	L-脯氨酸	95	盐酸吡哆辛	2.2
						甘氨酸	28	L-赖氨酸盐酸盐	190	核黄素	0.4
L-丙氨酸	125	L-苯丙氨酸	190	盐酸硫胺素	2.2
						L-盐酸精氨酸	170	L-丝胺酸	380	维生素C	95
L-天冬酰胺酸	220	L-苏氨酸	125	3.无机盐	mg/100ml
						L-天冬氨酸	955	L-色氨酸	100	CaCl₂·2H₂O	3
L-半胱氨酸	75	L-酪氨酸	9	CuCl₂·2H₂O	0.2
						L-胱氨酸盐酸盐	18	L-缬氨酸	290	FeCl₃·6H₂O	2.1
γ-氨基丁酸	9	2.维生素	mg/100ml	MnCl₂·4H₂O	0.7
						L-谷氨酸	240	生物素	0.04	氯化锌	0.3
L-谷氨酰胺	200	泛酸钙	4	六水氯化镁	190
						L-组氨酸	75	氯化胆硷	48	磷酸二氢钾	480
L-蛋氨酸	68	叶酸	0.4
						L-异亮氨酸	95	肌醇	48	4.	mg/100ml
L-亮氨酸	230	烟酸	13	蔗糖	8000

表3.灰飞虱人工饲料配方三

1.氨基酸	mg/100ml	L-脯氨酸	105	盐酸吡哆辛	2.8
						甘氨酸	32	L-赖氨酸盐酸盐	210	核黄素	0.6
L-丙氨酸	135	L-苯丙氨酸	210	盐酸硫胺素	2.8
						L-盐酸精氨酸	180	L-丝胺酸	410	维生素C	105
L-天冬酰胺酸	240	L-苏氨酸	135	3.无机盐	mg/100ml
						L-天冬氨酸	105	L-色氨酸	110	CaCl₂·2H₂O	3.2
L-半胱氨酸	85	L-酪氨酸	11	CuCl₂·2H₂O	0.3
						L-胱氨酸盐酸盐	22	L-缬氨酸	310	FeCl₃·6H₂O	2.3
γ-氨基丁酸	11	2.维生素	mg/100ml	MnCl₂·4H₂O	0.9
						L-谷氨酸	260	生物素	0.06	氯化锌	0.5
L-谷氨酰胺	210	泛酸钙	6	六水氯化镁	210
						L-组氨酸	82	氯化胆硷	52	磷酸二氢钾	520
L-蛋氨酸	75	叶酸	0.6

L-异亮氨酸	105	肌醇	52	4.	mg/100ml
						L-亮氨酸	250	烟酸	17	蔗糖	10000

表4.对比配方(即为申请号为99108791.7的中国专利申请的实施例2)

1.氨基酸	mg/100ml	缬氨酸	300	盐酸吡哆辛	2.5
						半胱氨酸	80	蛋氨酸	110	核黄素	5.0
胱氨酸	20	γ-氨基丁酸	10	盐酸硫胺素	2.0
						天冬酰胺	230	甘氨酸	30	维生素C	100
谷酰胺	240	丙氨酸	130	3.无机盐	mg/100ml
						精氨酸	175	脯氨酸	100	CaCl₂·2H₂O	3.115
异亮氨酸	100	色氨酸	105	CuCl₂·2H₂O	0.268
						谷氨酸	250	天冬氨酸	100	FeCl₃·6H₂O	2.228
丝氨酸	400	2.维生素	mg/100ml	MnCl₂·4H₂O	0.793
						组氨酸	100	生物素	0.025	氯化锌	0.396
亮氨酸	240	泛酸钙	5.0	六水氯化镁	200
						赖氨酸	240	氯化胆硷	50.0	磷酸二氢钾	500
苯丙氨酸	200	叶酸	1.0
						苏氨酸	130	肌醇	50	4.	mg/100ml
酪氨酸	10	烟酸	15	蔗糖	9000

分别依照表1-表4所示的人工饲料的具体配置方法为：将氨基酸、维生素(除了维生素C)和微量金属(除六水三氯化铁)分别配制为2×、10×和100×母液，在-20℃下保存。向大烧杯中添加氨基酸母液，然后添加蔗糖、磷酸二氢钾、六水氯化镁和六水三氯化铁的原液，搅拌直到完全溶解。再向其中添加维生素和微量金属母液，以及维生素C溶液(使用前单独配制为10×母液)。用4％KOH溶液将饲料溶液的pH值调至6.8，然后用蒸馏水稀释至所需浓度。最后将这种溶液用一次性的Millipore微孔(0.45μm)过滤器过滤消毒，储存在-20℃条件备用。

3 取食表1-表4所示的人工饲料的灰飞虱生存适合度

为了检验各人工饲料是否能保证灰飞虱的正常生长发育，适合用于建立毒性检测模型。试验设五个饲料处理：处理一，灰飞虱取食‘武育粳3号’水稻幼苗；处理二、三、四、五，灰飞虱取食表1-表4所示的人工饲料。处理一：将水稻栽培在一个塑料杯中(直径5cm，长40cm)，当水稻幼苗长至10cm左右将单头初孵灰飞虱放入塑料杯中按常规方法饲养；处理二～五：用玻璃筒(直径2.5cm，长15cm)作为饲养容器。将双层石蜡封口膜(parafilm M，USA)拉伸4倍后罩住玻璃筒的一端，添加100ul人工饲料，然后再用拉伸的石蜡封口膜密封，这样制作成饲料囊。饲养容器的另一端在放入昆虫后用尼龙纱布封口。饲养器用一张黑色的湿棉布覆盖，但有饲料囊的那端朝向光源。饲料每两天更换一次。每个处理中设25个重复，共用初孵灰飞虱若虫50头。每天上午8点和下午6点观察灰飞虱生长发育情况，记录死亡率和生长历期。新羽化的成虫(12小时内)鉴定雌雄后用十万分之一电子天平称重。

经过16天的饲喂试验(初孵若虫到成虫)，取食表1-表3所示的灰飞虱人工饲料一、二、三的灰飞虱与取食水稻苗的灰飞虱生存率、若虫历期和新羽化成虫的体重没有显著性差异(P＞0.05)，其中灰飞虱人工饲料一、三的差异更小。取食表4所示的对比例饲料的灰飞虱与取食水稻苗的灰飞虱生存率、若虫历期和新羽化成虫的体重的差异最大。试验结果说明本发明的人工饲料能满足灰飞虱的正常生长发育，符合建立毒力测定模型的要求。其中，取食水稻和灰飞虱人工饲料一的灰飞虱的生命表参数如表5所示。

表5.取食水稻和灰飞虱人工饲料一的灰飞虱的生命表参数

^a卡方检验；^bU检验；^c学生t检验。相同纵栏中数值后跟相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)。

本发明提供的毒性测定方法所使用的人工饲料需要满足了以下要求：1)能保证受试生物的正常生长发育，完成生活史(在整个若虫历期死亡率一般要求小于20％)；2)容易把杀虫蛋白或其它化合物均匀地混入饲料中；3)化合物在饲料中能保持相对稳定性和生物活性。试验显示本发明所采用的饲料能维持灰飞虱的正常生长发育，若虫成活率大于90％，满足了建立毒性测定方法的第一个要求；因为所采用饲料是液体的，保证了测试化合物均匀地混入饲料中；该饲料不需要加热，且饲料1-3天(优选1-2天)更换一次，保障杀虫化合物的生物活性。另外，试验中还可以通过ELISA、Western-blotting和敏感昆虫生测技术全程监测杀虫化合物的浓度、稳定性及生物活性。

4 杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法

生存适合度生测显示：本发明所提供的人工饲料能维持灰飞虱的正常生长发育，可以用于可溶性化合物毒性测定模型的构建。该实施例是基于灰飞虱人工饲料一实施的：1)按照表1配制灰飞虱人工饲料一的母液；2)把需要检测的可溶性化合物(如杀虫蛋白)溶解于适量的蒸馏水或溶液中(根据化合物需要的溶解条件)；3)把毒性化合物溶液混入人工饲料母液，用蒸馏水定容至需要的浓度；4)同样根据前三个步骤配制含一定浓度有机化合物蛋白酶抑制剂E-64或无机化合物砷酸二氢钾(Potassium arsenate，PA；)的人工饲料作为生物测定阳性对照(E-64：450μg/g饲料；PA：8μg/g饲料)；5)纯饲料处理作为阴性对照。同上，将初孵灰飞虱若虫单头接入饲养容器中，每个处理至少设25个重复。饲料每两天更换一次，每天上午8点和下午6点观察灰飞虱生长发育情况，记录死亡率和生长历期，直至成虫羽化。新羽化的成虫(12小时内)鉴定雌雄后用十万分之一电子天平称重。

5 毒性测定模型的有效性和敏感性验证

选用E-64和PA作物模式化合物，把E-64和PA分别按照以下浓度0，50，150和450ug/g；0，8，16和32ug/g混入饲料(Li et al.，2011)。试验体系、试验操作及检测的灰飞虱生命参数与上述的适合度试验相同，数据分析方法如下：飞虱对不同浓度E-64或砷酸盐的生存反应曲线采用Kaplan-Meier程序进行分析；若虫发育至成虫的百分比采用卡方检验法分析。不同浓度E-64或PA处理的灰飞虱发育历期与对照处理间的比较用Mann-Whitney U检验。成虫的体重数据符合正态分布，适合参数分析的要求，采用学生t检验方法分析。所有的分析都用SPSS软件分析(版本13)。

测定结果如下：

E-64试验：取食纯人工饲料(是指表一所示的灰飞虱人工饲料一，下同)的灰飞虱若虫超过90％能发育至成虫(图1)。然而，随着饲料中E-64浓度的增加，灰飞虱的生存率随之下降，表现出成反比的剂量反应关系(图1)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示：取食含50ug E-64/g饲料的灰飞虱与对照组灰飞虱的生存率相比没有显著性差异(P＝0.077)；然而，取食含150ug或450ug E-64/g饲料的灰飞虱比对照组灰飞虱的生存率呈显著性降低(P＝0.035和P＝0.004)(图1)。同样，取食不同浓度的E-64，灰飞虱的其他生命表参数也呈现出一定的剂量反应：E-64浓度提高，若虫历期延长，新羽化的成虫体重降低(表6)。

表6.取食含不同浓度E-64人工饲料的灰飞虱的生命表参数

^aU检验；^b单因素方差分析后采用Tukey HSD进行多重比较。^a卡方检验；^bU检验；^c学生t检验。数值后跟*表示与对照相比差异显著(P＜0.05)。

PA试验：与E-64生测试验结果相似，随着饲料中PA浓度的增加，灰飞虱的生存率逐渐降低(图2)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示：各PA处理的灰飞虱生存率与对照相比都呈显著降低(P＜0.05)。在三个PA处理中没有若虫发育至成虫。

以上试验结果表明：取食不同浓度的E-64和PA，灰飞虱的生命参数都表现出明显的剂量-效应关系。说明了本发明提供的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法能够高度敏感地彰显毒性化合物的毒性。本发明所提供的毒性测定模型具有以下优点：1)可以把具有杀虫活性的纯杀虫蛋白直接饲喂给受试生物，避免了由于三级营养试验或植物组织直接饲喂试验中其它因素的干扰，能十分明确试验中发现的影响是源于杀虫蛋白还是其它因素；2)可以根据研究需要提高杀虫蛋白的剂量，提高风险评价结论的可靠性，并可以把研究结果推论到表达同一杀虫基因的其它作物；3)易于检测和鉴定受试生物在生测试验中暴露于杀虫蛋白的精确浓度及杀虫蛋白的生物活性等。Tier-1毒性测定模型(例如本发明提供的方法)可以用于在新发掘的杀虫基因在转入植物前鉴定其对靶标或非靶标生物的潜在毒性和毒力。

本发明提供的方法能高度敏感地彰显毒性化合物的毒性。本发明用E-64和PA作为模式化合物来验证灵敏性。试验结果显示，取食不同浓度的E-64或PA，灰飞虱若虫的生存率显示出明显的剂量-效应关系。表明本发明提供的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法具有较高的灵敏度，可以用于评价转基因抗虫作物表达的外源杀虫蛋白对灰飞虱潜在毒性或用于筛选对灰飞虱具有抗性的新型杀虫基因。

Claims

1.杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其利用混入了需要检测的杀虫化合物的人工饲料供灰飞虱取食，通过灰飞虱生长发育指标评价所述杀虫化合物对灰飞虱的潜在毒性，其特征在于，所述人工饲料为含有氨基酸、维生素、无机盐和蔗糖的水溶液，以mg/100ml为浓度单位，所述氨基酸包括如下组分：L-盐酸精氨酸150-200，L-天冬酰胺酸200-250，L-谷氨酸220-280，L-谷氨酰胺180-230，L-组氨酸65-85，L-蛋氨酸65-85，L-亮氨酸210-270，L-赖氨酸盐酸盐180-210，L-苯丙氨酸180-220，L-丝胺酸350-450，L-缬氨酸260-330。

2.根据权利要求1所述的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其特征在于，以mg/100ml为浓度单位，所述氨基酸还包括如下组分：L-丙氨酸100-150，L-天冬氨酸90-110，L-异亮氨酸90-110，L-脯氨酸90-110，L-苏氨酸100-150，L-色氨酸90-120。

3.根据权利要求2所述的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其特征在于，以mg/100ml为浓度单位，所述氨基酸还包括如下组分：甘氨酸25-35，L-半胱氨酸70-90，L-胱氨酸盐酸盐15-25，γ-氨基丁酸8-12，L-酪氨酸8-12。

4.根据权利要求1所述的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其特征在于，以mg/100ml为浓度单位，所述维生素包括如下组分：生物素0.03-0.07，泛酸钙3-7，氯化胆硷40-60，叶酸0.3-0.7，肌醇45-55，烟酸12-18，盐酸吡哆辛2-3，核黄素0.3-0.7，盐酸硫胺素2-3，维生素C 80-120；所述无机盐还包括如下组分：CaCl₂·2H₂O 3-3.3，CuCl₂·2H₂O0.2-0.35，FeCl₃·6H₂O 2-2.5，MnCl₂·4H₂O 0.5-1，氯化锌0.3-0.5，六水氯化镁180-220，磷酸二氢钾450-550；所述蔗糖的浓度为6000-12000。

5.根据权利要求1所述的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其特征在于，所述人工饲料中含有的氨基酸、维生素、无机盐和蔗糖的组分和浓度如下：

1.氨基酸 mg/100ml L-脯氨酸 95-105 盐酸吡哆辛 2.2-2.8 甘氨酸 28-32 L-赖氨酸盐酸盐 190-210 核黄素 0.4-0.6 L-丙氨酸 125-135 L-苯丙氨酸 190-210 盐酸硫胺素 2.2-2.8 L-盐酸精氨酸 170-180 L-丝胺酸 380-410 维生素C 95-105 L-天冬酰胺酸 220-240 L-苏氨酸 125-135 3.无机盐 mg/100ml L-天冬氨酸 95-105 L-色氨酸 100-110 CaCl₂·2H₂O 3-3.2 L-半胱氨酸 75-85 L-酪氨酸 9-11 CuCl₂·2H₂O 0.2-0.3 L-胱氨酸盐酸盐 18-22 L-缬氨酸 290-310 FeCl₃·6H₂O 2.1-2.3 γ-氨基丁酸 9-11 2.维生素 mg/100ml MnCl₂·4H₂O 0.7-0.9 L-谷氨酸 240-260 生物素 0.04-0.06 氯化锌 0.3-0.5 L-谷氨酰胺 200-210 泛酸钙 4-6 六水氯化镁 190-210 L-组氨酸 75-82 氯化胆硷 48-52 磷酸二氢钾 480-520 L-蛋氨酸 68-75 叶酸 0.4-0.6 L-异亮氨酸 95-105 肌醇 48-52 4. mg/100ml L-亮氨酸 230-250 烟酸 13-17 蔗糖 8000-10000

6.根据权利要求5所述的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其特征在于，所述人工饲料中含有的氨基酸、维生素、无机盐和蔗糖的组分和浓度如下：

7.根据权利要求1所述的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其特征在于，所述灰飞虱生长发育指标选自灰飞虱若虫的生存率、若虫历期和新羽化的成虫体重的一种或多种。

8.根据权利要求1所述的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其特征在于，该方法以含有机化合物蛋白酶抑制剂E-64或无机化合物砷酸二氢钾的人工饲料作为生物测定阳性对照，以纯饲料处理作为阴性对照。

9.根据权利要求8所述的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1)配制人工饲料母液；2)把需要检测的可溶性化合物溶解于适量的蒸馏水或溶液中；3)把毒性化合物溶液混入人工饲料母液，用蒸馏水定容至需要的浓度；4)同样根据前三个步骤配制含一定浓度有机化合物蛋白酶抑制剂E-64或无机化合物砷酸二氢钾的人工饲料作为生物测定阳性对照；5)纯饲料处理作为阴性对照；将初孵灰飞虱若虫单头接入饲养容器中，每个处理设25个以上重复，饲料1-3天更换一次，观察记录灰飞虱生长发育情况，评价各处理对灰飞虱的潜在毒性。