CN117384969A - 一种转染试剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种转染试剂及其制备方法与应用，其公开了一种通过“引入多个氨基，协同静电吸附与疏水作用”的策略解决传统脂质体转染试剂导致基因的表达改变进而影响转染实验结果的客观性的问题。通过在高分子聚合物聚赖氨酸上引入胍基功能分子，同时末端采用含二胺的分子封闭，获得了高性能的转染试剂，可用于不同疾病模型的体内实验基因转染应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种阳离子聚合物型转染试剂及其制备方法与应用。
背景技术
转染是指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。转染可以实现三个目的，一是产生重组蛋白，二是特异性增强或抑制转染细胞中某种基因的表达，三是对基因组进行定点编辑。
RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。它是指小分子双链RNA可以特异性地降解同源mRNA,从而抑制或关闭特定基因表达的现象。人们只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)，抑制或封闭该致病基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。siRNA是目前最为热门的生命科学研究领域，也是未来最有发展前途的新药开发领域。除此之外，siRNA技术还可以广泛应用于农业、林业、畜牧业和渔业等多种领域，进行良种培育、良种筛选和疾病治疗等。
siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。化学转染能否成功的关键在于转染试剂的选择，一般可从以下几个方面考虑：一、对siRNA有较高的转染效率。二、对待转染细胞的毒性很小。转染试剂如果毒性过大，会导致大量细胞死亡，这会直接影响对转染试验结果的判读和解析。三、转染细胞的种类。
未来，转染技术可用于建造疾病的动物模型和药物筛选模型，基因治疗、异种器官移植、改良动植物品种和生产性能、生产药用蛋白和保健蛋白和生产人抗体等领域。随着转染试剂在不同领域的广泛使用，转染试剂的需求将会进一步扩大。市场人士认为转染试剂市场在2019-2024年之间将会保持5.76％的稳固增长。2017年，全球转染试剂市场规模达到了28.5亿元，预计2024年将达到43.1亿元，年复合增长率(CAGR)为6.6％。
脂质体类转染试剂本身会导致某些基因的表达改变，因而会影响转染实验结果的客观性，目前市场上脂质体转染试剂的价格较昂贵，平均每毫升在3000元以上，在国内众多高校和科研院所大多数采用进口转染试剂，进口产品甚至在一定范围内出现了垄断的状况，因此，开发具有国产核心技术的非脂质体转染试剂可以有效解决昂贵、部分垄断、存在一定的细胞毒性等问题，本发明研发了一种新型阳离子聚合物型RNA转染试剂，转染细胞范围广，转染效率高，毒性小，可用于细胞及活体水平进行RNA干扰等实验。
发明内容
本发明通过“引入多个氨基，协同静电吸附与疏水作用”的策略来解决传统脂质体转染试剂遇到的问题。通过在高分子聚合物聚赖氨酸上引入胍基功能分子，同时末端采用含二胺的分子封闭，获得了高性能的转染试剂，因此完成了本发明。
第一方面，本发明提供一种转染试剂，所述转染试剂为胍基修饰的聚赖氨酸。
进一步的，所述胍基修饰的聚赖氨酸是通过聚赖氨酸(PLL)与含胍基的化合物的酰胺通过缩合反应获得。
进一步的，所述胍基化合物包括胍基乙酸、丙酸胍和4-呱基丁酸中的一种或多种。
第二方面，本发明提供一种转染试剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
S1.合成苄氧羰基-L-赖氨酸环内酸酐：将N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与三光气四氢呋喃一起反应，反应液用正己烷沉淀，过滤后分液萃取，分离有机层，用四氢呋喃和正己烷重结晶得到苄氧羰基-L-赖氨酸环内酸酐(Lys-NCA)；
S2.合成二胺封端的聚赖氨酸(PLL-DLA)：以二胺为引发剂，通过开环聚合反应合成聚赖氨酸，并在氢溴酸/醋酸混合体系下脱碳苄氧基保护；
S3.合成胍基修饰的聚赖氨酸转染试剂(PLL-Gly)：通过PLL和含胍基化合物的酰胺缩合反应获得PLL-Gly。
进一步，在S2步骤中，将苄氧羰基-L-赖氨酸环内酸酐溶解在DMF中，将一定浓度的二乙烯二胺DMF溶液作为引发剂加入溶液中，进行反应；将反应溶液透析后冷冻干燥获得白色粉末；随后，将白色粉末溶解在三氟乙酸中，加入一定量的氢溴酸/醋酸混合溶液反应；产物经无水乙醚沉淀，过滤，透析后冷冻干燥后即得二胺封端的聚赖氨酸(PLL-DLA)。
进一步，在S3步骤中，将步骤S2所得的PLL溶于溶剂中，将胍基化合物胍基乙酸、EDC和NHS溶于溶剂中，搅拌中溶解，然后加入PLL-溶液，然后将反应液透析后冷冻干燥，得到产物PLL-Gly。
第三方面，本发明提供PLL-Gly在制备转染试剂中的用途。
进一步的，所述用途包括PLL-Gly作为转染试剂核苷酸导入细胞内，所述细胞包括正常细胞，肿瘤细胞，生殖细胞和组织细胞。
进一步，所述核苷酸选自DNA、RNA、mRNA或siRNA。
第四方面，本发明提供一种组合物，所述组合物含有PLL-Gly和基因治疗活性成分。
进一步，所述基因治疗活性成分包括siRNA和/或mRNA，通过干扰细胞内的异常基因表达从而发挥疾病治疗作用。
进一步，所述疾病包括肿瘤、代谢性疾病、心血管疾病、神经性疾病等。
附图说明
图1是PLL-Gly聚合物转染试剂的制备过程及单次合成的产量(60mL)。
图2是苄氧羰基-L-赖氨酸环内酸酐(Lys-NCA)的1H-NMR。
图3是PLL-DLA的1H-NMR。
图4是PLL-Gly的1H-NMR。
图5是PLL-Gly及PLL-Gly/siRNA复合物的水动力学粒径和Zeta电位。
图6是PLL-Gly的细胞相容性。
图7是PLL-Gly聚合物用于不同RNA及DNA的转染过程示意图
图8是PLL-Gly的转染性能评价。
图9是PLL-Gly的转染性能评价。
图10是不同组织H&E染色。
图11是小鼠肌内注射PLL-Gly/萤光素酶-mRNA后2、6、8、12和24小时后的生物发光图像。
图12是荷瘤小鼠注射PLL-Gly/BCL-2下调siRNA(siBCL-2)后16天的肿瘤生长曲线和分离肿瘤图像。
图13是心衰模型小鼠经静脉或雾化方式给予Cy5.5标记PLL-Gly/mRNA后不同时间取出心脏和肺进行活体荧光成像。
图14.是心衰模型小鼠经雾化注射PLL-Gly/mRNA后的心脏组织病理结果及定量分析。
有益效果
通过在聚氨基酸上引入多个氨基基团，加强静电吸附和疏水作用力，可协同提高转染性能，细胞毒性低，转染操作简单，无需特殊条件，与其他转染试剂使用相比，不受血清影响，无需额外加入助转染试剂，可用于不同疾病模型的体内实验基因转染应用。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1转染试剂的合成
实验方法：转染试剂的合成过程如图1所示。
1.合成苄氧羰基-L-赖氨酸环内酸酐：
将一定比例的N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与三光气加入烧瓶中，加入四氢呋喃在一定温度下反应。待溶液自然冷却至室温后用冷的正己烷沉淀，过滤后用乙酸乙酯/冷去离子水进行分液萃取，分离有机层干燥过夜。随后采用四氢呋喃和正己烷重结晶得到苄氧羰基-L-赖氨酸环内酸酐(Lys-NCA)。采用1H-NMR对产物进行结构确证，如图2所示。
2.合成二胺封端的聚赖氨酸(PLL-DLA)：
以二胺为引发剂，通过开环聚合反应合成聚赖氨酸，并在氢溴酸/醋酸混合体系下脱碳苄氧基保护。将苄氧羰基-L-赖氨酸环内酸酐溶解在DMF中，将一定浓度的二乙烯二胺DMF溶液作为引发剂加入溶液中，室温下反应一定时间。将反应溶液透析后冷冻干燥获得白色粉末。随后，将白色粉末溶解在三氟乙酸中，加入一定量的氢溴酸/醋酸混合溶液反应。产物经无水乙醚沉淀，过滤，透析后冷冻干燥后即得二胺封端的聚赖氨酸(PLL-DLA)。采用1H-NMR对产物进行结构确证，如图3所示，采用GPC对聚合物的聚合度进行测算。
3.合成胍基修饰的聚赖氨酸转染试剂(PLL-Gly)：
PLL-Gly通过PLL和含胍基化合物的酰胺缩合反应获得。将上述所得的PLL溶于去离子水中。将胍基化合物(如胍基乙酸、丙酸胍、4-呱基丁酸等)、EDC和NHS溶于去离子水中，搅拌中溶解。然后加入PLL-溶液，室温反应一定时间，然后将反应液透析后冷冻干燥，得到产物PLL-Gly。采用1H-NMR对产物进行结构确证，如图4所示，采用GPC对聚合物的分子量进行测定；采用粒径-电位分析仪对合成产物的水动力学直径和电位进行测定，如图5所示。
实施例2细胞实验对合成的PLL-Gly聚合物的转染性能进行测定
实验方法：
首先采用CCK-8法对PLL-Gly的细胞毒性进行评估，详见图6，同时将市场最常用的转染试剂(Lipo3000)作为对比。图6a显示不同浓度的PLL-Gly与不同种类细胞培养24h的细胞存活率，即使在高浓度下，细胞存活率仍在85％以上。此外，从图6b可以看出，相同浓度下，与其他常用的转染试剂相比，PLL-Gly的毒性更低，表明其良好的细胞活性。
选用不同种类的细胞(包括正常细胞，肿瘤细胞，生殖细胞，组织细胞等)进行转染性能的测定，具体的细胞转染操作详见图7：
(1)将合成的PLL-Gly聚合物溶解在PBS缓冲溶液中，稀释一定倍数形成工作液，进行杀菌操作后备用。
(2)将一定浓度的siRNA、mRNA或DNA用无菌移液器加入上述转染试剂工作液中，充分混合后室温静置一定时间后即得转染复合物。
(3)将转染复合物加入孔板或培养瓶中，前后移动培养皿，充分混合均匀进行后续细胞操作。
(4)采用Western Blot(WB，蛋白免疫印迹，图8)、荧光显微镜(图9)等手段验证细胞内转染效率。
按照图7所示步骤将PLL-Gly或Lipo3000(商品化转染试剂，Thermo Scientific)与一定浓度的siRNA进行不同肿瘤细胞转染，采用WB实验考察转染后相关蛋白的表达。
如图8所示，单独的转染试剂与细胞共孵育不会产生任何的基因敲除效果。然而，当细胞经lipo3000/siRNA或PLL-Gly/siRNA处理后，不同的蛋白(NONO和HSP90)在多种肿瘤细胞中的表达量显著降低。结果表明：PLL-Gly可以作为通用的转染试剂进行siRNA转染应用，且效果不亚于商品化转染试剂。
按照图7所示步骤将PLL-Gly与一定浓度的DNA进行不同细胞转染，采用荧光显微镜观察细胞内绿色荧光蛋白的表达。如图9所示，PLL-Gly可以作为通用的转染试剂进行不同细胞的DNA转染应用。
实验结果：合成的PLL-Gly具有良好的细胞相容性，与常用的转染试剂相比，其细胞毒性更低，更加适合用于细胞的转染应用。
实施例3活体水平上验证转染试剂的适用性
实验方法：静脉注射高浓度的PLL-Gly聚合物的PBS溶液后，取不同组织(心，肝，脾，肺，肾)进行H&E染色。
通过向BALB/c小鼠肌内注射荧光素酶mRNA负载的PLL-Gly/mRNA复合物，检测PLL-Gly用于体内RNA转染的效果，采用PLL-Gly/mRNA复合物进行验证。在一定时间内，向小鼠腹膜内注射荧光素酶底物。反应10分钟后，通过小动物活体荧光进行检测。
通过建立肿瘤，心衰等模型验证PLL-Gly/mRNA或PLL-Gly/siRNA的治疗效果，验证转染试剂的活体应用前景。
肿瘤模型的建立过程：所有的动物实验都是按照上海交通大学医学院附属第六人民医院实验动物管理和使用委员会的指导方针进行的。首先在裸鼠上建立MCF-7肿瘤模型。造模步骤：雌性(4～6周龄)裸鼠皮下注射100μL MCF-7细胞悬液(1×106/mL)。当肿瘤体积达到50mm3时，将荷瘤裸鼠随机分为6组(每组6只)，每组裸鼠经以下处理：生理盐水(对照)、PLL、PLL-Gly和PLL-Gly/siBCL-2。所有的组别均经尾静脉注射，第2，4，8和12天分别经尾静脉注射，给药剂量为1.5mg/kg。照射后每2天测量一次肿瘤体积，肿瘤体积按照V＝W2×L/2公式计算，其中W和L分别为肿瘤的宽度和长度，单位为mm。
心衰模型的建立过程：通过主动脉弓缩窄(Transverse aortic constriction，TAC)诱导的压力超负荷建立心力衰竭小鼠模型。在进行手术的同时，通过连续给药吸入异氟烷(2％)将8周大的雄性C57BL/6J小鼠麻醉。打开左胸，露出横主动脉。将27号针头放置在无名颈动脉和左颈总动脉之间的横主动脉上。6-0丝线用于结扎横主动脉。结扎后，立即拔出针头，关闭胸腔。通过体内超声心动图测定主动脉速度峰值压力，梯度大于30mmHg的小鼠进行后续治疗。
体内靶向实验：TAC后四周，小鼠通过尾静脉或者雾化的方式接受2.5mg/kg剂量的Cy5.5标记PLL-Gly/mRNA溶液，分别在1、3、6和24小时处死小鼠以收获心脏组织，然后用小动物活体荧光成像系统(IVIS)(VISQUE，invivo Elite)对其进行成像。
治疗过程：小鼠经尾静脉分别注射2.5mg/kg的PLL、PLL-Gly、Lipo3000/mRNA和PLL-Gly/mRNA。对于吸入治疗，使用高压微喷雾气雾剂将PLL-Gly/mRNA输送到TAC模型小鼠。通过腹膜内注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉小鼠以允许雾化。在进行气管插管之前，用喉镜打开小鼠的嘴，以观察气管的门廊。将高压微型喷雾器的尖端注射器轻轻地注入主气管，并迅速输送气溶胶。尾静脉注射和雾化给药均为两日给药一次。治疗后取心脏组织进行病理分析。
实验结果：如图10所示，H&E染色中未见各器官出现明显的凋亡或坏死细胞，证明合成的PLL-Gly聚合物具有良好的生物安全性，适合用于活体实验。
如图11所示，PLL-Gly/mRNA复合物验证结果显示腹腔中的荧光强度随着时间的延长而增加，12h达到最强，在24h仍能观察到明显的荧光，说明PLL-Gly可以有效地将mRNA转染到动物体内，从而激发体内的荧光素酶，证明PLL-Gly转染试剂用于活体应用的可行性。
如图12所示，通过肿瘤体积变化曲线以及16天治疗周期后的肿瘤照片可以看出，与对照组及其他治疗组相比，PLL-Gly/siBCL-2治疗可以明显地抑制肿瘤的生长，表明PLL-Gly作为转染试剂可用于活体实验应用。
如图13a所示，与静脉注射相比，吸入给药更多的PLL-Gly/mRNA富集在心肌组织内。此外，随着时间的推移，伴随着肺部的衰减信号，纳米颗粒在心肌中不断地富集，这表明纳米颗粒穿过了肺屏障。如图13b，c，吸入组和静脉注射组分别在1小时和3小时观察到心脏富集的最大信号。而且定量结果表明，在给药1h后，雾化给药后，心脏部位的荧光强度高于静脉给药约3倍。以上结果表明，转染试剂通过雾化的方式可以实现心脏部位的有效富集。
如图14a，b，f所示，治疗六周后，无论是通过静脉还是雾化吸入给药，经PLL-Gly/mRNA治疗后小鼠心脏的尺寸相比于其他组更小。如图14c，d，g所示，Masson染色和Sirius染色的定量结果显示,与其余治疗组相比，经PLL-Gly/mRNA雾化治疗后小鼠心脏部位的纤维化面积明显减小(P<0.005)，证明PLL-Gly/mRNA可以有效改善心脏纤维化。
此外，WGA染色(图14e，h)显示，PBS和PLL-Gly处理的TAC模型小鼠心肌细胞的横截面积明显大于假手术小鼠心肌细胞。然而PLL-Gly/mRNA治疗显著改善心肌细胞肥大，并表现出比Lipo3000/mRNA治疗更好的效果。说明PLL-Gly/mRNA吸入治疗显著改善心肌细胞肥大。
以上结果表明PLL-Gly可以有效地将mRNA递送至心脏部位，具有作为一种通用型转染试剂的潜力。
Claims (10)
1.一种转染试剂，所述转染试剂为胍基修饰的聚赖氨酸。
2.如权利要求1所述的转染试剂，其特征在于，所述胍基修饰的聚赖氨酸是通过聚赖氨酸(PLL)与含胍基的化合物的酰胺通过缩合反应获得。
3.如权利要求1所述的转染试剂，其特征在于，所述胍基化合物包括胍基乙酸、丙酸胍和4-呱基丁酸中的一种或多种。
4.一种转染试剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
S1.合成苄氧羰基-L-赖氨酸环内酸酐：将N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与三光气四氢呋喃一起反应，反应液用正己烷沉淀，过滤后分液萃取，分离有机层，用四氢呋喃和正己烷重结晶得到苄氧羰基-L-赖氨酸环内酸酐(Lys-NCA)；
S2.合成二胺封端的聚赖氨酸(PLL-DLA)：以二胺为引发剂，通过开环聚合反应合成聚赖氨酸，并在氢溴酸/醋酸混合体系下脱碳苄氧基保护；
S3.合成胍基修饰的聚赖氨酸转染试剂(PLL-Gly)：通过PLL和含胍基化合物的酰胺缩合反应获得PLL-Gly。
5.如权利要求4所述的转染试剂的制备方法，其特征在于，在S2步骤中，将苄氧羰基-L-赖氨酸环内酸酐溶解在DMF中，将一定浓度的二乙烯二胺DMF溶液作为引发剂加入溶液中，进行反应；将反应溶液透析后冷冻干燥获得白色粉末；随后，将白色粉末溶解在三氟乙酸中，加入一定量的氢溴酸/醋酸混合溶液反应；产物经无水乙醚沉淀，过滤，透析后冷冻干燥后即得二胺封端的聚赖氨酸(PLL-DLA)。
6.如权利要求4所述的转染试剂的制备方法，其特征在于，在S3步骤中，将步骤S2所得的PLL溶于溶剂中，将胍基化合物胍基乙酸、EDC和NHS溶于溶剂中，搅拌中溶解，然后加入PLL-溶液，然后将反应液透析后冷冻干燥，得到产物PLL-Gly。
7.PLL-Gly在制备转染试剂中的用途，所述用途包括PLL-Gly作为转染试剂核苷酸导入细胞内，所述细胞包括正常细胞，肿瘤细胞，生殖细胞和组织细胞。
8.一种组合物，所述组合物含有PLL-Gly和基因治疗活性成分。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述基因治疗活性成分包括siRNA和/或mRNA，通过干扰细胞内的异常基因表达从而发挥疾病治疗作用。
10.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述疾病包括肿瘤、代谢性疾病、心血管疾病、神经性疾病。
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2023
- 2023-10-11 CN CN202311312834.1A patent/CN117384969A/zh active Pending
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