CN111848830A - 含氟化合物修饰的壳聚糖作为药物载体的用途及其制备方法 - Google Patents

含氟化合物修饰的壳聚糖作为药物载体的用途及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物，具有如下结构：含氟化合物共价连接在壳聚糖主链上，所述壳聚糖的分子量范围在5000‑5000000，所述含氟化合物为如下化学式(Ⅰ)所示的含氟脂肪链，或式(Ⅱ)所示的芳香环功能基团，所述R1为卤素(氟,氯，溴，碘)、卤素取代的烷烃、环烷烃、醛基、羧基、双键、炔键、羟基、磺酰氯、磺酸键或巯基这些能够与伯氨基反应的活性基团。本发明的目的是提供一种促进药物吸收效果明显，低毒性的新型药物载体材料，并且本发明提出的含氟化合物修饰的壳聚糖合成工艺成熟、操作简易，合成效率高，周期短，无需繁琐的纯化步骤即可获得高产率的药物载体，其简易的合成方法为其提供了商业化的良好基础。

Description

含氟化合物修饰的壳聚糖作为药物载体的用途及其制备方法
技术领域
本发明涉及高分子化学以及医药生物材料技术领域，具体涉及基于氟化物修饰改性的壳聚糖高分子药物载体及其制备方法和应用。
背景技术
近年来亲水性阳离子高分子聚合材料如聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸等其阳离子特性可以与核酸、多肽及蛋白分子结合形成纳米复合物，不仅促进这些大分子化合物进入细胞，而且能够保护药物不被微环境中的水解酶降解，其内部的三级氨结构通过质子海绵作用，促进药物在细胞内涵体的逃逸。同时，由于阳离子高分子聚合材料可通过削弱上皮细胞的紧密连接作用，增加上皮的渗透性，促进药物大分子在上皮细胞的吸收效率。但是，阳离子高分子聚合材料在使用过程中的高细胞毒性最终限制了其临床应用。
壳聚糖是甲壳质脱乙酰基后的阳离子多糖，具有良好的生物安全特性和优良的黏膜黏附性能，其已被广泛应用于经粘膜给药剂型的设计。文献报道壳聚糖可通过其自身正电荷与皮肤及黏膜表面的阴性电荷作用以及疏水基团的疏水效应产生黏膜粘附，有效的延长壳聚糖溶液中生物活性物质(药物、多肽、蛋白等)在病灶部位的滞留时间，在扩散或壳聚糖降解等后期作用的驱动下，使活性物质从壳聚糖溶液中缓慢释放，从而达到局部皮肤、黏膜的长效缓释效果。虽然壳聚糖可显著提高灌注药物的生物利用度，但高浓度的壳聚糖有可能会引起严重的黏膜、上皮损伤，限制了其作为药物载体的临床应用。
因此，如何发明一种促进药物吸收效果明显，同时低细胞毒性的新型药物载体材料是具有挑战性的方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进药物吸收效果明显，低毒性的新型药物载体材料，并且本发明提出的含氟化合物修饰的壳聚糖合成工艺成熟、操作简易，合成效率高，周期短，无需繁琐的纯化步骤即可获得高产率的药物载体，其简易的合成方法为其提供了商业化的良好基础，本发明所述的含氟化合物修饰的壳聚糖具有作为多种药物载体的用途。
本专利提供了如下技术方案，一种作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物，具有如下结构：含氟化合物共价连接在壳聚糖主链上，所述壳聚糖的分子量范围在5000-5000000，脱乙酰度大于55％，
所述含氟化合物为如下化学式(Ⅰ)
Figure BDA0002374780560000011
所示的含氟脂肪链，或式(II)
Figure BDA0002374780560000012
所示的芳香环功能基团，所述R1为卤素(氟,氯，溴，碘)、卤素取代的烷烃、环烷烃、醛基、羧基、双键、炔键、羟基、磺酰氯、磺酸键或巯基这些能够与伯氨基反应的活性基团。
本发明提供了一种作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物，具有如式(Ⅳ)所示的含有伯氨基的壳聚糖分子骨架：
Figure BDA0002374780560000021
所述壳聚糖的伯氨基与含氟功能基团之间形成的连接基团为：-NH-、-N＝C-、-NHCH2CH(OH)-、-NHCH2CH(OH)CH2O-、
Figure BDA0002374780560000022
Figure BDA0002374780560000023
以及衍生基团；
所述含氟功能基团为含氟脂肪链、芳香环功能基团。
作为本发明所述的作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物一种优选方案：所述式(Ⅰ)中x为0-3的整数，y为0-20的整数，z为0-8的整数，R2为CF3、CHF2、CH2F、或CH3(当y不为0)；
所述含氟脂肪链化合物是指含氟烃基及其衍生物，包括三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸、九氟戊酸、十一氟己酸、十三氟庚酸、十五氟辛酸、十七氟壬酸、十九氟奎酸、全氟丁酸酐、全氟庚酸酐、全氟癸酸酐、2，2，3，3，4，4，4-七氟丁基丙烯酸酯、3-(1H，1H，5H八氟戊氧基)-1，2-环氧丙烯、九氟丁基璜酰胺酐及其衍生物。
作为本发明所述的作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物一种优选方案：所述式(II)中R为H,CH3,OH,NO2,O,CF3,F,CH2OH,CN,NCO,或(CF2)aCF3(a为1-20的整数)等，且至少一个R为F；
所述含氟芳香环化合物包括3-氟苯甲酸、3，5-二氟苯甲酸、2，3，5，6-四氟-4-甲基苯甲酸、五氟苯甲酸、2-氟-3-(三氟甲基)苯甲酸及其衍生物。
作为本发明所述的作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物一种优选方案：所述壳聚糖和含氟化合物共价连接，在所述壳聚糖分子表面进行修饰，构成一种药物载体，其结构如式(V)所示，b、c均为20-500的整数，式(V)如下：
Figure BDA0002374780560000031
，其中，B为含氟功能基团与壳聚糖伯氨基形成的连接基团，C为含氟脂肪链、芳香环功能基团。
作为本发明所述的作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物一种优选方案：所述含氟脂肪链是带有可以与氨基反应的活性基团的一类含氟化合物，包括如式(VI)所示：
Figure BDA0002374780560000032
其中A为-COOH、
Figure BDA0002374780560000033
能够与伯氨基反应的活性基团，x为0-3的整数，y为0-8的整数。
作为本发明所述的作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物一种优选方案：所述含氟芳香环化合物是带有可以与氨基反应的活性基团的一类含氟化合物，包括如式(VII)所示：
Figure BDA0002374780560000041
作为本发明所述的作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物一种优选方案：所述氟化修饰的壳聚糖衍生物作为如下药物的药物载体，所述如下药物为小分子药物、多肽、蛋白药物、不同药物的组合药物以及药物与其它药用辅料的组合药物。
含氟化合物修饰的壳聚糖作为药物载体的应用，所述的氟化修饰的壳聚糖衍生物可以作为小分子药物、多肽、蛋白药物、不同药物的组合药物以及药物与其它药用辅料的组合药物的药物载体应用。
一种制备氟化修饰的壳聚糖衍生物的方法，其包括如下步骤：制备壳聚糖醋酸水溶液，称取壳聚糖加入醋酸水溶液中，搅拌使其充分溶解，随后滴加氢氧化钠，搅拌至溶液澄清，pH在6.2-6.8；
含氟化合物的活化，称取含氟化合物将其溶于适量无水二甲基亚砜中，依次加入反应量EDC，NHS避光搅拌；
将所述活化好的含氟化合物溶液滴加到快速搅拌的壳聚糖溶液中，避光搅拌充分反应。
所述制备氟化修饰的壳聚糖衍生物的方法，进一步包括如下步骤：将充分反应的溶液缓慢滴加到氢氧化钾乙醇溶液中搅拌，过滤沉淀，用大量无水乙醇冲洗，至滤液呈中性，沉淀经甲醇、乙醚洗涤脱水，真空干燥，干燥后的沉淀物溶于盐酸溶液，冻干得氟化壳聚糖盐酸盐。
一种制备3-氟苯甲酸氟化壳聚糖的方法，其包括如下步骤：
(1)制备壳聚糖醋酸水溶液：称取充分干燥的壳聚糖加入醋酸水溶液中，搅拌使充分溶解，随后缓慢滴加氢氧化钠，搅拌至溶液澄清，pH在6.2-6.8；
(2)3-氟苯甲酸的活化：称取3-氟苯甲酸，将其溶于适量无水二甲基亚砜中，依次加入反应量EDC，NHS避光充分搅拌；
(3)3-氟苯甲酰壳聚糖的制备：将上述活化好的3-氟苯甲酸溶液分别缓慢滴加到快速搅拌的壳聚糖溶液中，避光搅拌充分反应。
所述制备3-氟苯甲酸氟化壳聚糖的方法，进一步包括如下步骤：
将充分反应的溶液缓慢滴加到氢氧化钾乙醇溶液中充分搅拌，过滤沉淀，用大量无水乙醇冲洗，至滤液呈中性，沉淀经甲醇、乙醚洗涤脱水，真空干燥；
干燥后的沉淀物溶于盐酸溶液，冻干得3-氟苯甲酸氟化壳聚糖盐酸盐分子。
一种制备全氟庚酸氟化壳聚糖的方法，其包括如下步骤：
(1)制备壳聚糖醋酸水溶液：称取充分干燥的壳聚糖加入醋酸水溶液中，搅拌使充分溶解，随后缓慢滴加氢氧化钠，搅拌至溶液澄清，pH在6.2-6.8；
(2)全氟庚酸(13氟庚酸)的活化：称取全氟庚酸，将其溶于适量无水二甲基亚砜中，依次加入适量EDC，NHS避光充分搅拌；
(3)13F庚酸壳聚糖的制备：将上述活化好的全氟酸溶液缓慢滴加到快速搅拌的壳聚糖溶液中，避光搅拌充分反应。
所述制备全氟庚酸氟化壳聚糖的方法，其进一步包括如下步骤：
将充分反应的溶液缓慢滴加到氢氧化钾乙醇溶液中充分搅拌，过滤沉淀，用大量无水乙醇冲洗，至滤液呈中性，沉淀经甲醇、乙醚洗涤脱水，真空干燥，干燥后的沉淀物溶于盐酸溶液，冻干得全氟庚酸氟化壳聚糖盐酸盐。
所述的作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物：所述氟化修饰的壳聚糖衍生物为全氟庚酸氟化壳聚糖盐酸盐分子，所述全氟庚酸氟化壳聚糖盐酸盐的氟化修饰程度依次为18％～25％，或为20％～22％。
一种药物复合物：包括作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物以及药物，所述药物包括小分子药物、多肽、蛋白药物、不同药物的组合药物以及药物与其它药用辅料的组合药物。
鉴于，阳离子高分子聚合材料在使用过程中的高细胞毒性最终限制了其临床应用，以及壳聚糖虽然可显著提高灌注药物的生物利用度，但是高浓度的壳聚糖有可能会引起严重的黏膜、上皮损伤，限制了其作为药物载体的临床应用。近年来，发明人尝试了各种技术方案以改善生物安全性，例如在这些阳离子高分子聚合物表面连接了各种修饰基团，如聚乙二醇、环糊精、氨基酸、糖基、氟化修饰等，但几乎没有效果，在偶然的尝试实验中发现氟化修饰后的阳离子高分子材料其生物相容性及大分子转运效果都能有非常显著的改善，并且对核酸、多肽以及蛋白药物具有更强的结合保护作用。
进一步的发明人设计合成了一系列氟化修饰的壳聚糖衍生物，实验结果表明，氟化修饰的壳聚糖(FCS)具有比壳聚糖更显著的促药物渗透吸收的性能，且细胞以及小鼠体内安全评价试验结果表明，FCS具有很好的生物安全性，即使是高浓度的FCS也无明显的细胞毒性及黏膜上皮损伤作用，其生物毒性显著低于没有修饰的壳聚糖(CS)。
发明人通过选用SV-HUC-1人正常膀胱癌商品细胞建立体外膀胱黏膜屏障模型，通过考察FCS对SV-HUC-1单层细胞膜电阻、荧光黄渗透率、细胞紧密连接超微结构以及紧密连接蛋白的影响，简单阐述FCS促药物膀胱黏膜渗透吸收的作用机制。实验结果表明，FCS可显著降低SV-HUC-1单层细胞膜电阻值，增加荧光黄的渗透效率，通过改变紧密连接蛋白以及E-钙黏素蛋白的结构和空间分布调控细胞紧密连接，增加药物分子的细胞旁路摄取效率。也就是说，FCS可以有效提高生物组织屏障中(如粘膜上皮组织等)细胞与细胞之间的间隙，从而使得游离的药物分子或者被FCS载带的药物能够更有效地穿越这些生物组织屏障。
此外，通过大量实验数据表明随着壳聚糖骨架上含氟脂肪链长度以及取代度的增加，修饰产物的促药物渗透吸收能力出现先增加后降低的现象，表明对于壳聚糖的修饰不能过度氟化，氟化壳聚糖的促灌注药物黏膜渗透吸收的作用可能是壳聚糖正电荷分子骨架与含氟脂肪链共同作用的结果。
因此，本专利确定选择FCS作为一种新型的药物载体进行进一步的研究。本专利设计合成了一系列氟化修饰的壳聚糖衍生物，其在制药领域的应用包括但不限于以下疾病模型，例如膀胱癌灌注给药(或其他腔内灌注)、肺部吸入给药、透皮给药、口服给药。
膀胱癌是最常见的泌尿肿瘤之一，临床上75％以上的膀胱癌为非肌层浸润型膀胱癌(NMIBC)，其中30％～80％的NMIBC患者行经尿道膀胱肿瘤切除术(TURBT)后5年内复发，10％～20％的NMIBC患者进展为肌层浸润型膀胱癌。因此，TURBT后辅助灌注化疗或免疫治疗抑制或延缓肿瘤复发已成为膀胱癌临床治疗指南首选方案。虽然TURBT后辅助化疗药物可延缓肿瘤复发，但由于膀胱的生理特性及其黏膜的生理屏障作用，使得传统方式膀胱灌注的药液在膀胱内滞留时间有限、作用时间短、生物利用度低，不能使时间、浓度依赖性的灌注药物发挥显著抗肿瘤作用，无法有效降低膀胱癌复发和进展绝对风险并有效改善预后。本专利的技术方案基于FCS作为新型跨粘膜药物载体，可改善灌注药物生物利用度，提高药物在腔内灌注后进入膀胱肿瘤内部结构的效率，从而提高膀胱灌注治疗的疗效。该技术方案也可以适用于其他腔内灌注治疗(如腹腔、盆腔、胸腔)。
与静脉给药治疗相比，肺部吸入给药治疗局部地将药物输送到肿瘤组织，所需药物剂量明显降低，毒副作用小。肺部的特殊生理结构决定了肺部吸入给药的特点和优势：肺部的表面积大，毛细血管丰富，而且肺泡上皮细胞层薄，肺部给药起效快；肺部的生物代谢酶分布集中，生物活性低从而减少了对蛋白质的水解，使得蛋白质和多肽容易通过肺泡表面被快速吸收，保持了其生物活性；避免了肝脏首过效应。但仍存在着一些缺点限制了其临床应用，如吸入的药物很快被肺部清除，无法保证药物在肺部的有效沉积。针对肺癌而言，尽管肺部吸入的药物能够到达肺泡，但是进入肺部肿瘤内部的效率一般而言是很低的，严重影响了肺部吸入给药模式用于治疗肺癌的疗效。本专利的技术方案基于FCS作为新型跨粘膜药物载体，可改善肺部吸入药物的生物利用度，提高药物在吸入后进入肺部肿瘤内部结构的效率，从而提高肺部吸入给药治疗的疗效。
透皮给药系统是指在皮肤表面给药，药物以一定速率通过皮肤各层，进入体循环，产生全身或局部治疗作用的制剂。透皮给药作为一种非侵入式的外用给药方式，具有操作简便，患者适应性强等诸多优势。然而，透皮给药通常受到皮肤角质层类酯屏障以及药物理化性质的制约，如何提高药物通过透皮给药模式进入血液循环或者进入皮下病灶(如皮肤癌)的能力是这项技术面临的一个重要挑战。本专利的技术方案基于FCS作为新型跨粘膜药物载体，可改善透皮药物的生物利用度，大幅提高药物穿透皮肤屏障的能力，可以使药物能够更有效地通过透皮给药模式进入血液循环或者进入皮下病灶(如皮肤癌)，从而提高透皮给药治疗的疗效。
本发明提供一种含氟化合物修饰的壳聚糖在促进药物吸收效率中的应用；提供一种含氟化合物修饰的壳聚糖以及其作为多种药物载体的用途。
本专利所述的含氟化合物修饰的壳聚糖，其中所述含氟化合物共价连接在壳聚糖主链上；所述壳聚糖为分子量范围在5000-5000000，脱乙酰度在55％-100％，粘度在25-1000厘泊(1％醋酸溶液)的壳聚糖；所述药物为小分子药物、多肽、蛋白药物、不同药物的组合药物以及药物与其它药用辅料的组合药物，能够适用各种相关病症。
所述含氟化合物包括如下化学式(Ⅰ)
Figure BDA0002374780560000071
和式(II)
Figure BDA0002374780560000072
所示的含氟脂肪链以及芳香环功能基团，其中R1为卤素(F,Cl，Br，I)、卤素取代的烷烃、环烷烃、醛基、羧基、双键、炔键、羟基、磺酰氯、磺酸键、巯基等可以与伯氨基反应的活性基团；
式(Ⅰ)中x为0-3的整数，y为0-20的整数，z为0-8的整数，R2为CF3、CHF2、CH2F、或CH3(当y不为0)；所述含氟脂肪链化合物包括三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸、九氟戊酸、十一氟己酸、十三氟庚酸、十五氟辛酸、十七氟壬酸、十九氟奎酸、全氟丁酸酐、全氟庚酸酐、全氟癸酸酐、2，2，3，3，4，4，4-七氟丁基丙烯酸酯、3-(1H，1H，5H八氟戊氧基)-1，2-环氧丙烯、九氟丁基璜酰胺酐及其衍生物等。
式(II)中R为H,CH3,OH,NO2,O,CF3,F,CH2OH,CN,NCO,或(CF2)aCF3(a为1-20的整数)等，且至少一个R为F；所述含氟芳香环化合物包括3-氟苯甲酸、3，5-二氟苯甲酸、2，3，5，6-四氟-4-甲基苯甲酸、五氟苯甲酸、2-氟-3-(三氟甲基)苯甲酸及其衍生物。
含氟化合物修饰的壳聚糖结构如式(III)所示。
Figure BDA0002374780560000073
其中，A为含有伯氨基的壳聚糖分子骨架，如式(Ⅳ)所示：
Figure BDA0002374780560000074
B为含氟功能基团与壳聚糖伯氨基形成的连接基团，如-NH-、-N＝C-、-NHCH2CH(OH)-、-NHCH2CH(OH)CH2O-、
Figure BDA0002374780560000081
Figure BDA0002374780560000082
等以及衍生基团。
C为含氟脂肪链、芳香环功能基团。
本发明所述壳聚糖和含氟化合物是共价连接，在所述壳聚糖分子表面进行修饰，构成一种新型的含氟脂肪链或芳香环化合物修饰的壳聚糖药物载体，例如可以用于促灌注药物膀胱黏膜吸收的药物载体，其结构如式(V)所示，b、c均为20-500的整数。
所述壳聚糖是分子量范围在5000-5000000，脱乙酰度在55％-95％，粘度在25-1000厘泊(1％醋酸溶液)的壳聚糖。其结构如式(Ⅳ)所示，n均为20-2000的整数，该壳聚糖高分子表面具有伯胺基团。
Figure BDA0002374780560000083
本发明中“含氟脂肪链”是指含氟烃基及其衍生物，例如三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸、九氟戊酸、十一氟己酸、十三氟庚酸、十五氟辛酸、十七氟壬酸、十九氟奎酸、全氟丁酸酐、全氟庚酸酐、全氟癸酸酐、2，2，3，3，4，4，4-七氟丁基丙烯酸酯、3-(1H，1H，5H八氟戊氧基)-1，2-环氧丙烯、九氟丁基璜酰胺酐及其衍生物；所述含氟脂肪链是带有可以与氨基反应的活性基团的一类含氟化合物。结构举例如式(VI)所示：
Figure BDA0002374780560000084
Figure BDA0002374780560000091
其中A为-COOH、
Figure BDA0002374780560000092
等能够与伯氨基反应的活性基团，x为0-3的整数，y为0-8的整数。
本发明中“含氟芳香环化合物”是指3-氟苯甲酸、3，5-二氟苯甲酸、2，3，5，6-四氟-4-甲基苯甲酸、五氟苯甲酸、2-氟-3-(三氟甲基)苯甲酸及其衍生物等，所述含氟芳香环化合物是带有可以与氨基反应的活性基团的一类含氟化合物。结构举例如式(VII)所示：
Figure BDA0002374780560000093
Figure BDA0002374780560000101
本发明提出一种复合物包括含氟化合物修饰的壳聚糖以及药物，所述药物包括小分子药物、多肽、蛋白药物、不同药物的组合药物以及药物与其它药用辅料的组合药物，以及其在促进药物吸收中的用途。
例如以表阿霉素(THP)作为膀胱灌注药物，利用本发明制备的含氟化合物修饰的壳聚糖作为药物运输载体，促使药物进入膀胱组织。实验表明本发明具有以下优点：本发明在保持显著促灌注药物膀胱黏膜吸收效率的同时，保持很好的生物相容性。通过小鼠体内灌注实验发现，含氟化合物修饰的壳聚糖改善THP在膀胱黏膜吸收的效率要显著高于THP的水溶液以及其壳聚糖溶液；同时含氟化合物修饰的壳聚糖在较低浓度下实现高效的促药物膀胱黏膜吸收。本发明提出的膀胱灌注药物载体兼具高效、低毒、价格低廉、合成简易等优点。
如图21所示，图21为含氟羧酸修饰的壳聚糖膀胱灌注药物载体的合成路线图。
综上，本专利提供的氟化壳聚糖药物载体，具有促进药物吸收效果明显，低毒性等优点，并且本发明提出的含氟化合物修饰的壳聚糖合成工艺成熟、操作简易，合成效率高，周期短，无需繁琐的纯化步骤即可获得高产率的药物载体，其简易的合成方法为其提供了商业化的良好基础，本发明所述的含氟化合物修饰的壳聚糖具有作为多种药物载体的用途，能够有效的提升治疗效果，具有广泛的用途，并且成本较低。
附图说明
图1为实施例5中七氟丁酸修饰壳聚糖(7FCS)对THP在小鼠膀胱组织中分布及强度的影响，其中，THP，表阿霉素；CS,壳聚糖；FCS,氟化壳聚糖；右图为左图对应的THP相对荧光强度分析。
图2为实施例6中十三氟庚酸修饰壳聚糖(13FCS)对THP在小鼠膀胱组织中分布及强度的影响，其中表阿霉素为THP；CS,壳聚糖；FCS,氟化壳聚糖；右图为左图对应的THP相对荧光强度分析。
图3为实施例7中不同含氟脂肪酸修饰壳聚糖(7FCS，13FCS，19FCS)对THP在小鼠膀胱组织中分布及强度的影响，其中表阿霉素，THP；CS,壳聚糖；FCS,氟化壳聚糖；右图为左图对应的THP相对荧光强度分析。
图4a为实施例8中13F-3具有很好的体外细胞安全性的对比图。
图4b为实施例8中FCS组小鼠体重与空白对照组无明显差异。
图4c为实施例8中各组灌注后小鼠膀胱与空白对照组小鼠膀胱组织及HE(苏木精—伊红)染色切片对比图片。
图5为实施例8中免疫荧光结果对照图片，表明壳聚糖灌注组小鼠膀胱出现了严重得炎症应激与充血水肿，而FCS组与空白对照组无明显差异，左图为膀胱组织切片的荧光共聚焦图片，右图为CS,FCS处理组与空白组control。
图6为实施例9中透射电镜测得MPI/FPEI的相关图片。
图7为实施例9中透射电镜测得MPI/PEI的相关图片。
图8为实施例9中F-PEI组多肽的黏膜渗透指数要显著高于PEI组及空白对照组，其中横坐标为多肽药物MPI与材料PEI或FPEI的投料质量比，纵坐标为渗透系数papp。
图9为实施例9中F-PEI组蛋白药物的黏膜渗透指数要显著高于PEI组及空白对照组，横坐标为多肽药物CAT-Ce6与材料PEI或FPEI的投料质量比，纵坐标为渗透系数papp。
图10为实施例9中MPI不同药物体系在灌注药物不同时间后取膀胱制备冰冻切片及药物荧光在组织分布及强度对照图表，横坐标为不同灌注时间，纵坐标为多肽药物荧光强度的相对值。
图11为实施例9中CAT不同药物体系在灌注后取膀胱制备冰冻切片及药物荧光在组织分布及强度对照图表，左图为药物CAT-Ce6不同药物体系在膀胱组织中的荧光分布，右图为药物的荧光强度分析。
图12为实施例10中透射电子显微镜(TEM)成像图片。
图13为实施例10中膀胱冰冻切片以及荧光共聚焦显微镜分析荧光强度的对照图表，左图从左至右依次为药物CAT-TCPP在膀胱组织横切、纵切切片中的荧光分布；右图从上至下依次为药物在膀胱横切纵切已经膀胱组织匀浆中的荧光强度。
图14为实施例11中检测动态光散射水合粒径与所带电荷量的示意图，FITC，异硫氰酸荧光素；IgG，免疫球蛋白g；FCS,氟化壳聚糖；αPDL1,抗程序性死亡受体配体-1(αPDL1)单抗；左图和右图横坐标为尺寸，纵坐标为数量；中间图横坐标为异硫氰酸荧光素与免疫球蛋白g的投料比，纵坐标为ZETA电位。
图15为实施例12中使用立式扩散池对小鼠皮肤进行体外透皮表征示意图，其为立式扩散池。
图16为实施例12中体外透皮表征过程中得到相应透过率数据，IgG，免疫球蛋白g；FCS,氟化壳聚糖；纵坐标为透过的荧光百分比。
图17为实施例12中Cy5.5标记的FCS-IgG的C57小鼠B16肿瘤模型渗透评价中获得肿瘤部位FCS-IgG渗透情况的图片。(Cy5.5，荧光染料；IgG，免疫球蛋白g；CS,壳聚糖；FCS,氟化壳聚糖；DAPI荧光信号指示细胞核；Cy5.5荧光信号指示IgG；Merged表示叠加图；箭头表示皮肤层。
图18为实施例12中FCS-αPDL1抗体的C57小鼠B16肿瘤模型渗透评价中获得共聚焦显微镜成像，FITC，异硫氰酸荧光素；αPDL1,抗程序性死亡受体配体-1单抗；CS,壳聚糖；FCS,氟化壳聚糖；DAPI荧光信号指示细胞核；FITC荧光信号指示αPDL1；Merged表示叠加图
图19为实施例13中Cy5.5标记的FCS-IgG的小鼠肺部渗透评价中肺部组织荧光照片，给药后24h肺部离体荧光照片，Cy5.5荧光信号指示IgG。
图20为实施例13中在蔡司共聚焦显微镜LSM 800下进行肺叶全景拼接拍图，获得肺部FCS-IgG渗透情况相关图片，Cy5.5，荧光染料；IgG，免疫球蛋白g；CS,壳聚糖；FCS,氟化壳聚糖；DAPI荧光信号指示细胞核；FITC荧光信号指示αPDL1；Merged表示叠加图。
图21为含氟羧酸修饰的壳聚糖膀胱灌注药物载体的合成路线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图，对本发明做进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
缩写注释：THP(表阿霉素)；EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)；DMSO(二甲基亚砜)；MPI(多肽药物Polybia-MPI)；MPI-Cy5.5(对多肽药物MPI进行荧光标记)；PEI(聚乙烯亚胺)；FPEI(氟化聚乙烯亚胺)；CAT(蛋白药物过氧化氢酶)；CAT-Ce6(标记光敏剂Ce6的复合蛋白药物)；CAT-TCPP(标记声敏剂TCPP的复合蛋白药物)。
参照例
实验设计人员分别以阿霉素、表阿霉素(THP)以及荧光染料罗丹明B作为膀胱灌注药物与壳聚糖(1％醋酸水溶液)混合制备壳聚糖膀胱灌注药物体系，膀胱灌注1h后取膀胱组织制备冰冻切片，以共聚焦荧光显微镜进行药物荧光强度分析，考察药物在膀胱组织的分布情况。实验结果表明等浓度的膀胱灌注药物的壳聚糖(5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml)溶液，在膀胱黏膜中的黏附、渗透能力显著优于灌注单纯药物的水溶液，且随着壳聚糖浓度的增加灌注体系的黏附、渗透能力越强。为了进一步考察壳聚糖作为灌注药物载体的生物安全性，项目设计者将15mg/ml的壳聚糖水溶液进行小鼠膀胱灌注处理，1h后停止灌注，正常饲养条件继续饲养小鼠，并记录其体重。实验结果发现，小鼠在灌注壳聚糖后第二天就出现体重骤降，小鼠活动萎靡的状况。从治疗后的第二天起小鼠出现死亡，并在陆续的3天内实验组8只小鼠全部死亡，经解剖取其膀胱与空白对照组小鼠膀胱对比发现，壳聚糖灌注组小鼠膀胱相对于空白组小鼠膀胱充血严重，HE染色以及CD45，Ki67免疫荧光结果表明壳聚糖灌注组小鼠膀胱出现了严重得炎症应激与充血水肿。以上实验结果表明虽然壳聚糖可显著提高灌注药物在膀胱黏膜的生物利用度，但高浓度的壳聚糖同时会引起严重的膀胱黏膜、上皮损伤，严重限制了其作为膀胱灌注药物载体的临床应用。
实施例1：制备3-氟苯甲酸不同修饰程度的壳聚糖(脱乙酰度≧95％，粘度100-200mpa.s),其中3-氟苯甲酸与N氨基葡萄糖单元的投料摩尔比例分别为1：1.1、1:2.2、1:4.4、1:8.8。
合成方法：(1)制备壳聚糖醋酸水溶液：称取200mg充分干燥的壳聚糖加入10ml1％的醋酸水溶液中，当然也可以采用盐酸水溶液，搅拌30min使充分溶解，随后缓慢滴加1.6ml0.5M的氢氧化钠，搅拌至溶液澄清，pH在6.5左右。单纯考虑碱化溶液的角度氢氧化钠可以被氨水，三乙胺等碱替换，但是从产品工艺角度使用氢氧化钠的副产物是氯化钠，更适合工业化。如此方法制备4份壳聚糖醋酸水溶液。(2)3-氟苯甲酸的活化：分别称取5.0mg、9.8mg、19.7mg、40mg的3-氟苯甲酸，将其溶于适量无水二甲基亚砜中，依次加入反应量EDC，NHS避光搅拌1h。(3)3-氟苯甲酰壳聚糖的制备：将上述活化好的3-氟苯甲酸溶液分别缓慢滴加到快速搅拌的壳聚糖溶液中，避光搅拌反应20h。反应结束，依次将前述反应后的溶液缓慢滴加到100ml 0.5M氢氧化钾乙醇溶液中搅拌8h，过滤沉淀，用大量无水乙醇冲洗，至滤液呈中性，沉淀经甲醇、乙醚洗涤脱水，真空干燥30min。干燥后的沉淀物溶于10ml 0.1M盐酸溶液，冻干得外观白色粉末的不同氟化修饰程度3-氟苯甲酸氟化壳聚糖盐酸盐分子(产物命名为1FCS-1,1FCS-2,1FCS-3,1FCS-4)。
以上反应所得材料以茚三酮反应法检测氟化修饰的壳聚糖(FCS)高分子表面修饰氟化脂肪链的修饰度。茚三酮反应法是一种简单、快速、准确、可靠的方法，可以准确检测水溶液中FCS高分子表面伯氨基团的数量，近而计算出FCS表面氟化基团的数量。
实施例2：制备七氟丁酸不同修饰程度的壳聚糖(脱乙酰度≧95％，粘度100-200mpa.s),其中全氟庚酸与N氨基葡萄糖单元的投料摩尔比例分别为1：1.1、1:2.2、1:4.4、1:8.8。
合成方法：(1)制备壳聚糖醋酸水溶液：称取200mg充分干燥的壳聚糖加入10ml1％的醋酸水溶液中，搅拌30min使充分溶解，随后缓慢滴加1.6ml 0.5M的氢氧化钠，搅拌至溶液澄清，pH在6.5左右。如此方法制备4份壳聚糖醋酸水溶液。(2)七氟丁酸的活化：分别称取7.6mg、15mg、30mg、61mg七氟丁酸，将其溶于适量无水二甲基亚砜中，依次加入反应量EDC，NHS避光搅拌1h。(3)七氟丁酸壳聚糖的制备：将上述活化好的七氟丁酸溶液分别缓慢滴加到快速搅拌的壳聚糖溶液中，避光搅拌反应20h。反应结束，依次将反应缓慢滴加到100ml0.5M氢氧化钾乙醇溶液中搅拌8h，过滤沉淀，用大量无水乙醇冲洗，至滤液呈中性，沉淀经甲醇、乙醚洗涤脱水，真空干燥30min。干燥后的沉淀物溶于10ml 0.1M盐酸溶液，冻干得外观白色粉末的不同氟化修饰程度全氟庚酸氟化壳聚糖盐酸盐分子(产物命名为7FCS-1,7FCS-2,7FCS-3,7FCS-4)。
以上反应所得材料以茚三酮反应法检测FCS(氟化修饰的壳聚糖)高分子表面修饰氟化脂肪链的修饰度。茚三酮反应法是一种简单、快速、准确、可靠的方法，可以准确检测水溶液中FCS高分子表面伯氨基团的数量，近而计算出FCS表面氟化基团的数量。茚三酮反应法计算以上制备FCS的氟化修饰程度依次为：7FCS-1,6.9％；7FCS-2,10.4％；7FCS-3,23.5％；7FCS-4，42.3％。
实施例3：制备全氟庚酸不同修饰程度的壳聚糖(脱乙酰度≧95％，粘度100-200mpa.s),其中全氟庚酸与N氨基葡萄糖单元的投料摩尔比例分别为1：1.1、1:2.2、1:4.4、1:8.8。
合成方法：(1)制备壳聚糖醋酸水溶液：称取200mg充分干燥的壳聚糖加入10ml1％的醋酸水溶液中，搅拌30min使充分溶解，随后缓慢滴加1.6ml 0.5M的氢氧化钠，搅拌至溶液澄清，pH在6.5左右。如此方法制备4份壳聚糖醋酸水溶液。(2)全氟庚酸(13氟庚酸)的活化：分别称取13mg、26mg、51.5mg、103mg全氟庚酸，将其溶于适量无水二甲基亚砜中，依次加入适量EDC，NHS避光搅拌1h。(3)13F庚酸壳聚糖的制备：将上述活化好的全氟酸溶液分别缓慢滴加到快速搅拌的壳聚糖溶液中，避光搅拌反应20h。反应结束，依次将反应缓慢滴加到100ml 0.5M氢氧化钾乙醇溶液中搅拌8h，过滤沉淀，用大量无水乙醇冲洗，至滤液呈中性，沉淀经甲醇、乙醚洗涤脱水，真空干燥30min。干燥后的沉淀物溶于10ml 0.1M盐酸溶液，冻干得外观白色粉末的不同氟化修饰程度全氟庚酸氟化壳聚糖盐酸盐分子(产物命名为13FCS-1,13FCS-2,13FCS-3,13FCS-4)。
茚三酮反应法计算以上制备FCS的氟化修饰程度依次为：13FCS-1,5.2％；13FCS-2,11.3％；13FCS-3,21.4％；13FCS-4，42.5％。13FCS-1～13FCS-4 13氟庚羰基基团的连接效率随着全氟庚酸投料的增加为5.2％～42.5％，即平均每个壳聚糖分子中有5.2％～42.5％的葡萄糖结构单元中完成了氟化修饰，产物命名为13FCS-1,13FCS-2,13FCS-3,13FCS-4。
实施例4：制备19F癸酸不同修饰程度的壳聚糖(脱乙酰度≧95％，粘度100-200mpa.s),其中19F癸酸与N氨基葡萄糖单元的投料摩尔比例分别为1：1.1、1:2.2。
合成方法：(1)制备壳聚糖醋酸水溶液：称取200mg充分干燥的壳聚糖加入10ml1％的醋酸水溶液中，搅拌30min使充分溶解，随后缓慢滴加1.6ml 0.5M的氢氧化钠，搅拌至溶液澄清，pH在6.5左右。如此方法制备2份壳聚糖醋酸水溶液。(2)19F癸酸的活化：分别称取18mg、36.7mg19F癸酸，将其溶于适量无水二甲基亚砜中，依次加入适量EDC，NHS避光搅拌1h。(3)19F癸酸壳聚糖的制备：将上述活化好的19F癸酸溶液分别缓慢滴加到快速搅拌的壳聚糖溶液中，避光搅拌反应20h。反应结束，依次将反应缓慢滴加到100ml 0.5M氢氧化钾乙醇溶液中搅拌8h，过滤沉淀，用大量无水乙醇冲洗，至滤液呈中性，沉淀经甲醇、乙醚洗涤脱水，真空干燥30min。干燥后的沉淀物溶于10ml 0.1M盐酸溶液，冻干得外观白色粉末的不同氟化修饰程度19F癸酸氟化壳聚糖盐酸盐分子(产物命名为19FCS-1,19FCS-2)。
19FCS-2的水溶性比较差，无法进行后续的表征及应用评价，故用茚三酮反应法计算以上制备19FCS-1的氟化修饰程度依次为：19FCS-1,5.2％。
实施例5：制备7FCS的膀胱黏膜促渗透作用评价：将实施例2中所制备的7FCS和THP水溶液混合，经小鼠尿道灌注到膀胱，后制备小鼠膀胱冰冻切片，通过检测THP荧光在组织中的分布来评估药物载体的促药物膀胱黏膜吸收效率。
具体方法为：将10-12周的雌性C57BL/6小鼠以戊苯巴比妥溶液麻醉，以0.5％的FCS水溶液配置0.2％的THP溶液，通过密闭式静脉留置针将其灌注到小鼠膀胱，100μl，夹闭尿道1h，随后放出膀胱内的灌注液，用1ml超纯水冲洗膀胱，取膀胱组织放入组织包埋机中置于-80℃，后进行切片用荧光共聚焦显微镜进行检测。以单纯的等浓度THP水溶液或同样配制的THP壳聚糖水溶液作为对照。
实验结果：参见图1，左侧为不同条件下显微镜对小鼠膀胱组织切片的图片，右侧为对应的数据统计，右侧的横坐标为不同药物体系，纵坐标为relative fluorescenceintensity相对荧光强度。
如图1所示荧光共聚焦显微镜对小鼠膀胱组织切片进行观察，结果发现7FCS组小鼠膀胱横切面的药物荧光分布面积及强度均显著高于壳聚糖(CS)以及空白对照组(单纯THP水溶液)，表明FCS可显著提高药物在膀胱黏膜的组织渗透性，且随着氟化程度的增高促渗透作用提高，但当氟化程度达到一定程度时(7FCS,42.3％)制备所得的FCS的促渗透作用最为显著，此时制备的7FCS溶解性较低氟化取代壳聚糖差，不易于临床应用。以上结果表明FCS可显著提高药物的渗透吸收性能，增强药物在膀胱黏膜的吸收效率，但过高的氟化取代可能不利于材料的应用。
实施例6：13FCS的促膀胱灌注药物膀胱黏膜吸收的作用：将实施例3中所制备的13FCS和THP水溶液混合，经小鼠尿道灌注到膀胱，后制备小鼠膀胱冰冻切片，通过检测THP荧光在组织中的分布来评估药物载体的促药物膀胱黏膜吸收效率。
具体方法为：将10-12周的雌性C57BL/6小鼠以戊苯巴比妥溶液麻醉，以0.5％的13FCS水溶液配置0.2％的THP水溶液，通过密闭式静脉留置针将其灌注到小鼠膀胱，100μl，夹闭尿道1h，随后放出膀胱内的灌注液，用1ml超纯水冲洗膀胱，取膀胱组织放入组织包埋机中置于-80℃，后进行切片用荧光共聚焦显微镜进行检测。以同样配制的THP壳聚糖水溶液作为对照。
实验结果如图2所示FCS组小鼠膀胱纵切面的药物荧光分布面积及强度均显著高于壳聚糖(CS)，表明13FCS可显著提高药物在膀胱黏膜的渗透性；同时，13FCS-3的促渗透作用最强，其氟化修饰程度为21.4％。以上结果也表明FCS促灌注药物膀胱黏膜渗透作用可能是壳聚糖阳离子骨架与氟化脂肪链共同作用的结果，当然此种原因也可能是多元化的。
实施例7：为了筛选促灌注药物膀胱黏膜渗透效果最好的氟化壳聚糖，对实施例4中19FCS-1以及上述各氟化修饰种类中效果最好的FCS进行小鼠体内评价。
具体方法为：将10-12周的雌性C57BL/6小鼠以戊苯巴比妥溶液麻醉，分别以0.5％的7FCS-4，13FCS-3，19FCS-1水溶液配置0.2％的THP溶液，通过密闭式静脉留置针将其灌注到小鼠膀胱，100μl，夹闭尿道1h，随后放出膀胱内的灌注液，用1ml超纯水冲洗膀胱，取膀胱组织放入组织包埋机中置于-80℃，后进行切片用荧光共聚焦显微镜进行检测。以单纯的等浓度THP水溶液或同样配制的THP壳聚糖水溶液作为对照。
实验结果：如图3所示荧光共聚焦显微镜对小鼠膀胱组织切片进行观察，结果发现19FCS组小鼠膀胱横切面的药物荧光分布面积及强度均较THP与CS组具有显著差异，但13FCS-3的促灌注药物渗透性作用最为突出。
实施例8：对实施例7中不同种类氟化修饰氟化壳聚糖进行体外、体内安全性评价，具体实验方案如下：
以CCK-8(Cell Counting Kit-8)法(一种成熟体外评价细胞活性的评价方法)评价氟化壳聚糖对SV-HUC-1人正常膀胱上皮细胞的细胞毒作用考察氟化壳聚糖的体外生物安全性，具体操作如下：以1x104个/孔T24细胞接种到96孔板，37℃，5％CO2培养过夜，加入不同种类氟化壳聚糖(500ug/ml)的无血清培养基继续培养24h，然后加入适量cck-8，最终以细胞存活率评价氟化壳聚糖的体外安全性。实验结果如图4中a所示，13F-3(13FCS-3的简称)具有很好的体外细胞安全性，结合上述研究结果表明13F-3具有最为显著的促灌注药物膀胱黏膜吸收的作用，同时具有较好的体外细胞安全性。为了进一步评价FCS(13F-3)的生物安全性，对其进行进一步的小鼠体内安全性评价实验。
将10-12周健康C57BL/6小鼠分为三组，每组8只。实验组以15mg/ml氟化壳聚糖或壳聚糖1％醋酸水溶液灌注1h，每周灌注一次，共三周，空白对照组灌注等体积双蒸水，以小鼠的体重、生存率以及第一次给药后第28天小鼠膀胱切片的HE、免疫组化分析(CD45和Ki67)结果评价氟化壳聚糖的体内生物安全性。
实验结果发现，小鼠在灌注壳聚糖后第二天就出现体重骤降，小鼠活动萎靡的状况并且从治疗后的第二天起小鼠出现死亡，并在陆续的3天内实验组8只小鼠全部死亡，而氟化壳聚糖组小鼠无死亡出现，如图4b所示，FCS组小鼠体重与空白对照组无明显差异。同时，如图4c所示，取各组灌注后小鼠膀胱与空白对照组小鼠膀胱对比发现，壳聚糖灌注组小鼠膀胱相对于空白组小鼠膀胱充血严重，HE染色以及图5中CD45，Ki67免疫荧光结果表明壳聚糖灌注组小鼠膀胱出现了严重得炎症应激与充血水肿，而FCS组与空白对照组无明显差异。以上实验结果表明氟化壳聚糖(13FCS-3)可显著提高灌注药物在膀胱黏膜的生物利用度，同时高浓度的氟化壳聚糖不会引起明显的膀胱黏膜、上皮损伤，具有作为膀胱灌注药物载体的可能性。
实施例9：F-PEI膀胱灌注多肽蛋白药物载体的应用，以多肽药物MPI,以及蛋白药物CAT-Ce6为例
(1)氟化聚醚酰亚胺(F-PEI)的合成
具体操作如下：适量3-(perfluorohex-1-yl)-1,2-propenoxide缓慢滴加到枝化聚醚酰亚胺(PEI)的甲醇溶液中，室温搅拌48h。反应粗产物分别用甲醇/双蒸水透析纯化(MWCO3500Da)，冷冻干燥得终产物。通过1H NMR对产物进行结构鉴定，利用氟元素分析计算分子中的平均氟取代数。
(2)MPI/F-PEI，CAT-Ce6/F-PEI纳米药物体系的制备及表征
通过将多肽(MPI)、蛋白(CAT)药物与F-PEI的水溶液室温混合2h即可得到MPI/F-PEI，CAT/F-PEI NPs。动态光散射仪测得其水合粒径约为200-300nm,带有少量正电荷，透射电子显微镜(TEM)成像(图6，7)表征其为均一的球形粒子。
(3)MPI/F-PEI NPs，CAT-Ce6/F-PEI NPs的膀胱黏膜渗透性评价
Ussing chamber(尤斯室，也叫尤斯灌流室)是研究跨上皮转运的工具，可用于包括离子转运、营养物质转运及药物转运等的研究。通过跨上皮转运的研究，可以了解上皮的药物透过上皮的吸收。本实例应用Ussing chamber评价以不同物料比制备的MPI-cy5.5/F-PEI NPs，CAT-ce6/F-PEI NPs的黏膜透过性，分别以MPI-cy5.5/PEI NPs，CAT-ce6/PEI NPs作为对照，小鼠麻醉，取膀胱于冰上剥离膀胱黏膜，固定在两小室中间的接口处。扩散室中加入3ml MPI-cy5.5/F-PEI NPs或CAT-ce6/F-PEI NPs的台式液，接收室加入等体积的空白台式液。每隔15分钟从接收室取0.5ml台式液，同时在接受室补充等体积的空白台式液，连续四次并通过荧光分光光度计检测其相应药物含量。实验结果显示F-PEI组多肽(图8)或蛋白药物的黏膜渗(图9)透指数papp要显著高于PEI组及free组(空白组)。
同时我们也在小鼠体内对其膀胱黏膜渗透性进行了考察。小鼠麻醉后，分别膀胱灌注含有等量荧光标记的多肽或蛋白药物溶液，MPI组不同药物体系(free MPI-cy5.5,MPI-cy5.5/PEI,MPI-cy5.5/F-PEI)在灌注药物不同时间后(15，30，60min)取膀胱制备冰冻切片(图10)；CAT组不同药物体系(free CAT-ce6,CAT-ce6/PEI,CAT-ce6/F-PEI)灌注1h后取膀胱制备冰冻切片，并通过荧光共聚焦显微镜分析荧光强度(图11)。实验结果表明与PEI以及free药物组相比F-PEI组的多肽及蛋白药物具有更加显著的膀胱黏膜渗透性，即F-PEI可显著改善多肽或蛋白药物的膀胱黏膜渗透性。
实施例10：FCS膀胱灌注蛋白药物载体的应用,以蛋白药物CAT-TCPP为例。
(1)CAT-TCPP/FCS纳米药物体系的制备及表征
通过将蛋白药物(CAT-TCPP)药物与FCS的水溶液室温混合2h即可得到CAT-TCPP/FCS NPs。动态光散射仪测得其水合粒径约为200-300nm,带有少量正电荷，透射电子显微镜(TEM)成像(图12)表征其为均一的球形粒子。
(2)CAT-TCPP/FCS NPs的膀胱黏膜渗透性评价
我们在小鼠体内对其膀胱黏膜渗透性进行了考察。小鼠麻醉后，分别膀胱灌注含有等量荧光标记的蛋白药物溶液，CAT-TCPP组不同药物体系(free CAT-TCPP,CAT-TCPP/CS,CAT-TCPP/FCS)在灌注药物相同时间后(60min)取膀胱制备冰冻切片(图13)，并通过荧光共聚焦显微镜分析荧光强度。实验结果表明与壳聚糖(CS)以及free药物组相比FCS组的蛋白药物具有更加显著的膀胱黏膜滞留能力及渗透性，即FCS可显著改善蛋白药物的膀胱黏膜渗透性。
实施例11：(氟化壳聚糖用作蛋白药物载体的制备及表征)，以蛋白IgG和αPDL1为例
(1)FCS-IgG纳米药物体系的制备
免疫球蛋白具有抗体活性或化学结构，与抗体分子相似的球蛋白。以免疫球蛋白g(下称IgG)为例，研究氟化壳聚糖用作药物载体的制备及表征。将IgG水溶液与FCS水溶液室温下搅拌1小时即可得到FCS-IgG NPs，如图14左图所示，横坐标为颗粒尺寸，纵坐标为数量，FCS-IgG动态光散射水合粒径约为200nm。以抗程序性死亡受体配体-1(αPDL1)单抗为例，研究氟化壳聚糖用作药物载体的制备及表征。如图14左图所示，横坐标为颗粒尺寸，纵坐标为数量，FCS-αPDL1动态光散射水合粒径约为200nm。
(2)不同质量比例FCS-IgG NPs合成与表征
将IgG水溶液与FCS水溶液室温下搅拌1小时即可得到FCS-IgG NPs，动态光散射水合粒径约为200nm。固定标记FITC荧光的IgG的终浓度为0.2mg/ml,分别加入终浓度为0.2mg/ml,0.1mg/ml以及0.05mg/ml的FCS水溶液，制成FCS:IgG＝1:1,1:2,1:4(m/m)NPs，并检测其动态光散射水合粒径与所带电荷量(图14)，FCS比例越高，电荷越正。
实施例12：氟化壳聚糖用作透皮药物载体的应用，以蛋白IgG和αPDL1为例。
使用立式扩散池(图15)对小鼠皮肤进行体外透皮表征。该装置由上下两个杯状磨口容器对合而成，皮肤样本夹在两室之间，用于体外渗透性的研究。剪取1.5cm＊1.5cm大小的C57小鼠皮肤，置于样品层(样品层有效渗透面积为1.13cm2)，验漏后在取样室逐步加入PBS缓冲液至与皮肤接触，记录加入液体体积。取1mL不同比例的FITC荧光素标记的FCS-IgG的PBS溶液加入进样室，封口防止挥发，在37℃下搅拌，并于不同时间点从取样室取样，检测样品荧光强度，并加入等量PBS维持取样室体积。
荧光透过率计算方式如下
Figure BDA0002374780560000161
其中，P为荧光的透过率，Vi为第i次取样体积，默认为3＊100μL，Fi为第i次取样的平均荧光强度，Fn为第n次取样的平均荧光强度，Vs为取样池体积，约为19mL,不同取样池略有偏差，V0为进样池体积，F0为进样池样品平均荧光强度。
得到相应透过率数据如图16，氟化壳聚糖用作透皮药物载体可以帮助药物成功透过小鼠皮肤，药物与壳聚糖优选质量比为1：1。
(2)小鼠肿瘤透过率评价
a)Cy5.5标记的FCS-IgG的C57小鼠B16肿瘤模型渗透评价
将等质量的
Figure BDA0002374780560000171
软膏与FCS-IgG水溶液混合，可见半透明软膏变为乳白色，混合均匀后涂抹于约100mm3的小鼠B16肿瘤部位，使用
Figure BDA0002374780560000172
TegadermTM Film将小鼠覆盖，防止软膏被破坏，24小时后，取下小鼠皮下肿瘤，包埋于OCT胶中，-80℃冷冻过夜，制成10mm切片，在蔡司共聚焦显微镜LSM 800下进行肿瘤全景拼接拍图，获得肿瘤部位FCS-IgG渗透情况(图17)，图中箭头表示表层皮肤，DAPI信号表示细胞核，Cy5.5荧光信号表示标记有荧光的IgG，Merged表示两者叠加。游离的IgG和普通的壳聚糖载体仅仅停留在皮肤表层，而IgG在氟化壳聚糖的帮助下可以到达肿瘤内部，结果表明氟化壳聚糖用作透皮药物载体可以帮助药物成功透过小鼠皮肤。
b)FCS-αPDL1抗体的C57小鼠B16肿瘤模型渗透评价
为了防止染料脱落造成的误差，我们进行了FCS-αPDL1抗体的C57小鼠B16肿瘤模型渗透评价，在涂抹6小时后，我们取下小鼠皮下肿瘤，包埋后切片，并在染色同时使用FITC-Rat anti mouse-IgG对肿瘤内的mouseαPDL1进行特异性标记，共聚焦显微镜成像如图18，箭头表示表层皮肤，FITC荧光信号表示标记有荧光的IgG，结果表明氟化壳聚糖用作透皮药物载体可以帮助药物成功透过小鼠皮肤。
实施例13：氟化壳聚糖用作吸入药物载体的应用，以蛋白IgG和αPDL1为例。
(1)FCS-IgG纳米药物体系的制备
将IgG水溶液与FCS水溶液室温下搅拌1小时即可得到FCS-IgG NPs，动态光散射水合粒径约为200nm。
(2)Cy5.5标记的FCS-IgG的小鼠肺部渗透评价
在肺部吸入给药24h后将小鼠解剖，取肺部组织在小动物成像仪观察Cy5.5标记的药物滞留。图19中1为游离的IgG-Cy5.5，2为CS-IgG-Cy5.5，3为FCS-IgG-Cy5.5。其中荧光信号表示标记有荧光的IgG，氟化壳聚糖作为肺部给药药物载体表现出最优的药物滞留效果。
肺部给药24小时后，解剖取肺，包埋于OCT胶中，-80℃冷冻过夜，制成10mm切片，在蔡司共聚焦显微镜LSM 800下进行肺叶全景拼接拍图，获得肺部FCS-IgG渗透情况(图20).其中Cy5.5荧光信号表示标记有荧光的IgG。游离的IgG难以在肺部有效滞留，普通的壳聚糖载体主要停留在支气管口附近，氟化壳聚糖作为肺部给药药物载体表现出最优的药物渗透和扩散效果。
对所公开的实施例的上述说明，使得本技术领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理与特点相一致的最宽的范围。

Claims (17)

1.一种作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物，具有如下结构：含氟化合物共价连接在壳聚糖主链上，所述壳聚糖的分子量范围在5000-5000000，
所述含氟化合物为如下化学式(Ⅰ)
Figure FDA0002374780550000011
所示的含氟脂肪链，或式(Ⅱ)
Figure FDA0002374780550000012
所示的芳香环功能基团，所述R1为卤素(氟,氯，溴，碘)、卤素取代的烷烃、环烷烃、醛基、羧基、双键、炔键、羟基、磺酰氯、磺酸键或巯基这些能够与伯氨基反应的活性基团。
2.一种作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物，具有如式(Ⅳ)所示的含有伯氨基的壳聚糖分子骨架：
Figure FDA0002374780550000013
所述壳聚糖的伯氨基与含氟功能基团之间形成的连接基团为：-NH-、-N＝C-、-NHCH2CH(OH)-、-NHCH2CH(OH)CH2O-、
Figure FDA0002374780550000014
Figure FDA0002374780550000015
以及衍生基团；
所述含氟功能基团为含氟脂肪链、芳香环功能基团。
3.根据权利要求1所述的作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物，其特征在于：所述式(Ⅰ)中x为0-3的整数，y为0-20的整数，z为0-8的整数，R2为CF3、CHF2、CH2F、或CH3(当y不为0)；
所述含氟脂肪链化合物是指含氟烃基及其衍生物，包括三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸、九氟戊酸、十一氟己酸、十三氟庚酸、十五氟辛酸、十七氟壬酸、十九氟奎酸、全氟丁酸酐、全氟庚酸酐、全氟癸酸酐、2，2，3，3，4，4，4-七氟丁基丙烯酸酯、3-(1H，1H，5H八氟戊氧基)-1，2-环氧丙烯、九氟丁基璜酰胺酐及其衍生物。
4.根据权利要求1所述的作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物，其特征在于：所述式(Ⅱ)中R为H,CH3,OH,NO2,O,CF3,F,CH2OH,CN,NCO,或(CF2)aCF3(a为1-20的整数)等，且至少一个R为F；
所述含氟芳香环化合物包括3-氟苯甲酸、3，5-二氟苯甲酸、2，3，5，6-四氟-4-甲基苯甲酸、五氟苯甲酸、2-氟-3-(三氟甲基)苯甲酸及其衍生物。
5.根据权利要求1所述的作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物，其特征在于：所述壳聚糖和含氟化合物共价连接，在所述壳聚糖分子表面进行修饰，构成一种药物载体，其结构如式(V)所示，b、c均为20-500的整数，式(V)如下：
Figure FDA0002374780550000021
其中，B为含氟功能基团与壳聚糖伯氨基形成的连接基团，C为含氟脂肪链、芳香环功能基团。
6.根据权利要求1所述的作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物，其特征在于：所述含氟脂肪链是带有可以与氨基反应的活性基团的一类含氟化合物，包括如式(Ⅵ)所示：
Figure FDA0002374780550000031
其中A为-COOH、
Figure FDA0002374780550000032
能够与伯氨基反应的活性基团，x为0-3的整数，y为0-8的整数。
7.根据权利要求1所述的作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物，其特征在于：所述含氟芳香环化合物是带有可以与氨基反应的活性基团的一类含氟化合物，包括如式(Ⅶ)所示：
Figure FDA0002374780550000033
Figure FDA0002374780550000041
8.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物，其特征在于：所述氟化修饰的壳聚糖衍生物作为如下药物的药物载体，所述如下药物为小分子药物、多肽、蛋白药物、不同药物的组合药物以及药物与其它药用辅料的组合药物。
9.含氟化合物修饰的壳聚糖作为药物载体的应用，其特征在于：权利要求1至8中任一权利要求所述的氟化修饰的壳聚糖衍生物可以作为小分子药物、多肽、蛋白药物、不同药物的组合药物以及药物与其它药用辅料的组合药物的药物载体应用。
10.一种制备氟化修饰的壳聚糖衍生物的方法，其包括如下步骤：
制备壳聚糖醋酸水溶液，称取壳聚糖加入醋酸水溶液中，搅拌使其充分溶解，随后滴加氢氧化钠，搅拌至溶液澄清，pH在6.2-6.8；
含氟化合物的活化，称取含氟化合物将其溶于适量无水二甲基亚砜中，依次加入反应量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(简称NHS)避光搅拌；
将所述活化好的含氟化合物溶液滴加到快速搅拌的壳聚糖溶液中，避光搅拌充分反应。
11.根据权利要求10所述制备氟化修饰的壳聚糖衍生物的方法，进一步包括如下步骤：将充分反应的溶液缓慢滴加到氢氧化钾乙醇溶液中搅拌，过滤沉淀，用大量无水乙醇冲洗，至滤液呈中性，沉淀经甲醇、乙醚洗涤脱水，真空干燥，干燥后的沉淀物溶于盐酸溶液，冻干得氟化壳聚糖盐酸盐。
12.一种制备3-氟苯甲酸氟化壳聚糖的方法，其包括如下步骤：
(1)制备壳聚糖醋酸水溶液：称取充分干燥的壳聚糖加入醋酸水溶液中，搅拌使充分溶解，随后缓慢滴加氢氧化钠，搅拌至溶液澄清，pH在6.2-6.8；
(2)3-氟苯甲酸的活化：称取3-氟苯甲酸，将其溶于适量无水二甲基亚砜中，依次加入反应量EDC，NHS避光充分搅拌；
(3)3-氟苯甲酰壳聚糖的制备：将上述活化好的3-氟苯甲酸溶液分别缓慢滴加到快速搅拌的壳聚糖溶液中，避光搅拌充分反应。
13.根据权利要求12所述制备3-氟苯甲酸氟化壳聚糖的方法，进一步包括如下步骤：
将充分反应的溶液缓慢滴加到氢氧化钾乙醇溶液中充分搅拌，过滤沉淀，用大量无水乙醇冲洗，至滤液呈中性，沉淀经甲醇、乙醚洗涤脱水，真空干燥；
干燥后的沉淀物溶于盐酸溶液，冻干得3-氟苯甲酸氟化壳聚糖盐酸盐分子。
14.一种制备全氟庚酸氟化壳聚糖的方法，其包括如下步骤：
(1)制备壳聚糖醋酸水溶液：称取充分干燥的壳聚糖加入醋酸水溶液中，搅拌使充分溶解，随后缓慢滴加氢氧化钠，搅拌至溶液澄清，pH在6.2-6.8；
(2)全氟庚酸(13氟庚酸)的活化：称取全氟庚酸，将其溶于适量无水二甲基亚砜中，依次加入适量EDC，NHS避光充分搅拌；
(3)13F庚酸壳聚糖的制备：将上述活化好的全氟酸溶液缓慢滴加到快速搅拌的壳聚糖溶液中，避光搅拌充分反应。
15.根据权利要求14所述制备全氟庚酸氟化壳聚糖的方法，其进一步包括如下步骤：
将充分反应的溶液缓慢滴加到氢氧化钾乙醇溶液中充分搅拌，过滤沉淀，用大量无水乙醇冲洗，至滤液呈中性，沉淀经甲醇、乙醚洗涤脱水，真空干燥，干燥后的沉淀物溶于盐酸溶液，冻干得全氟庚酸氟化壳聚糖盐酸盐。
16.根据权利要求1所述的作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物，其特征在于：所述氟化修饰的壳聚糖衍生物为全氟庚酸氟化壳聚糖盐酸盐分子，所述全氟庚酸氟化壳聚糖盐酸盐的氟化修饰程度依次为18％～25％，或为20％～22％。
17.一种药物复合物，其特征在于：包括根据权利要求1至8中任一权利要求所述的作为药物载体用的氟化修饰的壳聚糖衍生物以及药物，所述药物包括小分子药物、多肽、蛋白药物、不同药物的组合药物以及药物与其它药用辅料的组合药物。
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