CN113930454A - 壳聚糖-聚二甲双胍在作为基因转染试剂方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，本发明公开了壳聚糖‑聚二甲双胍（CS‑PolyMet）在作为基因转染试剂方面的应用。还公开了壳聚糖‑聚二甲双胍的制备方法，包括以下过程：称取0.5 g壳聚糖，加20 mL水，搅拌至充分溶胀，加入2 M盐酸1 mL，继续搅拌至壳聚糖完全溶解，放入100℃油浴中，搅拌条件下分批加入0.5 g双氰胺，回流反应24 h，反应完毕后纯水透析3天，冷冻干燥，得白色絮状的CS‑PolyMet粉末，易溶于水，粉末可4℃保存。本发明合成的壳聚糖‑聚二甲双胍可通过聚合物本身正电荷与细胞周期同步效应高效转染目的基因，转染效果优于现有市售试剂，并且细胞毒性较市售试剂更低，具有潜在的市场应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及壳聚糖-聚二甲双胍(CS-PolyMet)在作为基因转染试剂方面的应用及壳聚糖-聚二甲双胍(CS-PolyMet)的制备方法。
背景技术
基因药物易于降解，不易穿透细胞膜等各类屏障系统进入细胞，需借助有效的递送载体才能发挥作用。因此，开发高效的基因递送载体是当前亟待解决的研究问题。基因转染是生命科学、医药、农业领域的常用操作技术。现有的基因转染技术普遍存在转染效率低以及毒性等问题。
目前，常用的基因递送载体包括病毒载体与非病毒载体二类。病毒载体(腺相关病毒和慢病毒)可有效递送基因，但有许多局限性，如具有潜在的致癌作用、免疫原性、有限的DNA包装尺寸，生产难度大。非病毒载体表现出相对较少的副作用，在基因递送方面具有独特优势。阳离子聚合物是一类应用最为广泛的非病毒载体，在生理pH范围内具有较高的DNA包装能力。阳离子聚合物通过修饰、静电吸附等作用与核酸形成纳米复合物，提高核酸稳定性与细胞摄取效率，实现基因转染。常用的阳离子聚合物有聚乙烯亚胺(PEI)赖氨酸，聚己内酯等，存在毒性较高、合成成本高等缺点。
壳聚糖(Chitosan)是天然高分子碱性多糖，来源广泛，生物相容，无毒，无免疫原性，生物可降解，经酰基化、羧基化、羟基化、季铵化、醇化、酯化等改性修饰制备成的功能化衍生物常常具有较好的理化性质与生物学性能，能够满足生物化工领域的多种需求。二甲双胍是一种安全性高、成本低的双胍类药物，临床用于治疗2型糖尿病。目前，发现二甲双胍还是一种低毒的抗肿瘤药物，通过PP2A-GSK3β-MCL-1通路促进肿瘤细胞凋亡，对乳腺癌、肺癌等多种癌症有效。也有报道指出二甲双胍的抗癌作用主要归因于其对AMPK激酶的激活作用和对mTOR的抑制作用。本发明基于壳聚糖与二甲双胍，提出一种基因转染试剂，解决现有基因转染试剂毒性高、合成成本高、转染效率有限的问题。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题或不足，本发明提供一种壳聚糖-聚二甲双胍(CS-PolyMet)在作为基因转染试剂方面的应用及壳聚糖-聚二甲双胍(CS-PolyMet)的制备方法。
为实现上述发明目的，本发明的实施例提供壳聚糖-聚二甲双胍(CS-PolyMet)在作为基因转染试剂方面的应用，并与市售试剂进行转染效果比较。
进一步的，壳聚糖-聚二甲双胍可使细胞周期同步至G2/M期，实现高效的细胞转染。
进一步的，具体包括以下过程：
S1、试剂的预混：CS-PolyMet溶液和pDNA溶液等体积混合；CS-PolyMet与DNA/RNA的质量比为10:1，涡旋3s，37℃温育30min；制备得到待转染的复合物CS-PolyMet/pDNA；
S2、转染DNA/RNA至细胞：贴壁细胞以一定密度接种至6孔板，培养24h，换用无血清培养基，每孔分别加入CS-PolyMet/pDNA(含2μg pDNA)，培养24h。
本发明的实施例还提供一种基因转染试剂，其特征在于，采用壳聚糖-聚二甲双胍。
进一步的，所述基因转染试剂通过聚合物所携带的正电荷负载基因并穿膜，通过二甲双胍的活性作用使细胞周期同步至G2/M期，一步实现高效的基因转染。
进一步的，所述基因转染试剂还可添加医学上可接受的辅助试剂。
本发明的实施例另外还提供壳聚糖-聚二甲双胍的制备方法，其特征在于，包括以下过程：称取0.5g壳聚糖(Chitosan，CS)，壳聚糖的分子量为：50-190kDa，加20mL水，搅拌至充分溶胀，加入2M盐酸1mL，继续搅拌至壳聚糖完全溶解，放入100℃油浴中，搅拌条件下分批加入0.5g双氰胺，回流反应24h，反应完毕后纯水透析3天(MWCO：14kDa)，冷冻干燥，得白色絮状的CS-PolyMet粉末，易溶于水，粉末可4℃保存。
进一步的，所述壳聚糖-聚二甲双胍的合成路线如下：
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
(1)本发明采用壳聚糖与双氰胺为原料，两者按一定比例接枝共聚，制备壳聚糖-聚二甲双胍；该聚合物易溶于水，带有大量正电荷，能有效负载各类核酸药物，所带胍基有利于核酸药物跨越组织屏障、透过细胞膜，促进药物递送。同时，该聚合物还保有二甲双胍的生物学活性。本发明制备的壳聚糖-聚二甲双胍在转染剂量下有细胞周期同步作用，可使细胞同步至G2/M期，而细胞在G2/M期处于分裂前的准备阶段，大量合成RNA与蛋白质，细胞同步于这一时期有利于基因转染。本发明通过具体实施例中的相关实验研究证实了本发明制备的壳聚糖-聚二甲双胍在同等转染条件下转染效果优于现有市售试剂。
(2)本发明的转染试剂采用壳聚糖-聚二甲双胍，通过该聚合物携带的正电荷负载基因并穿膜，通过二甲双胍的活性作用使细胞周期同步至G2/M期，一步实现高效的基因转染。因此，本发明弥补了现有市售转染试剂仅能通过阳离子穿膜作用实现转染、需另外添加细胞周期同步试剂来提高转染效率的缺陷与不足。
(3)本发明的转染试剂使用天然来源的壳聚糖，生物相容性好、生物可降解，另一重要组分为低毒活性成分二甲双胍。因此，本发明的转染试剂毒性低，对细胞影响小，在转染剂量或高于转染剂量3倍内对细胞没有明显的毒性，优于现有市售试剂，弥补了现有市售试剂毒性较大的缺陷与不足。
(4)本发明的转染试剂使用壳聚糖-聚二甲双胍，壳聚糖-聚二甲双胍的原料来源广泛，合成成本低，合成过程操作便捷。综合壳聚糖-聚二甲双胍低毒、高效的基因转染效果与低廉的生产成本，使其有望替代现有试剂成为新型商用基因转染试剂，具备市场化应用价值。
附图说明
图1为本发明的壳聚糖-聚二甲双胍合成路线。
图2为本发明的实施例中聚合物的核磁共振氢谱谱图；图中，CS：壳聚糖，CS-PolyMet：壳聚糖-聚二甲双胍。
图3为本发明的实施例中聚合物的红外光谱谱图，CS：壳聚糖，CS-PolyMet：壳聚糖-聚二甲双胍。
图4为本发明的实施例中聚合物的基因负载能力评估结果图；其中，图4A为CS-PolyMet与pDNA之间不同配比形成复合物的粒径与Zeta电位参数；图4B为核酸电泳检测CS-PolyMet与pDNA之间不同配比形成复合物的凝胶阻滞结果图；图4C为核酸电泳检测CS-PolyMet与pDNA以及Chitosan与pDNA形成复合物的凝胶阻滞结果图。
图5为本发明的实施例中CS-PolyMet的转染效果图。其中，图5A：裸pDNA、CS-PolyMet/pDNA、Lipo2000/pDNA转染Hela细胞24h，共聚焦显微镜拍摄细胞内EGFP表达图像，Image J统计EGFP信号强度；图5B：裸pDNA、CS-PolyMet/pDNA、Lipo2000/pDNA以及2倍量的Lipo2000/pDNA(2X Lipo2000/pDNA)转染SUM159细胞24h，共聚焦显微镜拍摄细胞内EGFP表达图像，Image J统计EGFP信号强度；Bars＝50μm。
图6为本发明的实施例中CS-PolyMet的细胞毒性结果图。其中，图6A为不同浓度的pDNA、CS-PolyMet/pDNA、Lipo2000/pDNA转染Hela细胞48h后的细胞存活率；图6B为不同浓度的pDNA、CS-PolyMet/pDNA、Lipo2000/pDNA转染SUM159细胞48h后的细胞存活率。
图7为本发明的实施例中转染试剂对细胞周期的作用检测图；pDNA、CS-PolyMet/pDNA、Lipo2000/pDNA分别转染Hela细胞24、48、72h后流式检测的细胞周期。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
实施例一
壳聚糖-聚二甲双胍(CS-PolyMet)的制备与表征
称取0.5g壳聚糖(Chitosan，CS，分子量50-190kDa)，加20mL水，搅拌至充分溶胀，加入2M盐酸1mL，继续搅拌至壳聚糖完全溶解，放入100℃油浴中，搅拌条件下，分批加入0.5g双氰胺，回流反应24h，反应完毕后纯水透析3天(MWCO：14kDa)，冷冻干燥，得白色絮状的CS-PolyMet粉末，易溶于水，粉末可4℃保存。壳聚糖-聚二甲双胍的合成路线见附图1。
实施例二
验证实施例一所制备的CS-PolyMet是否制备成功
分别称取5mg CS、CS-PolyMet，加0.5mL含1％氘代盐酸的重水溶解，测定1H NMR谱图。取CS、CS-PolyMet粉末，加入适量KBr晶体，玛瑙研钵中研磨成细小均匀的粉末，压片，傅立叶变换红外光谱仪测定并记录红外光谱。测定参数：分辨率4cm-1，扫描波长400-4000cm-1。测试结果见附图2-3。
如图2的聚合物的核磁共振氢谱谱图所示，由图2中谱1可知，2.0、2.7、3.4-3.6ppm处分别为壳聚糖的特征氢峰a、b、c。与壳聚糖相比，CS-PolyMet的谱图中仍可见CS的特征氢峰a、b、c，并且增加了3.8ppm与4.3ppm(d)处与胍基相邻的次甲基氢峰(图2中谱2)，说明成功向壳聚糖结构中引入胍基。
如图3的聚合物红外光谱图所示，由图3谱1可以看出3300cm-1附近和1600cm-1附近分别为壳聚糖的N-H伸缩振动和弯曲振动峰，2800cm-1附近为C-H伸缩振动峰，1100cm-1附近为C-C伸缩振动峰；随着壳聚糖结构中引入胍基(图3中谱2：CS-PolyMet)，2800cm-1附近信号峰增强，推断为C＝N出现、C-H数目增多引起，表明壳聚糖-聚二甲双胍结构形成。综合图2、图3的结果可以证明壳聚糖-聚二甲双胍制备成功。
实施例三
以质粒DNA作为目的基因模型，测试CS-PolyMet的基因负载能力
质粒DNA(pDNA)为一类常见的转染目的分子，分子量相较于小干扰RNA、microRNA等更大，转染更加困难，转染效果往往更差，本发明采用表达绿色荧光蛋白EGFP的pDNA作为目的基因模型，测试聚合物基因负载能力。分别配制2mg/mL CS-PolyMet水溶液和0.2mg/mLpDNA溶液，设置接近市售试剂的转染配比范围，按不同比例(见表1)混合，涡旋3s，37℃温育30min，制得纳米复合物，分别命名为CS-PolyMet/pDNA1-5。同法使用2mg/mL壳聚糖溶液制备Chitosan/pDNA1-3用于对照。马尔文电位/粒度分析仪测定上述各纳米复合物的粒径、电荷。阳离子聚合物经静电吸附和物理缠绕包载目的基因，有效包载的pDNA在凝胶电泳中受电流影响减小，移动缓慢，发生阻滞效应，故凝胶阻滞可考察聚合物是否有效包载目的基因。分别量取一定体积的CS-PolyMet/pDNA1-5、Chitosan/pDNA1-3溶液(均含200ng pDNA)，加至1％(w/v)低熔点琼脂糖凝胶上样孔，180V电泳20min，EB显色，生物电泳图像分析系统观察pDNA条带并拍照，观察与裸pDNA相比，不同配比聚合物与pDNA形成纳米复合物后对pDNA的阻滞作用。
表1纳米复合物配比
上述聚合物基因负载能力评估实验结果见图4。由图4A可知，不同配比纳米复合物CS-PolyMet/pDNA 1-5均带正电，CS-PolyMet/pDNA 1的粒径最大，可能与其聚合物含量较少、结构松散有关。由纳米复合物的凝胶阻滞结果可以看出，CS-PolyMet/pDNA 1、CS-PolyMet/pDNA 2无法有效阻滞pDNA随电流迁移，有条带拖尾，CS-PolyMet/pDNA 3-5均未见pDNA电泳条带，仅上样孔内可见pDNA形成的亮斑(图4B)，表明CS-PolyMet在CS-PolyMet/pDNA 3-5的质量配比下可有效包载pDNA，阻滞pDNA随电流迁移。比较本发明的合成材料CS-PolyMet与原料壳聚糖的功能差异，可见在相同质量配比下，Chitosan/pDNA均有条带拖尾，未能有效包载pDNA(图4C)，表明本发明合成材料的基因包载性能远优于原料壳聚糖，也证实对原料修饰改性的必要性。从以上结果可知，CS-PolyMet是有潜力的基因递送载体材料。由于CS-PolyMet/pDNA 3能够有效包载基因，同时所用的聚合物材料相对较少，所以后续实验优选CS-PolyMet/pDNA 3的质量配比进行实验。
实施例四
使用上述制备的CS-PolyMet作为基因转染试剂
以表达绿色荧光蛋白EGFP的pDNA转染贴壁细胞Hela和SUM159为例，说明转染步骤，其中PBS、市售转染试剂Lipo2000均为对照：
1.试剂的预混：CS-PolyMet溶液和pDNA溶液等体积混合(含CS-PolyMet与DNA/RNA的质量比为10:1)，涡旋3s，37℃温育30min；Lipo2000按照试剂盒说明书操作步骤使用。制备得到待转染的复合物CS-PolyMet/pDNA、Lipo2000/pDNA。
2.转染DNA/RNA至细胞：Hela细胞以5×104细胞/孔的密度接种至底部含载玻片的6孔板，培养24h，换用无血清培养基，每孔分别加入PBS、Lipo2000/pDNA、CS-PolyMet/pDNA(含2μg pDNA)以及2倍量的Lipo2000/pDNA，培养24h。
转染效果检查：用PBS洗去细胞培养基，DAPI室温避光染色20min，PBS洗去多余染料，4％多聚甲醛室温固定5min，甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察，检测细胞中EGFP表达情况，即反应各转染试剂的细胞转染效果。同法测试各转染试剂在SUM159细胞的转染效果。所得结果见图5。由图5A可知，仅用编码绿色荧光蛋白EGFP的pDNA转染Hela细胞24h后，镜下观察未见明显的绿色荧光信号，用市售试剂Lipo2000转染该pDNA，24h后胞内可见微弱的绿色荧光蛋白信号，相同条件下用CS-PolyMet产生的转染效果最强。在图5B的SUM159细胞结果中，仅pDNA转染组未见明显的绿色荧光信号，用Lipo2000转染pDNA后细胞内产生微弱绿色荧光信号，用CS-PolyMet转染pDNA后细胞内绿色荧光信号显著增强，表明细胞内绿色荧光蛋白表达显著增加，实现了高效基因转染，与上述Hela细胞的实验结果一致。特别的是，用2倍量的Lipo2000/pDNA转染至细胞后，细胞内绿色荧光信号显著强于常规量Lipo2000转染，表明蛋白表达量上升、转染效率提高，但镜下观察可见细胞核固缩、细胞形态改变、贴壁性减弱，表明加大Lipo2000使用量对细胞的毒性增加。综上，我们可以得出结论：本发明合成的壳聚糖-聚二甲双胍(CS-PolyMet)作为转染试剂可实现高效的基因转染，效果优于现有市售试剂，并且未见明显的细胞毒性。
实施例五
进一步对本发明合成的CS-PolyMet进行细胞毒性检查
将Hela细胞分别接种至96孔板(3000细胞/孔)，培养24h，更换新鲜培养基，每6孔为一组，每组分别加入一定浓度的pDNA、CS-PolyMet/pDNA、Lipo2000/pDNA，培养48h；去上清，每孔加入100μL 10％MTT，37℃孵育1h，用Microplate分光光度计测450nm处的吸光度，以PBS处理组细胞活率计为100％。同法检测转染试剂对SUM159细胞的影响。毒性测试结果见图6；其中，图6A为不同浓度的pDNA、CS-PolyMet/pDNA、Lipo2000/pDNA转染Hela细胞48h后的细胞存活率情况，图6B为不同浓度的pDNA、CS-PolyMet/pDNA、Lipo2000/pDNA转染SUM159细胞48h后的细胞存活率情况；在Hela细胞和SUM159细胞中，pDNA本身不对细胞存活率造成明显影响，即pDNA本身无明显毒性，而转染复合物随加入量的增加对细胞存活率的影响逐渐增强，可知转染试剂对细胞存活率存在影响，其中Lipo2000在高剂量时对细胞存活造成的影响最大，毒性较高。本发明的转染试剂CS-PolyMet对细胞的毒性总体较小，比现有市售试剂Lipo2000更适应细胞生物学等的实验需求。
实施例六
检测本发明转染试剂的细胞周期同步作用
Hela细胞以5×105细胞/孔接种至6孔板，培养24h，更换新鲜培养基，每孔分别加入pDNA、CS-PolyMet/pDNA、Lipo2000/pDNA(含2μg pDNA)，以PBS组为对照，培养24，48或72h；吸弃孔内液体，洗涤并收集孔内细胞，加75％酒精4℃固定30min，离心弃去上清，PBS洗涤，每孔细胞重悬于400μL PBS中，加1μL RNase A和2μL PI染液，轻轻吹打混匀，室温下避光静置30min，流式细胞仪测定，CellQuest软件分析。
细胞周期同步作用检查结果如图7所示，图7为pDNA、CS-PolyMet/pDNA、Lipo2000/pDNA分别转染Hela细胞24、48、72h后流式检测的细胞周期结果；与对照组相比，pDNA组与Lipo2000转染组在常规实验剂量下(含2μg pDNA)对细胞周期无明显作用。CS-PolyMet在48h以内可使细胞周期阻滞于G2/M期，随时间延长至72h，CS-PolyMet的细胞周期阻滞作用消失，可知CS-PolyMet在转染过程中具有细胞周期同步作用。
综合以上实施例结果可知，本发明合成的壳聚糖-聚二甲双胍相比于其他市售转染试剂具有成本低、制备便捷的优势，可通过聚合物本身正电荷与细胞周期同步效应高效转染目的基因，转染效果优于市售试剂，并且细胞毒性较市售试剂更低，具有潜在的市场应用价值。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.壳聚糖-聚二甲双胍(CS-PolyMet)在作为基因转染试剂方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，壳聚糖-聚二甲双胍可使细胞周期同步至G2/M期，实现高效的细胞转染。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体包括以下过程：
S1、试剂的预混：CS-PolyMet溶液和pDNA溶液等体积混合；CS-PolyMet与DNA/RNA的质量比为10:1，涡旋3s，37℃温育30min；制备得到待转染的复合物CS-PolyMet/pDNA；
S2、转染DNA/RNA至细胞：贴壁细胞以一定密度接种至6孔板，培养24h，换用无血清培养基，每孔分别加入CS-PolyMet/pDNA(含2μg pDNA)，培养24h。
4.一种基因转染试剂，其特征在于，采用壳聚糖-聚二甲双胍。
5.根据权利要求1所述的一种基因转染试剂，其特征在于，所述基因转染试剂通过聚合物所携带的正电荷负载基因并穿膜，通过二甲双胍的活性作用使细胞周期同步至G2/M期，一步实现高效的基因转染。
6.根据权利要求1所述的一种基因转染试剂，其特征在于，所述基因转染试剂还可添加医学上可接受的辅助试剂。
7.壳聚糖-聚二甲双胍的制备方法，其特征在于，包括以下过程：称取0.5g壳聚糖(Chitosan，CS)，壳聚糖的分子量为：50-190kDa，加20mL水，搅拌至充分溶胀，加入2M盐酸1mL，继续搅拌至壳聚糖完全溶解，放入100℃油浴中，搅拌条件下分批加入0.5g双氰胺，回流反应24h，反应完毕后纯水透析3天(MWCO：14kDa)，冷冻干燥，得白色絮状的CS-PolyMet粉末，易溶于水，粉末可4℃保存。
8.根据权利要求4所述的壳聚糖-聚二甲双胍的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖-聚二甲双胍的合成路线如下：
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