CN107903339B - 一种含两性氨基酸基团的壳聚糖衍生物及制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含两性氨基酸基团的壳聚糖衍生物及其制备方法与应用，该衍生物的结构如式I所示，其制备方法包括以下步骤：将氨基受保护的氨基酸溶于溶剂1中，加入亚磷酸二苯酯和缚酸剂，搅拌反应后生成双取代氨基保护的氨基酸膦酸酯，蒸除溶剂后加入溶剂2，得到溶液A；将6‑O‑三苯基甲醚化壳聚糖溶于N,N‑二甲基乙酰胺，加入三乙胺和四氯化碳，得到溶液B；置溶液B于冰水中，逐滴加入溶液A，搅拌反应，得到氨基酸改性壳聚糖衍生物粗品。本发明的壳聚糖衍生物一方面改善壳聚糖的水溶性，另一方面赋予其具有氨基酸基两性聚合物所特有的超亲水性、抗黏附性和响应性，且可以生物降解，具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医用高分子材料领域，具体涉及一种含两性氨基酸基团的壳聚糖衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
两性离子聚合物具有优异的生物相容性、超亲水性、抑制非特异性蛋白吸附、以及抑制细菌粘附和生物膜形成等特性，因而在生物医学和生物技术领域引起了极大的关注，可用于构建表面抗微生物粘附的生物医学装置和植入物，实现3D细胞包封，以及制备抑制不良生物反应的药物传输系统。
迄今为止，报道的绝大多数两性离子聚合物是经基于甜菜碱或氨基酸的两性离子乙烯基单体合成。前者包括羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯、磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱，后者包括丝氨酸甲基丙烯酸酯、半胱氨酸甲基丙烯酸酯、赖氨酸甲基丙烯酰胺、鸟氨酸甲基丙烯酰胺、N4–(2-甲基丙烯酰胺基乙基)天冬酰胺、N5-(2-甲基丙烯酰胺基乙基)谷氨酰胺和组氨酸甲基丙烯酰胺，等等。其中，基于天然结构单元氨基酸的两性离子聚合物尤其受到关注，其不仅具有与甜菜碱类聚合物相似的优异的超亲水性和抗粘附性能，还具有对酸碱度、温度和金属离子等多种刺激的响应性，在生物医用领域具有广泛的应用前景，但它们的不可降解性限制其在体内的一些生物医学应用。
发明内容
为了克服现有的两性离子聚合物不可降解的缺陷，本发明以具有良好生物相容性和生物可降解的天然高分子壳聚糖为骨架，采用磷酰化方法引入氨基酸两性基团，提供一种含两性氨基酸基团的壳聚糖衍生物。
本发明的另一目的在于提供上述壳聚糖衍生物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述壳聚糖衍生物在生物医学领域的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种含两性氨基酸基团的壳聚糖衍生物，其结构如式I所示：
式I中的R为氢或烷基；所述的烷基优选甲基；对应的氨基酸残基为丝氨酸残基或苏氨酸残基。
上述壳聚糖衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将氨基受保护的氨基酸溶于溶剂1中，加入亚磷酸二苯酯和缚酸剂，搅拌反应后生成双取代氨基保护的氨基酸膦酸酯，蒸除溶剂后加入溶剂2，得到溶液A；
(2)将6-O-三苯基甲醚化壳聚糖(CsTr)溶于N,N-二甲基乙酰胺，加入三乙胺和四氯化碳，得到溶液B；
(3)置溶液B于冰水中，逐滴加入溶液A，搅拌反应，得到氨基酸改性壳聚糖衍生物粗品，经脱保护基，纯化，冻干，得到含两性氨基酸基团的壳聚糖衍生物纯品。
步骤(1)所述的氨基受保护的氨基酸如式II所示，所述的缚酸剂优选吡啶；
式II中，R’优选芴甲氧羰酰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(BOC)或苄氧羰基(Cbz)，R与式I中的R对应一致；
步骤(1)所述的溶剂1优选N,N-二甲基乙酰胺(DMA)，所述的溶剂2优选异丙醇；
步骤(1)中，氨基受保护的氨基酸与亚磷酸二苯酯的摩尔比优选2:1；
步骤(2)所述的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖(CsTr)是由壳聚糖改性得到，改性方法按照文献“S.J.Nishmura,O.Kohgo,K.Kurita,Macromolecules 24(1991)4745-4748.”；
步骤(2)所述的溶液B中，每100mL二甲基乙酰胺中含有1～10g的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖，其中三乙胺、四氯化碳与6-O-三苯基甲醚化壳聚糖的氨基摩尔比优选为6:4:1；
步骤(3)中，溶液A、B混合后，CsTr的氨基与双取代氨基保护的氨基酸膦酸酯的摩尔比为1:(3-5)；
步骤(3)所述的反应时间优选12～24小时；
步骤(3)所述脱保护基的方法包括但不仅限于：三氟乙酸处理、哌啶/N,N-二甲基甲酰胺处理、Pd/C催化氢解；
步骤(3)所述的纯化优选透析、超滤。
本发明所述的含两性氨基酸基团的壳聚糖衍生物可以应用在植入物、组织工程、药物传输、创伤修复等生物医学领域中。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明的含两性氨基酸基团的壳聚糖衍生物以具有良好生物相容性和生物可降解的天然高分子壳聚糖为骨架，采用磷酰化方法偶联引入双氨基酸两性基团，一方面改善壳聚糖的水溶性，另一方面赋予其具有氨基酸基两性聚合物所特有的超亲水性、抗黏附性和响应性，且可以生物降解，在植入物、组织工程、药物传输、创伤修复等生物医学领域具有重要的应用前景。
附图说明
图1是磷酸二丝氨酸改性壳聚糖的分子式及1H NMR谱图。
图2是磷酸二丝氨酸改性壳聚糖的31P NMR谱图。
图3是磷酸二丝氨酸改性壳聚糖的溶血率图。
图4是含水磷酸二丝氨酸改性壳聚糖的差示扫描量热测试图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
磷酸二丝氨酸改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)1.108g的N-叔丁氧基羰基-L-丝氨酸(BOC-L-Serine)溶解于30ml的无水N,N-二甲基乙酰胺(DMA)，加入0.475ml的亚磷酸二苯酯和1.5ml的无水吡啶，搅拌反应4h，得到BOC保护的磷酰双丝氨酸；旋蒸除去所有溶剂，加入10ml的无水异丙醇，作为反应A液；
(2)0.2g的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖(CsTr)溶解于10ml无水DMA，加入0.475ml的四氯化碳和2ml的无水三乙胺，作为反应B液；
(3)置B液于冰水中，往B液逐滴加入A液，此时CsTr的氨基与磷酰双丝氨酸的摩尔比为1:5，搅拌过夜12h，得到3-O-磷酰双叔丁氧羰基丝氨酸-6-O-三苯基甲醚化壳聚糖(BOC-PdS-Cs-Tr)溶液；
(4)旋蒸以除去所有有机溶剂，加适量去离子水沉淀，离心取沉淀物，加入15ml的三氟乙酸，搅拌反应4h，旋蒸除去三氟乙酸，加入适量的去离子水，过滤取滤液，透析冻干后得到最终产物磷酸二丝氨酸改性壳聚糖(PdSCs)，取代度为55％，产率为75％。
产物的分子式和核磁氢谱(1H NMR)如图1所示；31P NMR谱图如图2所示。
实施例2
磷酸二丝氨酸改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)1.061g的芴甲氧羰基-L-丝氨酸(Fmoc-L-Serine)溶解于30ml的无水DMA，加入0.285ml的亚磷酸二苯酯和5ml的无水吡啶，搅拌反应4h，得到Fmoc保护的磷酰双丝氨酸。旋蒸除去所有溶剂，加入10ml的无水异丙醇，作为反应A液；
(2)0.2g的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖(CsTr)溶解于10ml无水DMA，加入0.475ml的四氯化碳和2ml的无水三乙胺，作为反应B液；
(3)置B液于冰水中，往B液逐滴加入A液，此时CsTr的氨基与磷酰双丝氨酸的摩尔比为1:3，搅拌过夜12h，得到3-O-磷酰双芴甲氧羰基丝氨酸-6-O-三苯基甲醚化壳聚糖(Fmoc-PdS-Cs-Tr)溶液；旋蒸以除去所有有机溶剂，加适量去离子水沉淀，离心取沉淀物，加入15ml 20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺，搅拌反应4h，旋蒸除去有机溶剂，加入适量的去离子水，过滤取滤液，透析冻干后得到最终产物磷酸二丝氨酸改性壳聚糖(PdSCs)，取代度为25％，产率为70％。
实施例3
磷酸二丝氨酸改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)1.292g的N-苄氧羰基-L-丝氨酸(Cbz-L-Serine)溶解于30ml的无水N,N-二甲基乙酰胺(DMA)，加入0.475ml的亚磷酸二苯酯和1.5ml的无水吡啶，搅拌反应4h，得到Cbz保护的磷酰双丝氨酸；旋蒸除去所有溶剂，加入10ml的无水异丙醇，作为反应A液；
(2)0.2g的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖(CsTr)溶解于10ml无水DMA，加入0.475ml的四氯化碳和2ml的无水三乙胺，作为反应B液；
(3)置B液于冰水中，往B液逐滴加入A液，此时CsTr的氨基与磷酰双丝氨酸的摩尔比为1:5，搅拌过夜12h，得到3-O-磷酰双苄氧羰基丝氨酸-6-O-三苯基甲醚化壳聚糖(Cbz-PdS-Cs-Tr)溶液；旋蒸以除去所有有机溶剂，加适量去离子水沉淀，离心取沉淀物，在Pd/C的催化下氢解，加入适量的去离子水，过滤取滤液，透析冻干后得到最终产物，取代度为52％，产率为76％。
实施例4
磷酸二苏氨酸改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)1.184g的N-叔丁氧基羰基-L-苏氨酸(Boc-Thr-OH)溶解于30ml的无水N,N-二甲基乙酰胺(DMA)，加入0.475ml的亚磷酸二苯酯和1.5ml的无水吡啶，搅拌反应4h，得到BOC保护的磷酰双苏氨酸；旋蒸除去所有溶剂，加入10ml的无水异丙醇，作为反应A液；
(2)0.2g的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖(CsTr)溶解于10ml无水DMA，加入0.475ml的四氯化碳和2ml的无水三乙胺，作为反应B液；
(3)置B液于冰水中，往B液逐滴加入A液，此时CsTr的氨基与磷酰双苏氨酸的摩尔比为1:5，搅拌过夜12h，得到3-O-磷酰双叔丁氧羰基苏氨酸-6-O-三苯基甲醚化壳聚糖(BOC-PdThr-Cs-Tr)溶液；旋蒸以除去所有有机溶剂，加适量去离子水沉淀，离心取沉淀物，加入15ml的三氟乙酸，搅拌反应4h，旋蒸除去三氟乙酸，加入适量的去离子水，过滤取滤液，透析冻干后得到最终产物磷酸二苏氨酸改性壳聚糖，取代度为52％，产率为78％。
实施例5
磷酸二丝氨酸化壳聚糖的溶血率测试
配制10mg/mL实施例1制备的PdSCs的生理盐水溶液，作连续稀释，得到一系列浓度PdSCs的生理盐水溶液。取1mL离心后所得的下层血红细胞RBCs，用HEPES溶液(9mL，10mMHEPES，150mM NaCl，pH 7)稀释，离心5min后将上清液移除，重复上述操作洗涤2次后再加入20mLHEPES溶液，配成最终浓度为3.3％(V/V)的RBCs溶液。
在无菌96孔板中，用排型移液枪每孔移入180μL上述配制好的浓度为3.3％(V/V)的RBCs溶液，加入20μL系列浓度梯度PdSCs的生理盐水溶液，阴性对照组为HEPES溶液，阳性对照组为1％(v/v)Triton X-100溶液，在鼓风摇床(37℃、100rpm)中孵育1h。再将96孔板以1000rpm离心10min后每孔取出10μL上清液加入到新的90μL HEPES溶液中，用酶标仪(Multiskan MK3，美国Thermofisher)在405nm处读数。利用下式可计算溶血率：
其中A为实验组吸光度值，A0为阴性对照组吸光度值，A100为阳性对照组吸光度值。实验结果如图3。根据ASTM-F765标准，溶血率为0-2,2-5或5％对应为非溶血性，轻度溶血性或溶血性材料，结果显示PdSCs在不同浓度下溶血率均小于2％，为非溶血材料。
实施例6
含水磷酰二丝氨酸化壳聚糖的差示扫描量热测试
水分子按状态可分为非冻结水、冷冻结合水和自由水。聚合物周围是否存在冷冻结合水被被认为是评估生物相容性的一个指标。称取适量PdSCs于铝坩埚，加入定量的水使水含量为0.5-2.5(水含量＝W水/W干)，置于干燥器中平衡一周，用差示热扫描量热分析仪DSC(Q20,美国TA公司)分析，40℃平衡5min，以5℃/min降温至-80℃，恒温10min，再以5℃/min升温至40℃，平衡5min后重复上述过程。取二次升温曲线作分析。结果如图4所示，当水含量大于0.47，曲线出现了明显的冷结晶峰，随着水含量增加，峰强度越强，说明PdS基团周围束缚着一层冷冻结合水，且随水含量增加冷冻结合水越多，预示PdSCs具有良好的生物相容性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种含两性氨基酸基团的壳聚糖衍生物，其特征在于结构如式I所示：
式I中的R为氢或烷基。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于：所述的烷基为甲基。
3.权利要求1或2所述壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将氨基受保护的氨基酸溶于溶剂1中，加入亚磷酸二苯酯和缚酸剂，搅拌反应后生成双取代氨基保护的氨基酸膦酸酯，蒸除溶剂后加入溶剂2，得到溶液A；
步骤(1)所述的氨基受保护的氨基酸如式II所示：
式II中，R’为芴甲氧羰酰基、叔丁氧羰基或苄氧羰基；
(2)将6-O-三苯基甲醚化壳聚糖溶于N,N-二甲基乙酰胺，加入三乙胺和四氯化碳，得到溶液B；
(3)置溶液B于冰水中，逐滴加入溶液A，搅拌反应，得到氨基酸改性壳聚糖衍生物粗品，经脱保护基，纯化，冻干，得到含两性氨基酸基团的壳聚糖衍生物纯品。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的缚酸剂为吡啶。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的溶剂1为N,N-二甲基乙酰胺，所述的溶剂2为异丙醇。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，氨基受保护的氨基酸与亚磷酸二苯酯的摩尔比为2:1。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的溶液B中，每100mL二甲基乙酰胺中含有1～10g的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖，其中三乙胺、四氯化碳与6-O-三苯基甲醚化壳聚糖的氨基摩尔比为6:4:1。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，溶液A、B混合后，6-O-三苯基甲醚化壳聚糖的氨基与双取代氨基保护的氨基酸膦酸酯的摩尔比为1:(3-5)。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的反应时间为12～24小时。
10.权利要求1或2所述的壳聚糖衍生物在制备植入物、组织工程、药物传输和创伤修复药物中的应用。
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