KR20100050523A - 트랜스펙션을 위한 선형 폴리에틸렌이민(ｐｅｉ)의 제조 방법 및 이러한 방법으로 얻은 선형 ｐｅｉ - Google Patents

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Abstract

본 발명은 트랜스펙션 벡터로서 사용하기 위한 선형 폴리에틸렌이민(PEI)의 합성 및 제조 방법 및, 이러한 방법을 사용하여 얻은 생성물에 관한 것이다. 상기 방법에서는, 단량체 2-에틸-2-옥사졸린을 건조시키고,
용매로서 아세토니트릴을 사용하고, 중합 반응의 건조된 개시제를 첨가하여, 이들을 함께 혼합함으로써 상기 단량체를 중합시켜 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)(PEOX)을 얻고,
메탄올 및 디에틸 에테르를 사용한 연속 세정/침전 단계 및 해당 여과를 3회 이상 실시하면서, 상기 얻은 PEOX를 증발에 의해 정제하고,
[(i) 1H-NMR 테스트의 실시에 의해 상기 PEOX 중합체의 정확한 확인, <1.0％ 수준으로의 단량체 부재의 확인, 및 <5.0％ 수준으로의 용매 부재의 확인을 달성하고,
(ii) 겔 투과 크로마토그래피의 실시에 의해 >23,000 Da의 평균 분자량(Mw) 및 <1.5의 상기 PEOX의 다분산도(Mw/Mn)를 얻기 위함)
상기 PEOX를 가수분해시키는 것을 포함한다.

Description

트랜스펙션을 위한 선형 폴리에틸렌이민(ＰＥＩ)의 제조 방법 및 이러한 방법으로 얻은 선형 ＰＥＩ{METHOD FOR MANUFACTURING LINEAR POLYETHYLENIMINE (PEI) FOR TRANSFECTION PURPOSE AND LINEAR PEI OBTAINED WITH SUCH METHOD}
본 발명은 트랜스펙션 적용을 위한 선형 폴리에틸렌이민(PEI)의 제조 및 품질 조절에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 보다 구체적으로 핵산을 이용한 치료를 비롯한(이에 한정되지 않음) 생체내 적용을 위한, 상기의 제조 방법으로 얻은 생성물에 관한 것이다.
본 출원은 비-가출원에 관한 것이며, 미국 가출원 제60/952,993호를 우선권주장으로 한다.
폴리에틸렌이민(PEI)은 양이온 하전 밀도 전위가 높은 유기 거대분자이다. PEI의 원자 2개 걸러 하나는 양성자화가 가능한 아미노 질소이다. PEI는 DNA를 포획하며, 그리하여 다수의 링커 아미노 기의 근접한 위치로 인하여, PEI는 실질적으로 어떠한 pH에서도 실질적인 완충력을 보유한다.
PEI 단독은 시험관내 및 생체내 모두에서 DNA 플라스미드를 전달하기 위한 매우 효율적인 벡터이다.
PEI는 세포 표면에서 음이온 프로테오글리칸과 상호작용이 가능하며 그리고 세포내이입에 의하여 입자의 진입을 촉진할 수 있는 양으로 하전된 입자로 DNA를 압축시킨다. 양으로 하전된 입자는 세포 표면에서 음이온 세포-표면 프로테오글리칸에 부착되며, 그후 자발적으로 세포내이입된다. 문헌[Boussif et al., 1995]. PEI는 또한 "양성자 스폰지"로서 작용하는 특징적인 성질을 가지며, 세포로 유입되면 이입소체 pH를 완충시키며, DNA가 분해되는 것을 방지한다. 지속된 양성자 유입은 또한 이입소체 삼투압 팽창 및 파열을 유발하여 DNA 입자의 세포질로의 도피 기전을 제공한다. 문헌[Boussif, et. al., 1995; Behr, 1997].
요컨대, PEI를 이용한 전달계는 바이러스의 일부 핵심 성질, 예컨대 DNA 축합/보호 및 이입소체 도피를 모사한다.
PEI에 대한 제조 방법은 다수 존재한다.
사실상, 이는 상기 중합체가 수년간 다수의 산업 분야에서 사용되어 왔다는 사실에 기인한다.
그러나, 트랜스펙션에 사용하고자 할 경우, 상기 PEI의 효율은 종종 우수하지 않으며, 즉 제조된 생성물의 10％ 미만이 세포로의 전달에 성공한다.
특히, PEI의 높은 분자량, 즉 >10,000 Da에 대한 효율이 낮다.
게다가, 이러한 생성물이 의약 분야 및 보다 구체적으로는 GMP 기준과 같은 높은 제조 기준을 사용한 유전자 치료에 사용하고자 할 경우, 우수한 효율 및 품질이 요구된다.
본 발명은 이와 같은 문제점을 해소하고자 하며, 높은 효율(≥55％), 높은 분자량 및 낮은 다분산도를 가능케 한다.
이를 위하여, 본 발명은 종래 공지된 것보다 트랜스펙션의 효율 및 신뢰성이 더 우수하며 품질이 더 높도록 하는 선형 폴리에틸렌이민(PEI)의 개선된 합성 및 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 품질은 GMP(우수 의약품 제조 품질관리 기준)에 대한 기준이 된다.
보다 구체적으로는, 본 발명은 99％보다 높은 순도의 소정량의 단량체인 2-에틸-2-옥사졸린을 철저히 건조시키는 단계;
소정량의 건조된 단량체에서 용매로서 사용한 소정량의 아세토니트릴을 철저히 건조시킨 후에, 철저히 건조시킨 중합 반응 개시제를 소정량 첨가하여, 이들을 함께 혼합함으로써 상기 소정량의 단량체를 중합시켜 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)(PEOX)을 얻는 단계;
메탄올 및 디에틸 에테르를 사용한 연속 세정/침전 단계 및 해당 여과를 3회 이상 실시하면서, 상기에서 얻은 PEOX를 증발에 의해 정제하여 상기 용매를 제거하는 단계; 및
상기 PEOX를 염산으로 가수분해여, 1H-NMR 테스트의 실시에 의해 <5％의 양의 잔류 측쇄 또는 프로피온산을 갖고 단일 피이크로서 폴리에틸렌이민(PEI)을 확인하기에 충분히 효율적으로 PEI를 얻는 단계
를 포함하며, 상기 건조, 중합 및 정제의 작업은
(i) 1H-NMR 테스트의 실시에 의해 상기 PEOX 중합체의 정확한 확인, <1.0％ 수준으로의 단량체 부재의 확인, 및 <5.0％ 수준으로의 용매 부재의 확인을 달성하고,
(ii) 겔 투과 크로마토그래피의 실시에 의해 >23,000 Da의 평균 분자량(Mw) 및 <1.5의 상기 PEOX의 다분산도(Mw/Mn)를 얻도록 정렬되는 것인, 트랜스펙션 벡터로서 사용하기 위한 선형 PEI의 합성 및 제조 방법에 관한 것이다.
"소정량의 단량체, 아세토니트릴 또는 개시제를 철저히 건조시킨다"라는 것은 사용 직전에 10 ppm 미만의 물의 습도로 감소시키며, 수소화칼슘상에서 48 시간에 걸쳐 건조시킨 후 단량체를 129℃ 초과의 온도에서 증류 및 수집하여 얻을 수 있는 것으로 이해하여야 한다.
또한, 본 발명은 하기와 같은 하나 및/또는 다수의 특징을 비롯한(이에 한정되지 않음) 이로운 실시태양을 제안한다:
- PEOX의 분자량(Mw)의 평균은 예를 들면 40,000 Da<Mw<54,000 Da이며;
- 단량체/개시제 비는 약 500이며, "약(about)"이라는 것은 ±5％로 이해하여야 하며;
- 단량체/개시제 비는 480이며;
- 단량체는 순도가 99.95％보다 높으며;
- 개시제는 단량체에 첨가전 아세토니트릴과 혼합하며;
- 중합은 20 시간 초과의 시간 동안 85℃보다 높은 온도에서 실시하며;
- 중합 온도는 105℃ 또는 105℃보다 높으며;
- 1차 여과후, 잔류물은 용매, 예컨대 MeOH로 자유로이 세정하고, 디에틸 에테르의 첨가후, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)은 자연적으로 용액으로부터 오일로서 분리되며, 용매 전부를 기울여 따르고, 상기 세정 및 분리는 진공하에서의 건조 이전에 적어도 4회 반복하며;
- 가수분해 단계는 1H-NMR 분광학으로 반응의 과정을 모니터하면서 규칙적으로 그리고 적어도 1 일 동안 공비 증류에 의하여 얻은 방출된 프로피온산을 반응 혼합물로부터 제거하는 것을 포함하며;
- 반응 공정의 종반에 얻은 잔류물을 물에 희석하여 증발시키는 것을 3 회 이상 실시하여 미량의 프로피온산을 제거한 후 잔류물을 다시 물에 용해시키고, 여과한 후, 동결건조시키며;
- 여과는 0.20 ㎛ 내지 0.25 ㎛의 메쉬 크기를 갖는 무균막, 특히 무균 다공성(cellular) 아세테이트 막을 통하여 제공된다.
그러나, 상기와 같은 여과는 무균 상태는 아니므로 추가의 비용이 발생하지 않으나, 이는 여과의 무균 상태가 필수적이라는 당업자의 일반적인 견해와는 상반되는 것이다.
"무균 여과"라는 것은 모든 살아있는 박테리아 및 살아있는 성분을 적어도 현행 USP에 의하여 결정되는 값보다 낮은 값으로 제거하는 것으로 이해하여야 한다.
또한, 본 발명은 전술한 방법으로 얻은 선형 PEI에 관한 것이다.
본 발명은 중간 PEOX가 40,000<Mw< 54,000 Da와 같은 분자량 Mw을 갖는 것을 특징으로 하는 선형 PEI를 제안하는 것이 이롭다.
또다른 바람직한 실시태양에서, PEOX의 분자량 Mw은 대략 25,000 Da이다. "대략(around)"이라는 것은 ±1,800 Da인 것으로 이해하여야 한다.
본 발명은 첨부한 도면을 참조하여 하기의 비제한적인 실시예에 의하여 제시된 특정의 실시태양의 설명을 숙독하면 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 본 발명의 제1의 실시태양(GMP)에 의한 선형 PEI의 제조 방법의 개략도를 도시한다.
도 2는 본 발명의 제2의 실시태양에 의한 방법의 단계의 개략도를 도시한다.
도 3 내지 도 10은 본 발명의 실시태양에 의한 방법을 사용하여 얻은 결과의 여러가지 곡선을 도시한다.
본 발명에 의한 방법의 제1의 실시태양(GMP 품질을 갖는)에서, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)은 강한 친전자체로서 메틸 p-톨루엔 설포네이트에 의한 중합 개시후 2-에틸-2-옥사졸린(단량체)의 양이온성 개환 중합에 의하여 얻는다.
옥사졸린 고리가 형성된 후(하기 개환 중합의 진행 단계를 참조함) 그 다음 단량체가 공격한다.
그후, 리빙 중합체를 얻고, 중합은 물 및 탄산나트륨의 첨가에 의하여 종료된다.
Figure pct00001
중합도는 단량체/개시제 비 및 합성의 수율에 의하여 조절된다.
단량체/개시제 비로부터, 수평균 분자량(Mn)의 이론치를 계산할 수 있다. 크게 조절된 중합은 Mn의 이론치에 근접한 Mn 측정치를 갖고 그리고 다분산도 지수가 낮은 중합체를 제공한다.
중합의 통상적인 수율은 PEOX의 분자량이 1,000 내지 10,000 Da인 것이 예상되는 경우 55 내지 95％ 범위내가 된다. 문헌[Hoogenboom et al., 2003]. 더 높은 분자량에 대하여서는 수율이 감소된다. 분자량의 측정은 <10,000 Da의 낮은 Mn 경우 1H-NMR 분광학 또는 MALDI-TOF 질량 분광학을 사용하여 달성될 수 있다.
PEOX의 더 큰 분자량 >10,000 Da의 경우, 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 통상적으로 사용하며, 이는 유일한 효율적인 방법을 나타낸다.
본 발명의 절차는 크게 조절된 중합을 이용하여 10,000 Da 초과의 고분자량 선형 폴리에틸렌이민을 생성하는 방법의 설명에 관한 것이다. 약 500의 단량체/개시제 비로 출발한 중합은 수율이 90％보다 높아서 GPC 측정에 의하여 나타난 바와 같은 좁은 분자량 분포 및 낮은 다분산도 지수 측정치를 갖는 고분자량 선형 PEI의 제조를 가능케 한다.
크게 조절된 중합은 전적으로 출발 물질(단량체, 개시제) 및 용매(아세토니트릴)의 품질이 완벽하게 정의 및 조절되는 경우 얻게 된다.
제제는 미국의 알드리치 컴파니로부터 입수하며, 하기와 같은 규격을 갖는다:
- 2-에틸-2-옥사졸린, 참조 번호 13,745-6, 순도 요건 >99％, GC 분석에 의하여 측정된 순도 99.5 내지 99.7％. 수분량에 대한 요건은 없음;
- 메틸 p-톨루엔 설포네이트, 참조 번호 158992, 순도 요건 >98％, GC 분석에 의하여 측정된 순도 99.9％.
아세토니트릴은 이탈리아의 카를로 에르바로부터 입수하며, 참조 번호 0063716, HPLC 등급, 순도 요건 99.9％ 및 물 함유량 <0.03％이다.
중합 수율에 영향을 가장 많이 미치는 임계 변수중 하나는 개시 및 전개 단계중의 물의 존재인 것으로 밝혀졌다.
이러한 이유로, 사용하는 용기는 조심스럽게 건조시키고, 합성을 개시하기 전까지 아르곤하에 보관한다.
또한, 미량의 물의 존재가 중합 수율을 감소시킬 수 있다고 의심하고 있으므로, 출발 단량체 및 아세토니트릴 모두의 증류 요건을 비교하였다(하기 표 1 참조).
단량체 및 아세토니트릴을 수소화칼슘상에서 건조시킨 후에, 사용전까지 아르곤 대기하에서 증류에 의하여 정제하였다.
아세토니트릴은 사용전 증류로 정제하였다.
결과에 의하면, 2-에틸-2-옥사졸린 및 아세토니트릴 모두의 증류는 ≥90％의 PEOX 생산 수율을 얻을 것을 요구하고 있음이 명백하다.
게다가, 재현 가능성이 높은 수준인 것으로 밝혀졌다. 이러한 조건하에서 개시제에 대한 단량체의 비 500을 사용하면 PEOX 중합체는 동일한 범위 51,862±1,644의 분자량을 가지며, 평균 Mw/Mn이 1.15±0.03이다.
증류 처리하지 않은 제제 또는 용매를 사용하면 분자량이 일정하지 않게 된다.
Figure pct00002
Mw 및 Mw/Mn(다분산도 지수)은 겔 투과 크로마토그래피로 얻었다.
선형 PEI의 분석의 증명(GMP)은 예를 들면 하기 표 2에 제시한다.
생성물 선형 폴리에틸렌이민
구조식(알짜) (C2H5N)n×(HCl)m
테스트 방법 요건 결과
중간 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)의 확인 1H-NMR (CDCl3) 확인: 1.0-1.3 ppm(3H, CH2-CH 3), 2.0-2.5 ppm(2H, CH 2-CH3), 3.4-3.5 ppm(4H, CH2-CH 2-N)에서의 피이크
잔류 단량체 1.0％ 이하
잔류 용매 5％ 이하
중간 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)의 분자량 GPC 방법 Mw=40,000-53,000 Da
다분산도 Mw/Mn<1.5
외관 시각 테스트 무정형 백색 내지는 회백색 고체
트랜스펙션 분석 pCMVLuc 플라스미드를 갖는 부착성 HeLa 세포의 트랜스펙션 >107 RLU/웰
선형 PEI의 확인 IR 참고 기준에 따름
1H-NMR (D2O) 확인: 3.3-3.6 ppm(4H)에서의 피이크
발화 잔류물 현행 USP <281> 1.0％ 이하
중금속 현행 USP <231> (Pd) 0.002％ 이하
분석(qNMR) 1H-NMR 방법 (C2H5N)n×(HCl)m의 98.0-102.0％
불순물 프로파일 GC 방법/1H-NMR 방법 개별적인 미지의 불순물: 0.15％ 이하
개별적인 미지의 불순물: 0.50％ 이하
전체 불순물: 1.0％ 이하
ROS(잔류 유기 용매) GC 방법 아세토니트릴 410 ppm 이하
메탄올 3,000 ppm 이하
디에틸에테르 5,000 ppm 이하
미생물 한계치 현행 USP <61> 총 호기성 계수: 100 cfu/g 또는 ㎖ 이하; 효모 및 곰팡이: 50 cfu/g 또는 ㎖ 이하; 이. 콜리, 살모넬라, 스타필로코쿠스 아우레우스, 슈도모나스 아에루기노사 없음
세균 내독소 현행 USP <85> 0.6 EU/㎎ 이하
Cfu: 집락 형성 단위; RLU: 상대 발광 단위; EU: 내독소 단위; NMT:이하
트랜스펙션 분석
트랜스펙션 1 일전, 완전 MEM 배지(10％ 소 태아 혈청, 중탄산나트륨, 2 mM Glutamax™, 200 U/㎖ 페니실린 및 200 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 Earle 염을 갖는 이글 MEM 배지)중의 24-웰 조직 배양 평판의 웰당 5×104 개의 HeLa 세포(ATCC CCL-2)를 플레이팅하였다. 트랜스펙션 당일, 생체내-선형 PEI pCMV-Luc 착체를 생성하였다. 하나의 웰의 경우, 1 ㎍의 DNA(pCMVLuc 플라스미드, 1 ㎎/㎖, 루시페라제 유전자를 암호화함)를 마이크로튜브(1.5 ㎖)내의 50 ㎕의 150 mM NaCl에 첨가한 후, 교반(vortex)하면서 혼합하였다. 생체내-선형 PEI 샘플 또는 양성 대조군을 50 ㎕의 150 mM NaCl(조건에 대하여서는 표를 참조)에 첨가하고, 용액을 교반하면서 혼합하였다. 생체내-선형 PEI 샘플의 용액(7.5 mM에서 물로 미리 희석함) 또는 선형 PEI 양성 대조군(7.5 mM) 또는 50 ㎕의 150 mM NaCl 용액(조건 DNA 단독)을 DNA 용액에 동시에 첨가한 후, 10 초간 교반하면서 혼합하였다. 용액(100 ㎕)을 30 분간 실온에서 배양한 후, 웰에 첨가하였다. 가볍에 흔들면서 균질화시킨 후, 평판을 37℃에서 5％ CO2를 포함하는 습한 공기 대기하에서 24 시간 동안 배양하였다.
Figure pct00003
트랜스펙션후 1 일차에, 루시페라제 분석을 실시하였다. 세포 배양액을 제거하고, 각각의 웰을 1 ㎖의 PBS로 세정하였다. PBS를 제거한 후, 100 ㎕의 용해 완충액[루시페라제 세포 배양액 용해 완충액(5X), Promega]을 첨가하고, 평판을 30 분간 실온에서 배양하였다. 용해물을 1.5 ㎖ 마이크로튜브에 수집하고, 14,0OO rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 발광분석기(LB 960 CENTRO, 버톨드 테크놀로지즈)용 96-웰 평판의 웰당 2 ㎕의 상청액을 첨가하고, 50 ㎕의 루시페린 기질(Promega)의 자동 첨가후 1 초간 발광 적분값(RLU, 상대 발광 단위)을 측정하였다. 결과는 RLU/웰로 나타내었다. 그후, RLU/웰의 평균값(n=6)±SD를 계산하였다.
이제, 도 1과 관련하여 방법을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
(2)에서 적절히 사전처리(qualify)한 미정제 물질(1)(단량체 및 기타의 용매 및 시약)로부터, 중합의 단계(3)에 의하여 중간 생성물 PEOX(4)를 얻고, 이를 (5)에서 적절히 확인하고 단계(6)에서 이의 질량을 측정하였다.
그후, 산성 가수분해(7)에 의하여 (9)에서 적절히 확인한 선형 PEI(8)를 얻고, 트랜스펙션에 대하여 샘플을 테스트하였다[트랜스펙션 분석(10)].
외관(11), 발화 잔류물(12), 중금속 존재 여부(13), 잔류 유기 화합물의 존재(14), 불순물 프로파일(15), 내독소에 대한 분석(16) 및 마지막으로 생부하[미생물 한계치의 측정을 위한 분석=미생물의 양(cfu/g)](17)에 관한 테스트를, 동결건조 단계(18)를 실시하기 이전 및/또는 도중에 제공하였다.
그리하여, 동결건조된 형태의 최종 생성물(19)은 최종 충전 단계(20) 이전에 얻었다.
간단히, 최종 충전 단계는 생체내-선형 PEI 벌크 용액의 제조에 의하여 개시된다. 벌크 분말의 중량을 측정하고, 물로 용해시켜 150 mM 질소의 최종 농도를 얻었다. 용액을 약 1 시간 동안 200 rpm의 혼합 속도로 자기 교반기를 사용하여 혼합한 후, 24 시간 동안 2℃ 내지 8℃에서 방치하였다. 용액을 유형 A 조건하에 실내에서 여과하였다. 여과의 경우, 무균 전용 유리 용기에 1회 사용의 무균 실리콘 튜브 및 2x Sartobran P 필터(0.45 ㎛/0.22 ㎛) 인라인을 사용하였다. 1차 필터와의 일체성을 테스트한 후, PEI 용액을 필터를 통하여 무균 유리 용기로 서서히 여과하였다. 이 단계후, 샘플에 생부하 테스트를 실시하였다. 여과후, DIN 2R 바이알로의 충전 및 고무 스토퍼의 삽입을 층기류하에 실시하였다. 그후, 바이알에 13 ㎜ 알루미늄 봉합제로 마개를 씌웠다. 마개를 씌우는 과정을 완료한 후, 바이알을 -20℃에서 보관하였다. 샘플을 채취하여 주요한 결함에 대하여 검사하였다.
기타의 (무작위) 샘플에 내독소 및 무균 분석을 실시하였다. 바이알을 수송시까지 -20℃에서 보관하였다.
제2의 실시태양에서, 생체내-선형 PEI의 제조 및 조절은 4 가지의 주요한 단계로 실시하였다(도 2 참조).
1) 옥사졸린으로부터 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)(PEOX)으로 중합;
2) PEOX의 정제;
3) PEOX에서 폴리에틸렌이민(선형 PEI)으로 전환; 및
4) 선형 PEI의 정제.
보다 구체적으로, 제조 및 조절 단계는 이하에서 도 2의 참조 번호로 설명한다.
매우 순수한 단량체로부터
단계 1: 이 방법은 (21)에서 개시하였다. 중합의 단계 1(22)은 우선 하기를 제공하였다.
Figure pct00004
단계 2는 아세토니트릴중의 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)의 정제(23)에 관한 것이다.
상기 정제중에 하기의 단계를 실시하였다:
- 에테르를 사용하여 중합체 물질을 침전(24)시켜 단량체를 제거하고;
- 메탄올 및 에테르를 사용한 3회 세정 사이클에서의 세정(25);
- 용매를 제거하기 위한 증발(26);
- 제조과정중의 품질 조절을 통한 조절(27), 즉 중합체를 확인하기 위한 1H-NMR, 단량체의 부족을 확인하기 위한 1H-NMR, <1.0％의 용매 부재를 확인하기 위한 1H-NMR.
그리하여, 폴리(옥사졸린)(PEOX)의 정제된 침전물을 얻었다.
단계 3-4: PEOX에서 선형 PEI로의 전환(28) 및 중합체의 정제(29)
보다 구체적으로, 폴리(옥사졸린)(PEOX)의 정제된 침전물을 얻기 위하여, 하기 단계를 제공하였다:
- 30 내지 37％ HCl 및 물에 첨가;
- 물을 사용한 CH3-CH2-COOH의 공비 증류(31);
- CH3-CH2-COOH를 얻기 위한 염산의 첨가(32).
이 단계에서, 수용액중의 HCl을 사용한 정제된 선형 폴리에틸렌이민을 얻었다(33).
그후, 하기 단계를 제공하였다:
- 과량의 HCl의 제거와 함께 물을 증발시키고(34), 그리하여 멸균수에 가용화된 선형 PEI·HCl을 얻고(35);
- 선형 PEI·HCl 분말을 제공하기 위한 동결건조(36).
그후, PEI를 다시 습윤 처리하여 수성 생체내 선형 PEI(150 mM 질소)를 얻은 후(37), 여과하였다(38).
그후, 최종 벌크 생체내 선형 PEI 품질 테스트(39 및 40), 즉 트랜스펙션에 사용하고자 하는 PEI를 전달하기 이전에,
- 생체내 선형 PEI의 1H-NMR-확인 및 순도;
- 1H-NMR-잔류 측쇄 또는 프로피온산;
- 생체내 선형 PEI의 겔 투과-다분산도;
- HeLa 세포-생물학적 활성의 트랜스펙션;
- 내독소 수준을 제공하였다.
이제, 생체내-선형 PEI의 전술한 제조에 대하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
제1의 단계(22)에서, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)(PEOX)은 아세토니트릴중의 2 가지의 출발 물질인 2-에틸-2-옥사졸린 및 메틸-파라톨루엔 설포네이트로부터 양이온 중합에 의하여 얻었다.
제2의 단계(23)는 (중합체를 세정하기 위한 능력면에서) 메탄올의 등가물, 즉 이러한 예에서는 클로로포름 및 에테르를 사용하여 다수의 세정(25)으로 중합체 PEOX를 침전시키고, 단량체, 용매 및 미반응 시약을 제거한다.
제조과정중의 품질 테스트(27)는 상기 중간 화합물에 수행하였다.
이러한 테스트(제조과정중의 테스트, 하기 표 3 참조)는 PEOX 중합체를 확인하기 위한 핵자기 공명(NMR), 단량체의 부재를 확인하기 위한 NMR, 및 <1.0％ 수준까지의 용매의 부재를 확인하기 위한 NMR이다(절차 CQ-1001).
겔 투과 분석(CQ-1002)으로 PEOX의 다분산도를 확인하며, 평균 분자량을 측정하였다.
제3의 단계(28)는 물중의 37％ 염산을 사용한 산성 가수분해를 이용하여 프로피오네이트 측쇄의 분해에 의하여 PEOX를 선형 PEI로 전환시킨다(30).
선형 PEI 정제는 프로피온산을 물중의 공비증류(31)로 제거하여 달성한다. 물 및 과량의 염산의 증발(34)후, 선형 PEI를 멸균수(단계 37)에 150 mM 아민에서 다시 현탁시키고, 0.22 ㎛ 셀룰로스 막을 통하여 벌크 컨테이너로 여과하였다(38).
생체내-선형 PEI의 확인 및 순도는 테스트(39, 40), 주로 NMR 테스트로 확인하였다(표 3의 CQ-1003을 참조함).
또한, 이들 테스트에 의하여 측쇄의 완전 제거를 확인하며, 임의의 잔류 프로피온산을 검출하였다.
그후, 생체내-선형 PEI의 생물학적 활성은 트랜스펙션 분석(CQ-1004)을 사용하여 측정하였다.
마지막으로, 내독소 수준은 내독소 분석(CQ-1005)을 사용하여 측정하였다.
본 발명의 실시태양에 의하면, 회분식 제조과정을 생체내-선형 PEI의 제조를 통하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
무엇보다도, 장비, 성분, 조건 및 절차를 작업자의 이름(약자) 및 일자와 함께 기록하며, 제조과정 및 최종 벌크 생성물 테스트는 기재된 절차에 의하여 그리고 자격이 있는 기술 엔지니어에 의하여 실시하였다(다시, 하기 표 3을 참조함). 모든 테스트에는 요건을 기재하며, 그 결과를 기록한다.
제조과정 및 최종 벌크 분석
과정 목적 방법 및 샘플 합격 요건
번호 표제
CQ-1001 폴리옥사졸린에 대한 분석 제조과정: PEOX 중합체의 확인 1H-NMR 분석 <5％ 용매; <1％ 옥사졸린 단량체; 중합체의 존재 여부
CQ-1002 겔 투과 크로마토그래피에 의한 질량 측정 제조과정: PEOX의 평균 분자량 및 다분산도의 측정 수용액중의 PEOX·HCl의 광산란 및 굴절률 측정(단계 3) 다분산도(Mw/Mn) <1.5 평균 몰 질량(g/mol) Mn>30,000
CQ-1003 폴리에틸렌이민(선형 PEI)에 대한 분석 최종 벌크: 선형 PEI 중합체의 확인 및 순도의 조절 PEI에 대한 1H-NMR 분석(단계 3) 및 소량의 잔류 측쇄 또는 프로피온산의 확인 <5％ 프로피온산; 단일 피이크로서 선형 PEI의 확인
CQ-1004 선형 PEI를 사용한 HeLa 세포의 트랜스펙션 최종 벌크: 선형 PEI를 사용한 트랜스펙션 효율의 입증 PCMVLuc 플라스미드 및 선형 PEI·HCl을 사용한 부착성 HeLa 세포의 트랜스펙션(단계 4) >107 RLU**/웰
CQ-1005 내독소 분석 최종 벌크: 내독소 수준 측정 리물러스 변형세포 용해물 테스트(단계 4) <0.1 IU/㎖ Std
** RLU= 상대 발광 단위
이어서, 테스트의 요건 및 결과와 함께 분석 증명서를 본 발명의 제1의 실시태양에서 이미 제시한 바와 같이 생성물의 각각의 배취에 대하여 생성하였으며, 생체내-선형 PEI의 각각의 배취를 고객에게 선적 허가하기 이전에, 품질 확인 관리자는 배취 생산 기록 및 분석 증명서를 검토 및 승인할 책임이 있음을 명심한다.
반응식
Figure pct00005
제공된 여러가지 예에서, 상기의 작업을 실시하기 위하여 하기의 출발 물질 및 시약을 사용하였다:
2-에틸-2-옥사졸린, ≥99％.
이러한 단량체는 매우 순수하여야 하며, 즉 순도가 ≥99％이어야 한다. 여기서, 다시 한번, 이는 미국 알드리치 컴파니로부터 입수할 수 있으며, 예를 들면 99.98％의 순도로 증류에 의하여 개선된다(도 3 및 도 4 참조).
메틸 p-톨루엔 설포네이트는 순도가 높으며, 즉 98％이다.
개시제는 예를 들면 메틸 p-톨루엔 설포네이트가 바람직하며, 이는 순도가 높으며, 즉 ≥95％, 예를 들면 98％이다.
산은 염산이 이로우며, 예를 들면 이탈리아의 플루카가 시판하는 산으로, 산도가 37％이다.
기타:
아세토니트릴은 HPLC 등급이며, 용매인 메탄올 및 에테르는 유럽약전 등급이다. 가공조제인 수소화칼슘 및 탄산나트륨은 플루카로부터 구입하였다.
보다 구체적으로, 본 실시예에서 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)(PEOX) 합성의 제1의 단계는 하기와 같다:
반응:
Figure pct00006
합성:
폴리(2-에틸-2-옥사졸린)은 중합을 위한 개시제로서 메틸 p-톨루엔 설포네이트를 사용하여 2-에틸-2-옥사졸린으로부터 합성하였다. 반응은 아르곤하에서 화염 건조시킨 반응 플라스크내에서 실시하였다. 아세토니트릴을 용매로서 사용하며, 반응 온도는 85℃이다.
85℃에서 24 시간후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물로 종결시키고, 탄산나트륨을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 추가의 24 시간 동안 85℃에서 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 여과(Duran D2 유리 프릿)하여 고형물을 제거하고, 메탄올로 필터 케이크를 세정하고, 용매를 증발시켰다.
잔류물을 메탄올에 용해시키고, 다시 여과하였다(유리 섬유, Whatman B). 용매는 오일 펌프를 사용하여 증발시켰다. 다시, 잔류물을 메탄올에 용해시키고, 디에틸 에테르를 첨가하여 침전시켰다. 그후, 용매를 제거하였다(오일 펌프 진공). 2차 침전을 실시한 후, PEOX를 일정한 중량으로 건조시켰다.
1H-NMR-스펙트럼은 5％ 미만의 용매 및 1％ 미만의 옥사졸린 단량체를 나타내어야만 한다.
이제, PEOX 및 PEI의 실시를 위한 예를 설명하고자 하며, 본 발명의 모든 단계를 포함하지 않는 (즉, 아세토니트릴중에서의 증류를 포함하지 않음) 예(배취 번호 1 및 3)는 만족스럽지 못한 결과를 산출하며, 본 발명의 모든 단계를 포함하는 예(배취 2 및 4)는 만족스러운 결과를 산출하였다.
Figure pct00007
성과 및 분석 결과:
배취 번호 1:
합성 및 워크업 처리는 전술한 프로토콜을 따랐다.
수율: 40.95 g(81.9％)(즉, 너무 낮음)
1H-NMR-스펙트럼: 디에틸 에테르의 신호뿐 아니라, 공지의 불순물(양성자화된 형태, 1.78 ppm)도 검출되었다. 이들 신호 이외에, 3.72 ppm에서 신호를 갖는 소량의 미지의 불순물이 검출되었다(도 5).
Figure pct00008
500 개의 단량체로 이루어진 생체내-선형 PEI에 대한 분자량 예상값은 49,581 g/mol이다. 평균 Mw는 하기의 장치를 사용하여 GPC에 의하여 측정하였다: 펌프 Shimadzu LC-10AD(0.5 ㎖/분), 자동 주입기 WISP(워터즈), 1 가드 컬럼(Shodex OH-pak K3-G, 6.0×50 ㎜)에 이어서 직렬로 연결한 3 개의 컬럼 Shodex OH-pak, 8.0×300 ㎜(1 개의 컬럼 803HQ, 1 개의 컬럼 804HQ, 1 개의 컬럼 806HQ), 굴절률 검출기, 차동 검출기 Waters R410 및 멀티-앵글 광 산란 검출기 DAWN F, (와이어트 테크놀로지). 샘플을 실시하기 위하여 사용한 용매는 0.1 M NaNO3 및 NaN3를 포함하는 동시증류시킨 물이다. 건조시킨 PEOX를 4 내지 6 g/ℓ로 GPC 용매로 4 시간 동안 교반하에 실온에서 용해시켰다. 주입전, 샘플을 0.22 ㎛ Dynagard 필터로 여과하였다. 4-6 g/ℓ의 100 ㎕의 PEOX를 가드 컬럼에 자동 주입하고, GPC를 0.5 ㎖/분의 유속으로 실시하였다. GPC의 모니터링은 90° 광 산란 신호 및 RI 신호(dn/dc) 모두를 실시하여 수행하였다. 산란 신호 및 RI 데이타를 합하여 중합체의 절대 몰 중량을 소프트웨어로 계산하였다(Software ASTRA를 사용함).
배취 번호 2:
합성 및 워크업 처리는 전술한 프로토콜을 따랐다.
수율: 43.71 g(87.2 ％)(즉, 합격임).
1H-NMR-스펙트럼: 스펙트럼은 PEOX 이외에, 용매인 디에틸 에테르 및 아세토니트릴을 나타낸다. 추가로, 미지의 불순물(3.72 ppm에서)이 발견되었다(도 6).
Figure pct00009
500 개의 단량체로 이루어진 생체내-선형 PEI에 대한 분자량 예상값은 49,581 g/mol이다.
제2의 단계는 폴리에틸렌이민(생체내-선형 PEI)의 합성을 실시하는 것으로 이루어진다:
반응:
Figure pct00010
합성:
생체내-선형 PEI의 합성의 경우, 상기 중간 PEOX의 측쇄는 염산을 사용하여 물중에서 아미드 결합을 가수분해하여 제거하였다. 혼합물을 120℃에서 교반하였다.
1 일 후, 반응이 완료되었다. 반응의 진행은 1H-NMR 분광학으로 모니터하였다.
측쇄의 5％ 이하는 분해되지 않아야 한다.
염산은 증발로 제거하였다. 잔류물을 물/염산에 용해시키고, 2회 증발시켜 미량의 프로피온산을 제거하였다.
후, 잔류물을 물에 용해시키고, 유리 섬유 필터(Whatman B)로 여과한 후, 무균 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 막으로 여과하였다. 무색 용액을 동결건조시켰다.
NMR 분석은 중합체, 소량의 잔존하는 측쇄 및 5％ 미만의 잔류 프로피온산의 정체를 확인하여야 한다.
Figure pct00011
배취 번호 3은 배취 번호 1의 가수분해후 얻었다.
배취 번호 4는 배취 번호 2의 가수분해후 얻었다.
성과 및 분석 결과:
배취 번호 3:
합성 및 워크업 처리는 전술한 프로토콜을 따랐다.
수율: 27.61 g(87.7％)
1H-NMR-스펙트럼: 생체내-선형 PEI에 대한 단일 피이크를 나타낸다(도 9).
배취 번호 4:
합성 및 워크업 처리는 전술한 프로토콜을 따랐다.
수율: 29.43 g(87.4％)
1H-NMR-스펙트럼: 생체내-선형 PEI에 대한 단일 피이크를 나타낸다(도 10).
결론
선형 PEI의 2 개의 배취를 합성하였다. 제2의 배취의 생성물 수율뿐 아니라 1H-NMR-분광학에 의한 순도는 재현 가능하며, 제1의 배취에 비하여 만족스러우며, 제1의 배취는 본 발명의 단계중 일부를 사용하지 않아서 만족스럽지 않다.
PEOX의 평균 분자량은 GPC로 측정하였다. 이러한 요건은 매우 민감한 것으로 밝혀졌다. 배취 번호 1에서, 쇄 길이는 소정값을 달성하지 않았다(표 5, 도 7).
이제, 표 8 내지 표 14 및 도 3 내지 도 10에 의하여 하기 결과를 제공한다.
1.) 구입한 단량체 2-에틸-2-옥사졸린(EH-1268.4-2)의 GC(표 8 및 도 3 참조).
2.) 증류한 단량체 2-에틸-2-옥사졸린(EH-1268.4-2)의 GC(표 9 및 도 4 참조).
3.) 배취 번호 1의 1H-NMR-스펙트럼(도 5 참조).
4.) 배취 번호 2의 1H-NMR-스펙트럼(도 6 참조).
5.) 배취 번호 1의 GPC(도 7 및 표 11 참조)
6.) 배취 번호 2의 GPC(도 8 및 표 12 참조)
7.) 배취 번호 3의 1H-NMR-스펙트럼(도 9 참조).
8.) 배취 번호 4의 1H-NMR-스펙트럼(도 10 참조).
1.) 구입한 단량체 2-에틸-2-옥사졸린(EH-1268.4-2)의 GC
Figure pct00012
보다 구체적으로, 도 3은 Oy에 높이(PA) 그리고 Ox에 시간(분)으로, 40℃의 온도에서 GC 기체 크로마토그래피에 대하여 관찰된, 정제 이전에 제2의 실시태양에서 설명한 본 발명의 방법에 의하여 사용한 단량체의 여러가지 피이크, 즉 피이크 1(41), 피이크 2(42), 2-에틸-2-옥사졸린의 피이크(43), 피이크 3(44) 및 피이크 4(45)가 명백하게 도시되어 있다.
2.) 증류한 단량체 2-에틸-2-옥사졸린(EH-1268.4-2)의 GC
도 4 및 표 9에는 증류한 단량체(단계 22 직전)의 GC를 나타낸다. 이와 같은 특정의 증류 단계는 시판중인 미정제 물질의 순도와 비교시 단량체의 순도가 증가되었다는 것을 나타낸다(표 8 및 도 3).
단 3 개의 피이크, 즉 피이크 1(46), 피이크 2(47) 및 2-에틸-2-옥사졸린의 피이크(48)가 잔존한다.
Figure pct00013
3, 4) 배취 1 및 2의 1H-NMR-스펙트럼
Figure pct00014
도 5 및 6은 각각 PEOX 배취 번호 1의 1H-NMR-스펙트럼 및 PEOX 배취 번호 2의 1H-NMR-스펙트럼을 나타낸다.
보다 구체적으로, 피이크 50 내지 53 및 피이크 55 내지 58은 PEOX[1.0-1.3 ppm (3H, CH2-CH 3), 2.0-2.5 ppm (2H, CH 2-CH3), 3.4-3.5 ppm (4H, CH2-CH 2-N)]을 확인한다는 것을 의미한다. 피이크 49 및 54는 용매(CDCl3)를 나타낸다.
5.) 배취 번호 1의 GPC(겔 투과 크로마토그래피)
표 11 및 도 7
구성
광 산란 기기: miniDAWN 셀 타입: K5 레이저 파장: 690.0 ㎚ 보정 상수: 5.8800e-6 1/(Vcm) RI 기기: Optilab DSP UV 기기: n/a 용매: 물 굴절률: 1.330 유속: 0.500 ㎖/분
처리
질량 결과 맞춤: 없음(맞춤 정도: n/a) 반경 결과 맞춤: 없음(맞춤 정도: n/a) 피이크 1 피이크 한계치(㎖): 21.513.31.180 dn/de(㎖/g): 0.162 A2(mol ㎖/g2): 0.000 UV ext.(㎖/g cm): 0.000 모델: 21 ㎜ 맞춤 정도: 1 주입된 질량(g): 4.6732e-4 질량 계산치(g): 4.3112e-4
결과
피이크 1 다분산도 Mw/Mn: 1.260(16％) Mz/Mn: 2.270(56％) 몰 질량 모멘트(g/mol) Mn: 2.641e+4 (16％) Mp: 3.516e+4 (0.9％) Mw: 3.580e+4 (9％)
곡선(60)(멀티 앵글 광 산란 검출기로부터의 본래 데이타, MALS) 및 곡선(61)(굴절률 검출기로부터의 본래 데이타, RI)은 명백하게 상이하며, 이는 중요한 다분산을 나타내며(곡선의 단위는 Ox에 부피(㎖), Oy에 상대 척도를 갖는 신호의 강도로 나타냄), 결과는 만족스럽지 않다.
6. ) 배취 번호 2의 GPC
표 12 및 도 8
구성
광 산란 기기: miniDAWN 셀 타입: K5 레이저 파장: 690.0 ㎚ 보정 상수 : 5.8800e-6 1/(Vcm) RI 기기: Optilab DSP UV 기기: n/a 용매: 물 굴절률: 1.390 유속: 0.900 ㎖/분
처리
질량 결과 맞춤: 없음(맞춤 정도: n/a) 반경 결과 맞춤: 없음(맞춤 정도: n/a) 피이크 1 피이크 한계치(㎖): 21.891.28.904 dn/de(㎖/g): 0.162 A2(mol ㎖/g2): 0.000 UV ext.(㎖/g ㎝): 0.000 모델: 21 ㎜ 맞춤 정도: 1 주입된 질량(g): 6.7440e-4 질량 계산치(g): 6.1415e-4
결과
피이크 1 다분산도 Mw/Mn: 1.160(16％) Mz/Mn: 1.331(22％) 몰 질량 모멘트(g/mol) Mn: 8.721e+4(16％) Mp: 4.621e+4(0.9％) Mw: 4.317e+4(9％) Mz: 4.951e+4(18％)
여기서, 곡선(62)(MALS 검출기로부터의 본래 데이타) 및 곡선(63)(RI 검출기로부터의 본래 데이타)은 거의 일치하며, 이는 본 발명에서 허용 가능하다.
7, 8) 마지막으로, 도 9 및 도 10에는 배취 번호 1 및 2 각각의 PEOX를 사용하여 얻은 PEI 번호 3 및 번호 4의 배취의 1H-NMR-스펙트럼을 재현하였으며, 이는 각각 피이크(64)(4.72 ppm, D2O) 및 피이크(65)(3.46 ppm, PEI로부터의 CH2-CH2-NH) 및 피이크(66)(4.71 ppm, D2O), 피이크(67)(3.47 ppm, PEI로부터의 CH2-CH2-NH)를 나타낸다.
마지막으로, 하기 표 13을 제공한다.
Figure pct00015
상기 표는 PEOX의 질량 Mw이 초기 개시제/단량체 비에 의존한다는 것을 나타낸다.
주: 본 실시예에서, 최종 PEI는 질량이 >10,000 Da이고, 보다 구체적으로는 약 15,000 Da(즉, 34,180/99×43=14,846 Da)이다.
PEOX 제조의 높은 성능(>85％)으로 인하여 본 발명의 방법에 의하여 낮은 다분산도 <1.5를 갖는, 이론치에 근접한 질량을 갖는 중합체를 생성하게 된다.
추가의 잇점 및 변형은 당업자에게 용이할 것이다. 그러므로, 보다 광의의 구체예에서 본 발명은 본 명세서에서 제시 및 설명한 구체적인 세부 사항, 대표적인 장치 및 예시한 예로 한정되지 않는다.
특히, 본 발명은 전술한 방법을 사용하여 얻은 선형 PEI도 포함한다.
참고 문헌
Figure pct00016
이제, 이하에서는 본 발명에 의한 제3의 실시태양을 설명하고자 한다.
생체내-선형 PEI의 제조 방법은 2 단계 합성으로 진행한다.
단량체 (2-에틸-2-옥사졸린)으로부터 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)(PEOX)으로의 중합을 위한 제1의 단계 및, 상기 PEOX로부터 선형 PEI를 얻기 위한 제2의 단계.

Claims (15)

  1. 99％보다 높은 순도의 소정량의 단량체인 2-에틸-2-옥사졸린을 철저히 건조시키는 단계;
    소정량의 건조된 단량체 중의 용매로서 사용한 소정량의 아세토니트릴을 철저히 건조시킨 후에, 철저히 건조시킨 중합 반응 개시제를 소정량 첨가하여 이들을 함께 혼합함으로써 상기 소정량의 단량체를 중합시켜 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)(PEOX)을 얻는 단계;
    메탄올 및 디에틸 에테르를 사용한 연속 세정/침전 단계 및 해당 여과를 3회 이상 실시하면서, 상기에서 얻은 PEOX를 증발에 의해 정제하여 상기 용매를 제거하는 단계; 및
    상기 PEOX를 염산으로 가수분해하여, 1H-NMR 테스트의 실시에 의해 <5％의 양의 잔류 측쇄 또는 프로피온산을 갖고 단일 피이크로서 폴리에틸렌이민(PEI)을 확인하기에 충분히 효율적으로 PEI를 얻는 단계
    를 포함하며, 상기 건조, 중합 및 정제의 작업은
    (i) 1H-NMR 테스트의 실시에 의해 상기 PEOX 중합체의 정확한 확인, <1.0％ 수준으로의 단량체 부재의 확인, 및 <5.0％ 수준으로의 용매 부재의 확인을 달성하고,
    (ii) 겔 투과 크로마토그래피의 실시에 의해 >23,000 Da의 평균 분자량(Mw) 및 <1.5의 상기 PEOX의 다분산도(Mw/Mn)를 얻도록 정렬되는 것인, 트랜스펙션 벡터로서 사용하기 위한 선형 PEI의 합성 및 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 중간 PEOX의 평균 분자량(Mw)이 40,000 Da<Mw<54,000 Da인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단량체/개시제 비가 약 500인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 단량체/개시제 비가 480인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 단량체의 순도가 99.95％보다 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 개시제를 단량체에 첨가하기 전에 아세토니트릴과 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 중합을 20 시간 초과의 시간 동안 85℃보다 높은 온도에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 중합 온도가 105℃보다 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 여과후, 잔류물을 MeOH로 자유로이 세정하고, 디에틸 에테르를 첨가한 후, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)을 자연스럽게 용액으로부터 오일로서 분리하고, 용매 전부를 기울여 따르고, 상기 세정 및 분리가 진공하에서의 건조 이전에 4회 이상 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 가수분해 단계가 1H-NMR 분광학에 의하여 반응의 진행을 모니터하면서 규칙적으로 1 일 이상 동안 공비 증류에 의하여 얻은 배출된 프로피온산을 반응 혼합물로부터 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 반응 공정의 종반에 얻은 잔류물을 물에 희석하여 증발시키는 것을 3회 이상 실시하여 미량의 프로피온산을 제거한 후, 잔류물을 다시 물에 용해시키고, 여과한 후 동결건조시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 여과가 0.20 ㎛ 내지 0.25 ㎛의 메쉬 크기를 갖는 무균 셀룰로스 아세테이트 막을 통하여 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 1.0％ 미만의 단량체, 5.0％ 미만의 용매의 존재, 분자량 Mw>23,000 Da, 1.5 미만의 다분산도(Mw/Mn)를 갖는 중간 생성물(PEOX)의 정제에 의해 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득한 선형 PEI.
  14. 제13항에 있어서, 중간 생성물 PEOX가 40,000<Mw<53,000 Da와 같은 PEOX의 분자량 Mw을 갖는 것을 특징으로 하는 선형 PEI.
  15. 제13항에 있어서, 중간 생성물 PEOX의 분자량 Mw이 대략 25,000 Da인 것을 특징으로 하는 선형 PEI.
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