CN113896812B - 一种壳聚糖衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及高分子材料领域，尤其涉及一种壳聚糖衍生物及其制备方法和应用，所述壳聚糖衍生物是壳聚糖经过有效基团进行化学修饰得到的；所述方法包括：将壳聚糖粉末溶于甲磺酸中，得到壳聚糖甲磺酸溶液；将笏甲氧羰酰基‑6‑氨基己酸和二氯亚砜进行第一混合并加热，后进行第一除杂，得到笏甲氧羰酰基‑6‑氨基己酸‑酰氯；将壳聚糖甲磺酸溶液和笏甲氧羰酰基‑6‑氨基己酸‑酰氯进行第二混合，后冷却，得到冷冻混合物；将冷冻混合物进行脱氨基保护，得到脱保护产物；将所述脱保护产物进行第二除杂，后冷冻干燥，得到壳聚糖衍生物；所述应用包括将壳聚糖衍生物用于止血和抗菌的药物中。

Description

一种壳聚糖衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及高分子材料领域，尤其涉及一种壳聚糖衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
外伤出血是各类事故现场的最常见伤情之一，其中出血失控是导致伤员现场死亡的首要原因，同时也是外科手术中经常要面对的难题。目前现有的止血敷料主要有三类：无机材料（如沸石、二氧化硅、蒙脱石和高岭土等）、天然高分子材料（如氧化纤维素、胶原蛋白、壳聚糖、丝素蛋白、海藻酸钙、纤维蛋白和淀粉等）与合成高分子材料（如多肽、聚（ɛ-己内酯）、聚乙二醇和聚氰基丙烯酸酯等）。这些止血材料虽具有一定的止血效果，但都存在明显的缺陷，如：
（1）无机材料：生物相容性差，易引发炎症；与血液接触后存在明显放热现象，导致组织灼伤；在体内难以彻底清除，造成脏器纤维化或形成血栓。
（2）天然高分子材料：止血效果一般；稳定性差。
（3）合成高分子材料：价格昂贵；质控体系不完善，不同批次产品的质量差异较大；在体内难以降解。
而对于止血材料的研发一直是国际研究热点，我国在此领域的起步较晚，在止血材料快速发展的当下，已表现出明显的不足，基于上述现实，开发一款止血效果显著且我国拥有自主知识产权的止血敷料成为了当务之急。天然高分子止血材料在自然界中储量大，价格低廉，且经过简单的化学修饰后即可明显提高其促凝血能力。
壳聚糖作为一种传统的止血敷料，是迄今为止发现的唯一一种天然碱性多糖，现阶段主要由甲壳素脱乙酰化后得到，也称为脱乙酰甲壳素。壳聚糖在自然界中的存量庞大，是仅次于纤维素的第二大无毒害、无污染、可再生的绿色物质资源。
壳聚糖具有良好的生物相容性和一定的止血和抗菌活性，但壳聚糖的临床应用仍然存在一些尚未解决的问题：由于壳聚糖本身不溶于水，只能溶于少数酸性溶液，临床上一般将其制备成壳聚糖盐酸盐使其溶于水。但由于壳聚糖盐酸盐分子中存在着大量的羟基和氨基，易形成分子内和分子间的氢键，导致壳聚糖盐酸盐溶于水后迅速晶体化，致使溶液的粘度迅速增大且壳聚糖盐酸盐的溶解速率慢、溶解度受限，这就导致壳聚糖的止血效果受限。因此，如何使壳聚糖在水中具有更高的溶解度及更快的溶解速率，从而提高壳聚糖的止血效果，是目前亟需解决的技术问题。
发明内容
本申请提供了一种壳聚糖衍生物及其制备方法和应用，以解决现有技术中难以提高壳聚糖的水溶性及溶解速率的技术问题。
第一方面，本申请提供了一种壳聚糖衍生物，所述壳聚糖衍生物是壳聚糖经过有效基团进行化学修饰得到的，其中，所述有效基团包括6-氨基己酸，所述化学修饰具体包括：将所述壳聚糖的羟基和/或氨基分别与所述有效基团的羧基发生酯化和/或酰基化反应。
可选的，所述衍生物的结构通式如式1所示，
Figure SMS_1
式1
其中，n≥2。
可选的，所述壳聚糖衍生物为壳聚糖的羟基和氨基分别与笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯发生酯化和酰基化反应后得到的产物。
可选的，所述壳聚糖的氨基葡萄糖单元和笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯的摩尔比为1：1~1：5。
第二方面，本申请提供了一种壳聚糖衍生物的制备方法，所述方法包括：
将壳聚糖粉末溶于甲磺酸中，得到壳聚糖甲磺酸溶液；
将笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸和二氯亚砜进行第一混合并加热，后进行第一除杂，得到笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯；
将所述壳聚糖甲磺酸溶液和所述笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯进行第二混合，后冷却，得到冷冻混合物；
将所述冷冻混合物进行脱氨基保护，得到脱保护产物；
将所述脱保护产物进行第二除杂，后冷冻干燥，得到壳聚糖衍生物。
可选的，所述将所述冷冻混合物进行脱氨基保护，得到脱保护产物，包括：
将所述冷冻混合物进行解冻，后加入丙酮进行沉淀并清洗，得到沉淀混合物；
将所述沉淀混合物以N，N-二甲基甲酰胺溶解，后加入哌啶进行脱保护，反应时间为3~12h，得到脱保护产物；
所述哌啶的终点体积分数为5%~30%。
可选的，所述将壳聚糖粉末溶解于甲磺酸，得到壳聚糖甲磺酸溶液，包括：
将壳聚糖粉末在冰浴条件下加入到甲磺酸中，得到壳聚糖甲磺酸溶液；
所述壳聚糖粉末和所述甲磺酸的质量体积比为1g:10mL~1g:30mL。
可选的，所述第一除杂包括：旋转蒸发除去二氯亚砜；
所述第一除杂的温度为30~80℃，时间为60~180min；
所述第二除杂依次包括：第一pH调节、加水并离心、第二pH调节和透析；
所述加水的水量和所述脱保护液的体积之比为1：3~8；
所述透析包括：采用纯水透析72~150h，并每隔12h更换一次透析液；
所述第一pH调节的终点为7.0~9.0，所述第二调节的终点为2.0~7.0。
可选的，所述第二混合包括：在冰浴条件下混合，并搅拌0.5~2h，在-25~5℃下过夜；
所述第一混合的笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸和二氯亚砜的质量体积比为1g：2mL~1g：10mL；
所述加热的终点温度为50~80℃，时间为120~300min。
第三方面，本申请提供了一种壳聚糖衍生物的应用，所述应用包括将第一方面所述的衍生物用于止血和抗菌的药物中。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的一种壳聚糖衍生物，通过壳聚糖通过以6-氨基己酸作为有效基团进行化学修饰，由于6-氨基己酸经过羧基活化后，再利用壳聚糖的羟基和氨基分别与活化后的6-氨基己酸的有效基团分别发生酯化和酰基化反应，从而对壳聚糖进行改性，由于壳聚糖的一部分羟基和氨基被取代，因此可一定程度上抑制分子内和分子间氢键的形成，从而能够提高改性后的壳聚糖衍生物在水中的溶解速率及溶解度，方便其应用在止血和抗菌的药物中。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的一种壳聚的糖衍生物的制备方法的流程示意图；
图2为本申请实施例提供的一种壳聚的糖衍生物的制备方法的详细流程示意图；
图3为本申请实施例提供的一种壳聚的糖衍生物的合成线路示意图；
图4为本申请实施例提供的一种壳聚糖和壳聚糖衍生物的红外图谱对比图；
图5为本申请实施例提供的一种壳聚糖和壳聚糖衍生物的核磁共振氢谱对比图；
图6为本申请实施例提供的一种壳聚糖和壳聚糖衍生物的促凝血效果对比图；
图中，CSH表示壳聚糖盐酸盐，CSH-AA表示改性后的壳聚糖衍生物。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在本申请一个实施例中，提供一所述壳聚糖衍生物是壳聚糖经过有效基团进行化学修饰得到的，其中，所述有效基团包括6-氨基己酸，所述化学修饰具体包括：将所述壳聚糖的羟基和/或氨基分别与所述有效基团的羧基发生酯化和/或酰基化反应。
作为一个可选的实施方式，所述衍生物的结构通式如式1所示，
Figure SMS_2
式1
其中，n≥2。
作为一个可选的实施方式，如图2所示，所述壳聚糖衍生物为壳聚糖的羟基和氨基分别与笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯发生酯化和酰基化反应后的改性物。
本申请中，通过限定壳聚糖衍生物为羟基酯化和氨基酰基化改性物的积极效果是使改性物具有更高的溶解度及更快的溶解速率，实现壳聚糖的改性。
作为一个可选的实施方式，所述壳聚糖的氨基葡萄糖单元和笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯的摩尔比为1：1~1：5。
本申请中，壳聚糖的氨基葡萄糖单元和笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸的摩尔比为1：1~1：5的积极作用是在该摩尔比范围内，反应后能获得不同取代度的壳聚糖衍生物；当该摩尔比的取值范围过大，将导致的不利影响是将浪费大量的笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯，当该摩尔比的取值范围过小，将导致的不利影响是生成的壳聚糖衍生物的取代度过低。
在本申请的一个实施例中，图1所示，提供一种壳聚糖衍生物的制备方法，所述方法包括：
S1.将壳聚糖粉末溶于甲磺酸中，得到壳聚糖甲磺酸溶液；
S2.将笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸和二氯亚砜进行第一混合并加热，后进行第一除杂，得到笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯；
S3.将所述壳聚糖甲磺酸溶液和所述笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯进行第二混合，后冷却，得到冷冻混合物；
S4.将所述冷冻混合物进行脱氨基保护，得到脱保护产物；
S5.将所述脱保护产物进行第二除杂，后冷冻干燥，得到壳聚糖衍生物。
作为一个可选的实施方式，如图2所示，所述将所述冷冻混合物进行脱氨基保护，得到脱保护产物，包括：
S41.将所述冷冻混合物进行解冻，后加入丙酮进行沉淀并清洗，得到沉淀混合物；
S42.将所述沉淀混合物以N，N-二甲基甲酰胺溶解，后加入哌啶，反应时间为3~12h，得到脱保护产物；
所述哌啶的终点体积分数为5~30%。
本申请中，反应时间为3~12h的积极效果是在该反应时间范围内，能比较不同脱保护时间下氨基的脱保护率；当该时间取值范围过大，将导致的不利影响是反应耗时过长，当该时间取值范围过小，将导致的不利影响是反应时间过短，导致氨基脱保护率过低。
哌啶的加入量占所述脱保护反应液的质量的5~30%的积极效果是在该质量占比的范围内，能比较不同浓度的哌啶含量下对氨基的脱保护率；当该占比取值范围过大，将导致的不利影响是哌啶加入量过多，使合成成本增高，当该占比取值范围过小，将导致的不利影响是哌啶加入量不足，使氨基脱保护率过低。
作为一个可选的实施方式，如图2所示，所述将所述壳聚糖粉末溶于甲磺酸中，得到壳聚糖甲磺酸溶液，包括：
S11.将壳聚糖粉末在冰浴条件下加入到甲磺酸中，得到壳聚糖甲磺酸溶液；
所述壳聚糖和所述甲磺酸的质量体积比为1g:10mL~1g:30mL。
本申请中，壳聚糖和甲磺酸的质量体积比为1g:10mL~1g:30mL的积极效果是在该质量体积比的范围内，能比较不同甲磺酸添加量下壳聚糖的溶解程度及溶液的均一度；当该质量体积比的取值范围过大，将导致的不利影响是壳聚糖的加入量过多，导致壳聚糖的溶解程度低及溶液的均一度差，当该质量体积比的取值范围过小，将导致的不利影响是甲磺酸加入量过多，导致合成成本升高。
作为一个可选的实施方式，所述第一除杂包括：旋转蒸发除去二氯亚砜；
所述第一除杂的温度为30~80℃，时间为60~180min；
所述第二除杂依次包括：第一pH调节、加水并离心、第二pH调节和透析；
所述加水的水量和所述脱保护液的体积之比为1：3~8；
所述透析包括：采用纯水透析72~150h，并每隔12h更换一次透析液；
所述第一pH调节的终点为7.0~9.0，所述第二调节的终点为2.0~7.0。
本申请中，第一除杂的温度为30~80℃的积极效果是在该温度范围内，能比较不同温度下二氯亚砜的去除率及副反应度；当该温度的取值范围过大，将导致的不利影响是过高的第一除杂温度将导致副反应增多，当该温度的取值范围过小，将导致的不利影响是过低的第一除杂温度将导致二氯亚砜去除率偏低。
第一除杂的时间为60~180min的积极效果是在该时间范围内，能比较不同除杂时间下二氯亚砜的去除率；当该时间的取值范围过大，将导致的不利影响是第一除杂的时间过长，导致合成过程的耗时过长，当该时间的取值范围过小，将导致的不利影响是第一除杂的时间过短，导致二氯亚砜去除率偏低。
加水的水量和脱保护液的体积之比为1：3~8的积极效果是能够充分去除反应体系中非水溶性杂质；当该体积之比取值范围过大，将导致的不利影响是反应阶段的终体积过大，导致整体反应费时费力，当该体积之比取值范围过小，将导致的不利影响是产物与杂质不能完全分开。
作为一个可选的实施方式，所述第二混合包括：在冰浴条件下混合，并搅拌0.5~2h，在-25~5℃下过夜；
所述第一混合的笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸和二氯亚砜的质量体积比为1g：2mL~1g：10mL；
所述加热的终点温度为50~80℃，时间为120~300min。
本申请中，加热的终点温度为50~80℃的积极效果是在该终点温度的范围内，能控制不同温度下的反应效率及副反应度；当该温度的取值范围过大，将导致的不利影响是该温度过高，导致副反应的发生，当该温度的取值范围过小，将导致的不利影响是反应温度过低，导致反应不充分。
搅拌0.5~2h的积极效果是在该搅拌时间内，能增加反应体系各个区域的均一性；当该时间的取值范围过大，将导致的不利影响是过长的搅拌时间将导致反应体系吸收空气中的水分而发生副反应，当该时间的取值范围过小，将导致的不利影响是反应体系的搅拌时间过短，不同部位酯化度不均一。
在-25~5℃下过夜的积极效果是使反应充分进行；当该温度的取值范围过大，将导致的不利影响是过高的温度将发生副反应，当该温度的取值范围过小，将导致的不利影响是反应不充分。
加热的时间为120~300min的积极效果是在该加热时间内，能控制不同反应时间下笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸酰氯化的程度；当该时间的取值范围过大，将导致的不利影响是整体合成过程的耗时过多，当该时间的取值范围过小，将导致的不利影响是反应不充分。
本申请的一个实施例中，提供一种壳聚糖衍生物的应用，所述应用包括将所述衍生物用于止血和抗菌的药物中。
实施例1
壳聚糖的氨基葡萄糖单元和笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯的摩尔比为1：1。
如图2所示，一种壳聚糖衍生物的制备方法，包括：
称取脱乙酰度95%的壳聚糖粉末1.61g；
S11.将壳聚糖粉末在冰浴条件下加入到甲磺酸中，得到壳聚糖甲磺酸溶液；
称取笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸3.53g；
S2.将笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸和二氯亚砜进行第一混合并加热，后进行第一除杂，得到的油状黄色物质，命名为笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯；
S3.将壳聚糖甲磺酸溶液和笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯进行第二混合，后冷却，得到冷冻混合物；
S41.将冷冻混合物进行常温解冻，后加入150mL的丙酮进行搅拌，并于离心力3000×g、温度为4℃条件下离心30min得到沉淀，将沉淀物再次以丙酮清洗，得到沉淀混合物；
S42.将沉淀混合物以N，N-二甲基甲酰胺溶解，后加入哌啶，反应时间为4h，得到脱保护产物；
S5.将脱保护产物进行第二除杂，后冷冻干燥，得到微黄色终产物，即为壳聚糖衍生物。
哌啶的终点体积分数为7%。
将壳聚糖粉末溶于甲磺酸中，得到壳聚糖甲磺酸溶液，包括：
壳聚糖和甲磺酸的质量体积比为1g:20mL，即加入甲磺酸的体积为32.2mL。
第一除杂包括：旋转蒸发除去二氯亚砜；
第一除杂的温度为45℃，时间为120min。
第二除杂依次包括：第一pH调节，加水并离心，第二pH调节，透析；
加水的水量和脱保护液的体积之比为1:4；
离心包括在离心力为8000×g、离心温度为4℃条件下离心30min。
透析包括：采用纯水透析80h，并每隔12h更换一次透析液；
第一pH调节的终点为pH=8，第二调节的终点为pH=6。
第二混合包括：在冰浴条件下混合，并搅拌1h，在-10℃下过夜；
第一混合的笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸和二氯亚砜的质量体积比为1g:3mL。
加热的终点温度为60℃，时间为240min。
实施例2
将实施例
Figure SMS_3
2和实施例1相对比，实施例2和实施例1的区别在于：
壳聚糖的氨基葡萄糖单元和笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯的摩尔比为1：3。
称取脱乙酰度95%的壳聚糖粉末1.61g，
称取笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸10.60g，
S41.将冷冻混合物进行常温解冻，后加入200mL的丙酮进行沉淀，在离心力3000×g、温度为4℃条件下离心30min得到沉淀，将沉淀物清洗，得到沉淀混合物；
S42.将沉淀混合物以N，N-二甲基甲酰胺溶解，后加入哌啶，反应时间为6h，得到脱保护产物；
壳聚糖和甲磺酸的质量体积比为1g:15mL，说明加入甲磺酸的体积为24.15mL。
第一除杂包括：旋转蒸发除去二氯亚砜；
第一除杂的温度为40℃，时间为120min。
第二除杂依次包括：第一pH调节，加水并离心，第二pH调节，透析；
加水的水量和脱保护液的体积之比为1:6；
离心包括在离心力为8000×g、离心温度为4℃条件下离心30min。
透析包括：采用纯水透析150h，并每隔12h更换一次透析液；
第一pH调节的终点为pH=7.5，第二调节的终点为pH=5.5。
第二混合包括：在冰浴条件下混合，并搅拌1.5h，在-20℃下过夜；
第一混合的笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸和二氯亚砜的质量体积比为1g:6mL。
加热的终点温度为55℃，时间为200min。
实施例3
将实施例3和实施例1相对比，实施例3和实施例1的区别在于：
壳聚糖的氨基葡萄糖单元和笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯的摩尔比为1：5。
称取脱乙酰度95%的壳聚糖粉末1.61g，
称取笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸17.67g，
S41.将冷冻混合物进行常温解冻，后加入180mL的丙酮进行沉淀，在离心力3000×g、温度为4℃条件下离心30min得到沉淀，将沉淀物清洗，得到沉淀混合物；
42.将沉淀混合物以N，N-二甲基甲酰胺溶解，后加入哌啶，反应时间为12h，得到脱保护反应液；
壳聚糖和甲磺酸的质量体积比为1g:30mL，说明加入甲磺酸的体积为48.30mL。
第一除杂包括：旋转蒸发除去二氯亚砜；
第一除杂的温度为75℃，时间为150min。
第二除杂依次包括：第一pH调节，加水并离心，第二pH调节，透析；
加水的水量和脱保护液的体积之比为1：6；
离心包括在离心力为8000×g、离心温度为4℃条件下离心30min。
透析包括：采用纯水透析150h，并每隔12h更换一次透析液；
第一pH调节的终点为pH=8.5，第二调节的终点为pH=6.5。
第二混合包括：在冰浴条件下混合，并搅拌1.5h，在-25℃下过夜；
第一混合的笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸和二氯亚砜的质量体积比为1g:9mL。
加热的终点温度为65℃，时间为300min。
对比例1
取脱乙酰度95%的壳聚糖粉末，溶于摩尔浓度为0.01mol/L的稀盐酸中，搅拌使其充分溶解，并以摩尔浓度为0.01mol/L的NaOH溶液调节pH至pH=6.0，再装入透析袋中以纯水透析120h，每隔12h更换一次透析液，最后冷冻干燥得壳聚糖盐酸盐。
相关实验：
收集对比例和实施例1~3得到的壳聚糖盐酸盐和壳聚糖衍生物，进行水溶性检测和溶解速率检测，检测结果如表1所示。
相关实验方法：
溶解度的测试方法：
a.对于每个待测样，取3支玻璃试管并分别向每管中加入1mL纯水；
b.向3支试管中分别加入10mg的壳聚糖盐酸盐或壳聚糖衍生物，搅拌使其溶解，待终点产物完全溶解后，继续加入10mg的溶质；
c.循环步骤b直至加入终点产物搅拌60min后，仍有溶质不能溶解则定为溶解度极限，分别记录此时3支试管中终点产物的添加量，得到终点产物的添加量和试管中纯水体积的比例，取平均值（以Mean ± SD表示），得到壳聚糖衍生物的溶解度；
d.将对比例和各实施例得到的壳聚糖盐酸盐和壳聚糖衍生物壳聚糖衍生物经过上述试验后，得到对比例和各实施例的终点产物的溶解度。
溶解速率的测试方法：
a.将各壳聚糖盐酸盐和壳聚糖衍生物分别通过机械法打粉，过100目筛；
b.收集对比例1和实施例1~3得到的壳聚糖盐酸盐和壳聚糖衍生物过筛后的粉末，并分别取50mg装入玻璃试管（每组6个重复），再向每管中加入1mL纯水，快速搅拌15s，静置。记录壳聚糖盐酸盐和壳聚糖衍生物完全溶解所消耗的时间。
表1
Figure SMS_5
表1中具体分析：
溶解度是指制备得到的终点产物在水中的溶解能力，当溶解度越大，说明该终点产物的水溶性越好。
溶解时间是指制备得到的终点产物在水中的溶解快慢，当溶解时间越短，说明该终点产物的溶解速率越快，作用于创伤处便能越快的发挥促凝血的功能。
从对比例1和实施例1~3的数据可知：
各条件下合成的壳聚糖衍生物的水溶性均大于常规方法制得的壳聚糖盐酸盐，且壳聚糖的氨基葡萄糖单元和笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯的摩尔比越高，所获得的壳聚糖衍生物的水溶性越强。
各条件下合成的壳聚糖衍生物在水中的溶解速率均大于常规方法制得的壳聚糖盐酸盐，且壳聚糖的氨基葡萄糖单元和笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯的摩尔比越高，所获得的壳聚糖衍生物的溶解速率越快。
为验证本申请对比例1和实施例1~3的得到的壳聚糖盐酸盐和壳聚糖衍生物在实际的止血和抗菌药物中的应用，本申请还对壳聚糖盐酸盐和壳聚糖衍生物进行抗菌和止血的效果实验，结果如表2所示。
相关实验的方法：
大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）的具体检测方法如下：
a.将各壳聚糖盐酸盐和壳聚糖衍生物分别溶于水中依次制成浓度为50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、350μg/mL、400μg/mL、450μg/mL和500μg/mL的溶液；
b.以滤膜孔径为0.22μm的针式滤器对各组溶液过膜除菌；
c.取除菌后的各组溶液0.5mL于摇菌管中，并加入0.5mL事先配好并除菌的LB液体培养基（pH=6.0），每组6个重复。此时，各组溶液中壳聚糖盐酸盐或壳聚糖衍生物的终浓度依次为25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、150μg/mL、175μg/mL、200μg/mL、225μg/mL和250μg/mL；
d.设置调零组：向6只摇菌管中分别加入0.5mL无菌水及0.5mL事先配好并除菌的LB液体培养基（pH=6.0）；
e.设置阳性组：向6只摇菌管中分别加入0.5mL浓度为100μg/mL的葡萄糖酸氯己定溶液及0.5mL事先配好并除菌的LB液体培养基（pH=6.0）；
f.向上述除调零组外的所有摇菌管中各加入10μL大肠杆菌发酵液（菌浓度约106CFU/mL），盖好管盖，于28℃、200rpm下培养24h；
g.于酶标仪下测定每管溶液的OD600值，并减去调零组的平均值，即得每管中溶液的真实OD600值；
h.通过与阳性组大肠杆菌OD600值的比较，得到对比例和实施例1~3所得的壳聚糖盐酸盐和壳聚糖衍生物对大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）；
i.采用同样的方法测定对比例和实施例1~3所得的壳聚糖盐酸盐和壳聚糖衍生物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC），但测定OD450值。
促凝血能力的检测方法：
a.取36只C57BL/6小鼠（雌雄各半）随机分为6组，每组6只，并以戊巴比妥钠（40mg/mL）行腹腔注射，数分钟后小鼠充分麻醉，进行后续相关实验；
b.将小鼠固定于解剖板上，行解剖后，打开腹腔，暴露出肝脏；
c.以滤纸片擦去肝脏周围的组织液，将事先称重过的滤纸片放于肝叶下，并以G20针头刺破肝脏，立即向创口处撒上10mg壳聚糖盐酸盐或壳聚糖衍生物或沸石粉（阳性药物）；
d.将解剖板倾斜45°抬起，使血液向下流出并被滤纸片吸收，5min后将滤纸片取下称重，计算血流量，其中，出血量=试验后滤纸片的重量-试验前滤纸片的重量；
e.重复上述实验，每组受试样进行6次平行试验，并设置空白组（刺破肝脏后，不向创口撒任何材料）；
g.计算每组小鼠肝脏出血量的平均值。
表2
Figure SMS_6
表2的具体分析：
最低抑菌浓度（MIC）是衡量抗菌药物抗菌性能的一种国际通用标准，MIC越小则该抗菌药物的抗菌性能越好。
出血量的平均值是指经过多次平行实验之后，出血量的平均值越低，说明止血效果越好。
从对比例和实施例1~3的数据可知：
各条件下合成的壳聚糖衍生物的抗菌性能均优于常规方法制得的壳聚糖盐酸盐。但实施例1~3所得的壳聚糖衍生物的抗菌能力并无明显差异，说明在壳聚糖衍生物的合成过程中继续提高壳聚糖的氨基葡萄糖单元和笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯的摩尔比对壳聚糖衍生物的抗菌能力并无影响。
各条件下合成的壳聚糖衍生物的促凝血能力均大于常规方法制得的壳聚糖盐酸盐，且随着壳聚糖的氨基葡萄糖单元和笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯的摩尔比的增高，所获得的壳聚糖衍生物的止血效果也有一定程度的提高。
本申请实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点：
（1）本申请实施例中，采用笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯分别与壳聚糖的羟基和氨基发生酯化和酰基化反应，一定程度上抑制分子内和分子间氢键的形成，提高其在水中的溶解度及溶解速率；
（2）本申请实施例中，所制备得到的壳聚糖衍生物具有更强的抗菌及止血能力，可更好的扩展壳聚糖的应用领域。
（3）本申请实施例中，由于只需要进行简单的化学反应，使整体改性方法简单易行，无需过多设备和试剂。
附图解释：
图3为本申请实施例提供的一种壳聚糖衍生物的合成线路示意图；由图3可知，其实质原理是笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯与壳聚糖的羟基和氨基分别发生酯化和酰基化反应，羟基被取代后可抑制分子内和分子间氢键的形成，提高其在水中的溶解度及溶解速率。
图4为本申请实施例提供的一种壳聚糖和壳聚糖衍生物的红外图谱对比图；由图4可知，在波长1723.71cm-1处氨基己酸-壳聚糖酯明显多了一个较高的吸收峰，此峰为酯键中C=O的伸缩振动或酰胺键中C=O的伸缩振动所产生的结果。
图5为本申请实施例提供的一种壳聚糖和壳聚糖衍生物的核磁共振氢谱对比图；在图5内CSH的核磁共振氢谱中，δ=1.99ppm为甲壳质未完全脱乙酰化残留的乙酰氨基上的甲基中H的化学位移，δ=3.07ppm为甲壳质脱乙酰化后氨基中的H的化学位移，δ=3.65~3.84ppm处的重叠峰为壳聚糖环骨架上的H的化学位移,δ=4.70ppm为溶剂峰及被溶剂峰遮蔽的羟基中H的化学位移；在图5内CSH-AA的核磁共振氢谱中，δ=1.09~1.62ppm和δ=2.16~2.25ppm为氨基己酸碳骨架上H的化学位移，δ=1.98ppm为甲壳质未完全脱乙酰化残留的乙酰氨基上的甲基H的化学位移，δ=2.84~2.93ppm为氨基中的H和酰胺键中的H的化学位移，δ=3.45~3.87ppm处的重叠峰为壳聚糖环骨架上的H的化学位移，δ=4.57~4.79ppm为溶剂峰及被溶剂峰遮蔽的羟基的H的化学位移。
综合图4及图5的结果可知，壳聚糖衍生物的化学结构与式1所表达的结构相一致。
图6为本申请实施例提供的一种壳聚糖和壳聚糖衍生物的促凝血效果对比图，由图6可知，小鼠肝脏经G20针头刺破后会有大量血液流出，在流血口敷上止血材料可一定程度上减少血液的流出，小鼠肝脏的出血量越少，表明受试材料的促凝血效果越好，其中本申请提供的壳聚糖衍生物的止血能力了较强，并且止血能力随着壳聚糖的氨基葡萄糖单元和笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯的摩尔比的增高。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种壳聚糖衍生物，其特征在于，所述壳聚糖衍生物是壳聚糖经过有效基团进行化学修饰得到的，其中，所述有效基团包括6-氨基己酸，所述化学修饰具体包括：将所述壳聚糖的羟基和氨基分别与所述有效基团的羧基发生酯化和酰基化反应；
所述衍生物的结构通式如式1所示，
Figure QLYQS_1
其中，n≥2。
2.根据权利要求1所述的衍生物，其特征在于，所述衍生物为壳聚糖的羟基和氨基分别与笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯发生酯化和酰基化反应后得到的产物。
3.根据权利要求2所述的衍生物，其特征在于，所述壳聚糖的氨基葡萄糖单元和笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯的摩尔比为1∶1～1∶5。
4.一种制备权利要求1～3任一项所述的衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括：
将壳聚糖粉末溶于甲磺酸中，得到壳聚糖甲磺酸溶液；
将笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸和二氯亚砜进行第一混合并加热，后进行第一除杂，得到笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯；
将所述壳聚糖甲磺酸溶液和所述笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸-酰氯进行第二混合，后冷却，得到冷冻混合物；
将所述冷冻混合物进行脱氨基保护，得到脱保护产物；
将所述脱保护产物进行第二除杂，后冷冻干燥，得到壳聚糖衍生物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述冷冻混合物进行脱氨基保护，得到脱保护产物，包括：
将所述冷冻混合物进行解冻，后加入丙酮进行沉淀并清洗，得到沉淀混合物；
将所述沉淀混合物以N，N-二甲基甲酰胺溶解，后加入哌啶进行脱保护，反应时间为3～12h，得到脱保护反应液；
所述哌啶的终点体积分数为5％～30％。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述将壳聚糖粉末溶于甲磺酸中，得到壳聚糖甲磺酸溶液，包括：
将壳聚糖粉末在冰浴条件下加入到甲磺酸中，得到壳聚糖甲磺酸溶液；
所述壳聚糖和所述甲磺酸的质量体积比为1g∶10mL～1g∶30mL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一除杂包括：旋转蒸发除去二氯亚砜；
所述第一除杂的温度为30～80℃，时间为60～180min；
所述第二除杂依次包括：第一pH调节、加水并离心、第二pH调节和透析；
所述加水的水量和所述脱保护液的体积之比为1：3～8；
所述透析包括：采用纯水透析72～150h，并每隔12h更换一次透析液；
所述第一pH调节的终点为7.0～9.0，所述第二调节的终点为2.0～7.0。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二混合包括：在冰浴条件下混合，并搅拌0.5～2h，在-25～5℃下过夜；
所述第一混合的笏甲氧羰酰基-6-氨基己酸和二氯亚砜的质量体积比为1g∶2mL～1g∶10mL；
所述加热的终点温度为50～80℃，时间为120～300min。
9.一种壳聚糖衍生物的应用，其特征在于，所述应用包括将如权利要求1-3任一所述的壳聚糖衍生物用于制备止血或抗菌的药物中。
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