CN103923217B - 6-氨基己酸纤维素酯及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种6‑氨基己酸纤维素酯及其合成方法和应用，6‑氨基己酸纤维素酯是纤维素的部分羟基被取代，每个葡萄糖单元环上
Description
技术领域
本发明属于微流控芯片表面改性试剂技术领域，具体涉及6-氨基己酸纤维素酯及其合成方法和应用。
背景技术
纤维素酯是以纤维素作为中间体制备的衍生物，纤维素是由成百上千的脱水葡萄糖单元组成的化合物。脱水葡萄糖单元的这种结合叫做聚β-葡萄苷链，将纤维素与特定的羧酸类或酸酐类酯化反应可制备纤维素酯类。实际商品化应用的纤维素酯类有：纤维素醋酸酯、纤维素硝酸酯、纤维素乙酸丁酸酯和纤维素磺酸酯，这些纤维素酯广泛应用于工业生产中。然而，在当今最具有发展潜力的微流控分析系统中，纤维素酯的应用受到很大的限制。
动态物理涂层法是目前聚二甲基硅氧烷等微流控芯片最为常用的一种表面修饰方法。常用表面修饰试剂包括小分子的表面活性剂如十二烷基-β-D-麦芽糖苷和高分子水溶性聚合物如甲基纤维素、聚乙二醇、聚乙烯醇等。其中，以高浓度水溶性聚合物如0.5%甲基纤维素的修饰效果较好，但高浓度水溶性聚合物会使溶液粘度变大，为实验操作带来不便，且对抑制蛋白质的非特异性吸附效果不理想。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于根据现有的微流控芯片表面改性剂在动态物理涂层中存在的溶液粘度大，给实验操作带来不便，且对抑制蛋白质的非特异性吸附效果不理想的缺点，提供一种新的可作为微流控芯片表面改性剂的化合物——6-氨基己酸纤维素酯，并为该表面改性剂提供一种合成方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：6-氨基己酸纤维素酯是纤维素的部分羟基被取代，每个葡萄糖单元环上的总平均取代度为0.6～1.2。
上述6-氨基己酸纤维素酯的制备方法由下述步骤组成：
1、合成N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸
将氢氧化钠、6-氨基己酸、二碳酸二叔丁酯按摩尔比为2:1:1溶于蒸馏水、1,4-二氧六环的体积比为1:1的混合液中，-20～0℃反应10～12小时，用盐酸酸化至pH值为2，分离纯化产物，得到N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸。
2、N,N’-羰基二咪唑活化N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸
以二甲基亚砜为溶剂，将N,N’-羰基二咪唑、N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸按摩尔比为1:1混合，在氮气保护下，60～80℃反应20～24小时。
3、合成N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸纤维素酯
按照纤维素与N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸的摩尔比为1:2.5～7.5取纤维素，将纤维素、四丁基氟化铵三水合物按质量比为1:6溶解于二甲基亚砜中，在氮气保护下常温反应15分钟，倒入步骤2所得反应液中，在氮气保护下，50～90℃反应18～25小时，用超纯水析出沉淀，过滤，用乙醇洗涤沉淀物，得到N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸纤维素酯。
4、合成6-氨基己酸纤维素酯
将N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸纤维素酯溶于三氟乙酸、二甲基亚砜的体积比为1:2的混合液中，-20～0℃反应3小时，用乙醚析出沉淀，过滤，用二甲基亚砜洗涤沉淀，得到6-氨基己酸纤维素酯。
上述的合成N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸纤维素酯步骤3中，优选按照纤维素与N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸的摩尔比为1:3取纤维素，将纤维素、四丁基氟化铵三水合物按质量比为1:6溶解于二甲基亚砜中，在氮气保护下常温反应15分钟，倒入步骤2所得反应液中，在氮气保护下，80℃反应20小时，用超纯水析出沉淀，过滤，用乙醇洗涤沉淀物，得到N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸纤维素酯。
本发明的6-氨基己酸纤维素酯在聚二甲基硅氧烷微流控芯片表面改性中的用途，其具体使用方法为：将6-氨基己酸纤维素酯加入运行缓冲液中，所述的运行缓冲液是20mmol/L pH值为7.4～9.4的PBS缓冲液、10mmol/L pH值为8.0～11.0的硼砂缓冲液或50mmol/L pH值为7.0～9.0的Tris-HCl缓冲液，每100mL运行缓冲液中加入0.5g6-氨基己酸纤维素酯，配制成表面改性剂，向氢氧化钠活化处理后的聚二甲基硅氧烷微流控芯片的微通道中注入表面改性剂，常温孵育2分钟，得到表面改性的聚二甲基硅氧烷微流控芯片。
与现有的微流控芯片表面改性试剂相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明6-氨基己酸纤维素酯的合成原料来源广泛，反应条件温和，成本低。
（2）本发明6-氨基己酸纤维素酯可以作为聚二甲基硅氧烷微流控芯片的表面改性试剂，经物理吸附在聚二甲基硅氧烷微控芯片通道表面形成带正电荷的单分子膜，可以增强聚二甲基硅氧烷微流控芯片通道的表面亲水性，有效地抑制蛋白质在微流控芯片通道表面的非特异性吸附，实现分析物的高效重现分离。
附图说明
图1是异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白在聚二甲基硅氧烷微流控芯片微通道中的荧光吸附照片。
图2是异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白在实施例4表面改性的聚二甲基硅氧烷微流控芯片微通道中的荧光吸附照片。
图3是异硫氰酸荧光素标记的溶菌酶在聚二甲基硅氧烷微流控芯片微通道中的荧光吸附照片。
图4是异硫氰酸荧光素标记的溶菌酶在实施例4表面改性的聚二甲基硅氧烷微流控芯片微通道中的荧光吸附照片。
图5是异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白、溶菌酶分别在聚二甲基硅氧烷微流控芯片、实施例4表面改性的聚二甲基硅氧烷微流控芯片微通道中的相对荧光吸附强度。
图6是采用实施例4表面改性的聚二甲基硅氧烷微流控芯片分离苯丙氨酸和精氨酸得到的电泳图。
图7是采用实施例4表面改性的聚二甲基硅氧烷微流控芯片分离神经降压素和甲硫脑啡肽得到的电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但是本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、合成N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸
在装有磁力搅拌器的50mL单口瓶中加入1.60（40mmol）氢氧化钠、2.62g（20mmol）6-氨基己酸、4.37g（20mmol）二碳酸二叔丁酯、10mL蒸馏水、10mL1，4-二氧六环，在-10℃下搅拌10小时，反应完毕后，将反应液缓慢倒入100mL的烧杯中，用浓度为2mmol/L的盐酸水溶液酸化反应液至pH值为2，用乙酸乙酯反复萃取所得产物3次，收集乙酸乙酯萃取液，用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯萃取液，然后蒸发浓缩乙酸乙酯萃取液，向浓缩的萃取液中加入石油醚重结晶，过滤，得到白色晶状固体N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸约4.3g。
2、N,N’-羰基二咪唑活化N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸
在装有磁力搅拌器的50mL单口瓶中加入4.27g（18.5mmol）N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸、3.00g（18.5mmol）N,N’-羰基二咪唑和30mL二甲基亚砜，在氮气保护下，80℃反应时间20小时。
3、合成N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸纤维素酯
在装有磁力搅拌器的250mL三口瓶中加入6g（20mmol）四丁基氟化铵三水合物、1g（6.17mmol）纤维素和60mL二甲基亚砜，在氮气保护下常温反应15分钟，然后倒入步骤2所得反应液中，在氮气保护下，80℃反应20小时，反应结束后将反应液倒入200mL超纯水中析出沉淀，过滤，并用150mL乙醇洗涤沉淀物，得到N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸纤维素酯约2.5g。
4、合成6-氨基己酸纤维素酯
在装有磁力搅拌器的50mL单口瓶中加入1g N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸纤维素酯和16mL二甲基亚砜，缓慢加入8mL三氟乙酸，-10℃反应3小时，反应结束后将反应液倒入50mL乙醚中析出沉淀，过滤，并用100mL二甲基亚砜洗涤沉淀，得到6-氨基己酸纤维素酯0.8g。
所得6-氨基己酸纤维素酯的表征数据为：FT-IR（cm-1）：3452（N-H），2904（C-H），1740（C=O酯），1239（C-O-C酯）；元素分析：C53.2%，H7.5%，N4.0%，经计算，其总平均取代度（DS）为1.09。
实施例2
在实施例1的合成N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸纤维素酯步骤3中，按照纤维素与N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸的摩尔比为1:4取纤维素，将纤维素、四丁基氟化铵三水合物按质量比为1:6溶解于二甲基亚砜中，在氮气保护下常温反应15分钟，倒入步骤2所得反应液中，在氮气保护下，50℃反应25小时，用超纯水析出沉淀，过滤，用乙醇洗涤沉淀物，得到N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸纤维素。其他步骤与实施例1相同，得到6-氨基己酸纤维素酯，经计算，其总平均取代度（DS）为0.72。
实施例3
在实施例1的合成N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸纤维素酯步骤3中，按照纤维素与N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸的摩尔比为1:5取纤维素，将纤维素、四丁基氟化铵三水合物按质量比为1:6溶解于二甲基亚砜中，在氮气保护下常温反应15分钟，倒入步骤2所得反应液中，在氮气保护下，90℃反应18小时，用超纯水析出沉淀，过滤，用乙醇洗涤沉淀物，得到N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸纤维素酯。其他步骤与实施例1相同，得到6-氨基己酸纤维素酯，经计算其总平均取代度（DS）为0.93。
实施例4
实施例1制备的6-氨基己酸纤维素酯在聚二甲基硅氧烷微流控芯片表面改性中的用途，具体方法如下：
将聚二甲基硅氧烷芯片微通道先用1mol/L的氢氧化钠水溶液浸泡5分钟，进行活化处理，然后用去离子水冲洗至中性，再用10mmol/L pH值为9.4的硼砂缓冲液冲洗，得到氢氧化钠活化处理后的聚二甲基硅氧烷微流控芯片。将6-氨基己酸纤维素酯加入10mmol/LpH值为9.4的硼砂缓冲液中，每100mL硼砂缓冲液中加入0.5g6-氨基己酸纤维素酯，配制成表面改性剂，用注射器向氢氧化钠活化处理后的聚二甲基硅氧烷微流控芯片的微通道中注入表面改性试剂，常温孵育2分钟，得到表面改性的聚二甲基硅氧烷微流控芯片。
为了证明本发明的有益效果，发明人对实施例4得到的表面改性的聚二甲基硅氧烷微流控芯片进行了各种性能测试，具体试验情况如下：
1、表面亲水性能测试
通过接触角测量实验对聚二甲基硅氧烷芯片和表面改性的聚二甲基硅氧烷微流控芯片进行表征，聚二甲基硅氧烷芯片的接触角为119.4±2.6°，表面改性的聚二甲基硅氧烷微流控芯片的接触角为58.1±0.8°，说明采用本发明的6-氨基己酸纤维素酯对聚二甲基硅氧烷微流控芯片表面改性后，可以增强其表面亲水性。
2、表面抗吸附性试验
将1mg/mL异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白和溶菌酶分别注入聚二甲基硅氧烷微流控芯片微通道和表面改性的聚二甲基硅氧烷微流控芯片微通道中，37℃孵育1小时，然后用20mmol/L pH值为7.4的PBS缓冲液冲洗10分钟，用倒置荧光显微镜记录牛血清白蛋白在微通道中的吸附情况，结果见图1～5。
由图可见，在聚二甲基硅氧烷微流控芯片微通道中，异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白和溶菌酶的相对荧光强度较强，而表面改性的聚二甲基硅氧烷微流控芯片微通道中，异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白和溶菌酶的相对荧光强度很弱，说明采用本发明的6-氨基己酸纤维素酯对聚二甲基硅氧烷微流控芯片表面改性后，对蛋白质的非特异性吸附起到了很好的抑制作用。
3、分离氨基酸和多肽
采用表面改性的聚二甲基硅氧烷微流控芯片分别对苯丙氨酸和精氨酸、神经降压素和甲硫脑啡肽进行电泳分析。结果分别见图6和图7。
由图可见，苯丙氨酸和精氨酸、神经降压素和甲硫脑啡肽分别得到很好地分离，说明采用本发明的6-氨基己酸纤维素酯对聚二甲基硅氧烷微流控芯片表面改性后，能够对氨基酸、多肽等生物分子实现高效重现分离。
Claims (4)
1.一种用于聚二甲基硅氧烷微流控芯片表面改性的6-氨基己酸纤维素酯，其特征在于：纤维素的部分羟基被取代，每个葡萄糖单元环上的总平均取代度为0.6～1.2。
2.一种权利要求1的6-氨基己酸纤维素酯的合成方法，其特征在于它由下述步骤组成：
(1)合成N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸
将氢氧化钠、6-氨基己酸、二碳酸二叔丁酯按摩尔比为2:1:1溶于蒸馏水、1,4-二氧六环的体积比为1:1的混合液中，-20～0℃反应10～12小时，用盐酸酸化至pH值为2，分离纯化产物，得到N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸；
(2)N,N’-羰基二咪唑活化N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸
以二甲基亚砜为溶剂，将N,N’-羰基二咪唑、N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸按摩尔比为1:1混合，在氮气保护下，60～80℃反应20～24小时；
(3)合成N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸纤维素酯
按照纤维素与N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸的摩尔比为1:2.5～7.5取纤维素，将纤维素、四丁基氟化铵三水合物按质量比为1:6溶解于二甲基亚砜中，在氮气保护下常温反应15分钟，倒入步骤(2)所得反应液中，在氮气保护下，50～90℃反应18～25小时，用超纯水析出沉淀，过滤，用乙醇洗涤沉淀物，得到N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸纤维素酯；
(4)合成6-氨基己酸纤维素酯
将N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸纤维素酯溶于三氟乙酸、二甲基亚砜的体积比为1:2的混合液中，-20～0℃反应3小时，用乙醚析出沉淀，过滤，用二甲基亚砜洗涤沉淀，得到6-氨基己酸纤维素酯。
3.根据权利要求2所述的6-氨基己酸纤维素酯的合成方法，其特征在于：所述的合成N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸纤维素酯步骤(3)中，按照纤维素与N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸的摩尔比为1:3取纤维素，将纤维素、四丁基氟化铵三水合物按质量比为1:6溶解于二甲基亚砜中，在氮气保护下常温反应15分钟，倒入步骤(2)所得反应液中，在氮气保护下，80℃反应20小时，用超纯水析出沉淀，过滤，用乙醇洗涤沉淀物，得到N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸纤维素酯。
4.权利要求1的6-氨基己酸纤维素酯在聚二甲基硅氧烷微流控芯片表面改性中的用途。
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