CN102070701B - 用金属氧化物富集糖肽及同时富集糖肽和磷酸化肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用金属氧化物富集糖肽以及同时富集糖肽和磷酸化肽的方法。本方法特点在于利用金属氧化物做为固相萃取材料,从蛋白酶解液中分离富集糖肽,并且利用简单的操作可以从一份样品中实现磷酸化肽和糖肽的同时富集。具体地说是在中性或弱酸性条件下将金属氧化物和样品混合,酸性条件洗脱得到糖肽,碱性条件洗脱得到磷酸化肽,可以在同一份样品中实现磷酸化肽和糖肽的高效率、高选择性的富集。
Description
技术领域
本发明涉及糖肽和磷酸化肽的分离与纯化,具体地说是一种利用金属氧化物富集糖肽以及同时富集磷酸化肽和糖基化肽的方法。
技术背景
翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组学中的研究热点课题,尤其是蛋白质的磷酸化和糖基化,是存在最为普遍,研究最为广泛的两种翻译后修饰过程。蛋白质的磷酸化几乎调控生命的整个过程,包括细胞的增殖,发育和分化,也是目前所知道的信号的主要传递方式之一。同时,了解蛋白质的糖基化过程,对一些如癌症炎症等疾病的诊断和治疗都是具有非常重要的意义。目前,对于蛋白质翻译后修饰过程的研究一个非常重要的手段就是利用生物质谱解析蛋白质的肽段结构,但由于糖基化和磷酸化肽段离子化效率较低,质谱信号常常受到非修饰肽段的抑制,严重干扰对修饰肽段的检测。因此,在质谱分析前对磷酸化和糖基化肽段的富集是非常必要的[Liu,X.;Ma,L.;Li,J.J.Anal.Lett.2008,41,268;Morelle,W.;Canis,K.;Chirat,F.;Faid,V.;Michalski,J.C.Proteomics 2006,6,3993]。
近年来,很多富集糖肽的方法被提出和应用。最为常见的就是凝集素的方法,这种方法的选择性较好,但同时存在着通用性不强的缺点,尤其在处理复杂样品时很可能会丢失不能与凝集素特异性结合的糖肽[J.Glycoconjugate J.2004,21,35;Kubota,K.;Sato,Y.;Suzuki,Y.et al.Anal:Chem.2008,80,3693];化学方法如肼化学可以选择性的富集糖肽,但是这种方法丢失糖链的信息[Zhang,H.;Li,X.J.;Martin,D.B.;Aebersold,R.Nat.Biotechnol.2003,21,660.];亲水作用色谱也能够用来富集极性相对较大的糖肽,但是容易受到具有相当极性的非糖肽的干扰[Wada,Y.;Tajiri,M.;Yoshida,S.Anal.Chem.2004,76,6560.];硼酸能与顺势二醇形成硼酸酯结构也可以用来绑定糖肽,但这种方法的费时较长[Zhou,W.;Yao,N.;Yao,G.P.;Deng,C.H.;Zhang,X.M.;Yang,P.Y.Chem.Commun.2008,5577.];石墨化碳与极性的糖肽发生偶极相互作用而加强对糖肽的保留,但是不适用于具有较长肽段的糖肽。总之。目前还未见一种操作简单通用性强的富集方法来选择性的富集糖肽。用金属氧化物作为富集材料对糖肽进行富集目前未见报道。
相较于糖肽的富集磷酸化肽的富集近年来发展迅速,以氧化钛为代表的金属氧化物,在磷酸化肽富集方面展现了其选择性高特异性好的特点[Pinkse,M.W.H.;Uitto,P.M.;Hilhorst,M.J.;Ooms,B.;Heck,A.J.R.Anal.Chem.2004,76,3935;Larsen,M.R.;Thingholm,T.E.;Jensen,O.N.;Roepstorff,P.;Jorgensen,T.J.D.Mol.Cell.Proteomics 2005,4,873.],已经被广泛的应用到磷酸化蛋白质组学中。但是,用金属氧化物在一次操作中同时得到糖肽和磷酸化肽还未见报道。
发明内容
为解决上述难点,发明人通过研究氧化钛微球对单糖和寡糖的色谱保留行为发现,糖在氧化钛色谱柱上有很强的保留,这种保留随糖链的增长而增强,随流动相酸性添加剂的浓度增加而减少。发明人将氧化钛微球的这个性质用于进行糖肽的富集,通过对结构明确的标准糖蛋白的酶解液在不同条件下洗脱糖肽和非糖肽,实现了对糖肽的选择性富集。同时,由于氧化钛可以同时保留糖肽和磷酸化肽,通过在酸性条件下洗脱糖肽,在碱性条件下洗脱磷酸化肽,实现了糖肽和磷酸化肽的同时富集。
用金属氧化物富集糖肽及同时富集糖肽和磷酸化肽的方法,以金属氧化物作为固相萃取材料,富集蛋白酶解物中的糖肽或同时富集磷酸化肽和糖肽。
所述金属氧化物为氧化钛、氧化锆、氧化铝中的一种或多种复合金属氧化物;金属氧化物材料形态为纳米材料、微球材料以及金属氧化物涂覆或包覆的球形或无定形材料。
所述富集的过程为柱萃取,具体操作如下:
1)将金属氧化物装入萃取柱管中,将pH为5-8蛋白酶解物上样到萃取柱中,蛋白酶解物与金属氧化物材料的重量比例为1∶1~200;
2)分别用1~10倍柱体积的盐溶液、1~10倍柱体积的含有有机酸的乙腈水溶液冲洗萃取柱,乙腈的体积浓度为0-95%;
3)采用1~10倍柱体积的含有有机酸的乙腈水溶液洗脱糖肽,乙腈的体积浓度为0-95%;
4)采用1~10倍的柱体积的0.5-25wt%氨水洗脱得到磷酸化肽。
所述富集的过程为离心或过滤,具体操作如下:
1)将金属氧化物与pH为5-8的蛋白酶解物混合,蛋白酶解液中内含的蛋白酶解物与金属氧化物材料的重量比例为1∶1~200,孵化1~180分钟,离心或过滤分离,弃上层溶液,收集沉淀;
2)将2-100倍固体体积的盐溶液、2-100倍固体体积的含有有机酸的乙腈水溶液分别与沉淀混合震荡1~180分钟,乙腈的体积浓度为0-95%,离心或过滤分离,弃上层溶液,收集沉淀;此过程重复1-10次;
3)将1-50倍固体体积的含有有机酸的乙腈水溶液与沉淀混合震荡1~180分钟,乙腈的体积浓度为0-95%,离心或过滤分离,收集上清液以及沉淀,上清液即为糖肽;
4)将0.5-25wt%氨水与沉淀混合震荡1~180分钟,离心或过滤分离,收集上清液,弃去沉淀,上清液即为磷酸化肽。
所述富集的过程采用金属氧化物包覆磁珠进行,具体操作如下:
1)将pH为5-8磁珠与蛋白酶解物混合,蛋白酶解液中内含的蛋白酶解物与磁珠材料的重量比例为1∶1~200,孵化1~180分钟,在磁场作用下分离磁珠和上清液,弃上层溶液,收集磁珠;
2)将2-100倍固体体积的盐溶液、2-100倍固体体积的含有有机酸的乙腈水溶液分别与磁珠混合震荡1~180分钟,乙腈的体积浓度为0-95%,在磁场作用下分离磁珠和上清液,弃上层溶液,收集磁珠,此过程重复1-10次;
3)将1-50倍固体体积的含有有机酸的乙腈水溶液与磁珠混合震荡1~180分钟,乙腈的体积浓度为0-95%,在磁场作用下分离磁珠和上清液,收集上清液以及磁珠,上清液即为糖肽;
4)将1-50倍固体体积的0.5-25wt%氨水与磁珠混合震荡1~180分钟,在磁场作用下离心磁珠和上清液,收集上清液,磁珠可以再利用,清液即为磷酸化肽。
所述盐溶液为10~1000mmol/L氯化钠、磷酸盐、碳酸盐中一种或多种;有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸;所述步骤2)中的有机酸溶液体积浓度为0~10%;步骤3)中的有机酸溶液体积浓度为0.01~20%。
本发明具有如下优点:
1.本发明将金属氧化物引入到糖肽富集的领域,通过氧化物表面的亲水性质实现了糖肽的选择性富集。氧化钛对糖肽的这种亲和性是针对糖肽中的糖链的,所以具有很强的普适性和很高的特异性。
2.金属氧化物种类繁多且对酸碱的耐受性强,在试验过程中,可优化的实验条件范围广泛且没有材料流失等优点。
3.本实验操作简单,原料方便易得,无需活化时间,有助于实现高通量快速富集。
4.通过一个固相萃取柱实现糖肽和磷酸化肽的同时富集。
附图说明
图1;氧化钛微球对标准糖蛋白辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase)酶解产物中糖肽富集前后的ESI-MS谱图。(a)经过商品化氧化钛富集后的谱图;(b)经自制氧化钛富集后的谱图;(c)Horseradishperoxidase酶解物未经富集的谱图。标星号的为经文献报道的糖肽;标圆圈的为具有糖肽特征碎片离子的未知糖肽。
图2;氧化钛微球对标准糖蛋白人血清免疫球蛋白(human serumimmunoglobulin G)酶解产物中糖肽富集前后的ESI-MS谱图。(a)经氧化钛富集后的谱图;(b)未经富集的谱图。糖链结构在谱图中标示。
图3;氧化钛微球对标准磷酸化蛋白α-酪蛋白(α-casein)和糖蛋白辣根过氧化物酶酶解物(Horseradish peroxidase)混合物富集前后的ESI-MS谱图。(a)经氧化钛富集磷酸化肽的谱图;(b)经氧化钛富集的糖肽的谱图;(c)未经富集的谱图。星号标示为糖肽;菱形标示为磷酸化肽。
具体实施方式
现结合实例,对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明,而非对本发明的限定。
样品溶液的制备:1mg的α-酪蛋白溶解在1mL 50mM碳酸氢铵溶液中,按照α-酪蛋白与胰蛋白酶的质量比1∶40(w/w)的比例加入胰蛋白酶酶解,37℃反应16小时,而后加入终浓度为0.5%(v/v)甲酸终止酶解。
将1mg的人血清免疫球蛋白和1mg辣根过氧化物酶分别溶解在100μl含有8mol/L尿素的50mM碳酸氢铵震荡3小时,分别将上述获得的蛋白溶液加入5μL浓度为50mmol/L的二硫苏糖醇(Dithiothreitol;简称DTT)溶液,37℃放置2h,而后分别向蛋白溶液中加入10μL浓度为50mmol/L碘代乙酸(iodoacetic acid;简称IAA),室温下避光静置30分钟,将此溶液用碳酸氢铵稀释十倍,加入胰蛋白酶,按照蛋白与胰蛋白酶质量比1∶40(w/w)酶解,37℃反应16小时,而后加入终浓度为0.5%(v/v)甲酸终止酶解,分别获得人血清免疫球蛋白酶解液和辣根过氧化物酶酶解液。
实施例1
糖肽的氧化钛富集:1mg氧化钛(购自GL Science公司)匀浆装入GELoader tip管中,将已用氨水中和至中性的3.3μL(83.3pmol)辣根过氧化物酶酶解液上样,分别用30μL浓度为50mM碳酸氢铵溶液洗三次,30μL体积浓度为0.1%甲酸溶液冲洗三次,30μL含有体积浓度为0.5%甲酸的乙腈水溶液冲洗三次,其中乙腈水溶液中含有体积浓度的50%乙腈,最后用含有体积浓度为5%甲酸的乙腈水溶液10μL洗脱,其中乙腈水溶液中含有体积浓度的50%乙腈,收集洗脱液,经nanoESI-Q-Tof进样分析。
对比富集前后谱图1(c)和1(a)可见,标准糖蛋白辣根过氧化酶酶解后的糖肽经过上述过程后得到了有效的富集,非糖肽质谱信号降低,糖肽质谱信号增强,说明商品化的氧化钛微球在此操作下能够有效的富集糖肽。
实施例2
与实施例1不同在于所用的氧化钛为通过溶胶凝胶法自制氧化钛【专利号为200810202077.1】。
氧化钛制备方法如下:
步骤(1)在200ml圆底烧瓶中加入0.0024mol十二胺,100ml无水乙醇,0.006mol乙酰丙酮,0.012mol钛酸四丁酯,20℃下搅拌均匀后,加入0.3mol去离子水,溶液混浊后停止搅拌,静置45分钟后过滤,无水乙醇洗涤2~4次后,25℃~30℃下干燥得固体。
步骤(2)将由步骤(1)所得的固体1g,尿素0.2g,加入16ml无水乙醇,4ml去离子水,置于内衬聚四氟的高压釜内,130℃下静置8h,冷却后过滤,用丙酮和甲醇依次洗涤2~3次后,高温真空干燥6h,置于马弗炉中300℃烧结6h,得目标物氧化钛。
对比富集前后谱图1(c)和1(b)可见,自制的氧化钛也有很好的糖肽富集效果。
实施例3
糖肽的氧化钛富集:1mg自制氧化钛(专利号为200810202077.1)匀浆装入GELoader tip中,将10μL(67.7pmol)人血清免疫球蛋白酶解液上样,分别用30μL浓度为50mM碳酸氢铵溶液洗三次,30μL体积浓度为5%甲酸溶液冲洗三次,30μL含有体积浓度为5%甲酸的乙腈水溶液冲洗三次,其中乙腈水溶液中含有体积浓度的50%乙腈,最后用含有体积浓度为5%三氟乙酸水溶液30μL洗脱,收集洗脱液,洗脱液经氨水中和C18脱盐后,经nanoESI-Q-Tof直接进样分析。
对比富集前后谱图2(b)和2(a)可见,标准糖蛋白人血清免疫球蛋白酶解后的糖肽经过上述过程后得到了有效的富集,很多糖肽在富集之前被非糖肽信号抑制看不见,但经过富集后糖肽信号得到了明显改善,非糖肽得到有效的去除。此实验再次验证氧化钛能有效的富集糖肽。
实施例4
糖肽和磷酸化肽的同时富集:1mg实施例2自制氧化钛(专利号为200810202077.1)匀浆装入GELoader tip中,将10μL辣根过氧化物酶和α-酪蛋白酶解液混合物(摩尔比为1∶1;83pmol)上样,30μL浓度为50mM碳酸氢铵溶液洗三次,30μL含有体积浓度为0.5%甲酸的乙腈水溶液冲洗三次,其中乙腈水溶液中含有体积浓度的50%乙腈,最后用含有体积浓度为5%甲酸的乙腈水溶液10μL洗脱糖肽,其中乙腈水溶液中含有体积浓度的50%乙腈,收集洗脱液,经nanoESI-Q-Tof进样分析。再用30μL体积浓度为5%三氟乙酸溶液以及50mM碳酸氢铵冲洗萃取柱三次,最后用质量浓度10%氨水10μL洗脱磷酸化肽,洗脱液经甲酸中和脱盐后用于nanoESI-Q-Tof直接进样分析。
图3(a)显示为经氧化钛富集后氨水洗后所得到的磷酸化肽,图3(b)为经氧化钛富集后甲酸洗脱后所得到的糖肽,图3(c)为未经任何富集的辣根过氧化物酶和α-酪蛋白的酶解液混合物。对比谱图看出,大量的非修饰肽都被冲洗,从不同洗脱液中收集分别得到糖肽和磷酸化肽,实现了两种翻译后修饰肽的同时富集。
实施例5
与实施例1不同之处在于所用的金属氧化物为氧化锆。
实施例6
与实施例4不同在于所用的金属氧化物为氧化锆。
实施例7
与实施例1不同之处在于所用的金属氧化物为钛锆复合金属氧化物,氧锆钛的元素比例为61∶5∶34。
实施例8
与实施例4不同之处在于所用的金属氧化物为钛锆复合金属氧化物,氧锆钛的元素比例为61∶5∶34。
实施例9
与实施例1不同之处在于应用纳米氧化钛经离心沉淀操作如下:
1)取粒径约为500nm的氧化钛500μg,将已用氨水中和至中性的3.3μL(83.3pmol)辣根过氧化物酶酶解液混合,孵化60分钟,高速离心(15,000转/分钟),弃上层溶液,收集沉淀;
2)100μL浓度为50mM碳酸氢铵溶液、100μL体积浓度为0.1%甲酸水溶液、100μL体积浓度为0.5%甲酸乙腈水溶液,其中乙腈体积含量为50%,上述溶液分别与沉淀混合震荡30分钟,离心分离,弃上层溶液,收集沉淀,此过程重复3次。
3)将50μL体积浓度为5%甲酸乙腈水溶液,其中乙腈体积含量为50%的溶液,与沉淀混合震荡30分钟,离心分离,收集上清液即为糖肽;
实施例10
与实施例4不同之处在于应用纳米氧化钛经离心沉淀操作如下。
1)取粒径约为500nm的氧化钛500μg,将已用氨水中和至中性的10μL辣根过氧化物酶和α-酪蛋白酶解液混合物(摩尔比为1∶1;83pmol)混合,孵化60分钟,高速离心(20,000转/分钟),弃上层溶液,收集沉淀。
2)100μL浓度为50mM碳酸氢铵溶液、100μL体积浓度为0.5%甲酸乙腈水溶液,其中乙腈体积含量为50%,上述溶液分别与沉淀混合震荡30分钟,离心分离,弃上层溶液,收集沉淀,此过程重复3次。
3)将50μL体积浓度为5%甲酸乙腈水溶液,其中乙腈水溶液乙腈体积含量为50%,与沉淀混合震荡30分钟,离心分离,收集上清液即为糖肽;
4)将50μL 0.5-25wt%氨水与沉淀混合震荡30分钟,离心分离,收集上清液,弃去沉淀,上清液即为磷酸化肽。
Claims (3)
1.用金属氧化物同时富集糖肽和磷酸化肽的方法,其特征在于:以金属氧化物作为固相萃取材料,同时富集磷酸化肽和糖肽;所述富集的过程为柱萃取,具体操作如下:
1)将金属氧化物装入萃取柱管中,将pH为5-8蛋白酶解物上样到萃取柱中,蛋白酶解物与金属氧化物材料的重量比例为1∶1~200;
|2)分别用1~10倍柱体积的50mmol/L的碳酸氢铵溶液、1~10倍柱体积的含有体积浓度为0.5%甲酸的乙腈水溶液冲洗萃取柱,乙腈的体积浓度为50%;
3)采用1~10倍柱体积的含有体积浓度为5%甲酸的乙腈水溶液洗脱糖肽,乙腈的体积浓度为50%;
4)采用1~10倍的柱体积的0.5-25wt%氨水洗脱得到磷酸化肽。
2.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:所述金属氧化物为氧化钛、氧化锆、氧化铝中的一种或多种复合金属氧化物。
3.按照权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述金属氧化物材料形态为纳米材料、微球材料以及金属氧化物涂覆或包覆的球形或无定形材料。
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GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20130814 Termination date: 20161125 |