CN110156869A - 一种特异性分离富集内源性磷酸化肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种特异性分离富集内源性磷酸化肽的方法，具体步骤为：将磁性介孔双金属氧化物材料配置成分散液，和目标磷酸化肽段溶液混合加入上样缓冲液中，37℃下孵育30‑50分钟，用上样缓冲液洗涤材料，以0.4 M氨水作为洗脱缓冲液，将洗脱液点靶，进行质谱分析。本发明通过控制富集及洗脱条件实现对低丰度磷酸化肽的富集，结合MALDI‑TOF MS或者nano‑LC‑MS/MS能够实现同时大规模鉴定内源性磷酸化肽段，在翻译后修饰肽组学中具有广阔的应用前景。

Description

一种特异性分离富集内源性磷酸化肽的方法
技术领域
本发明属于新型磁性纳米介孔吸附材料的制备，具体涉及一种特异性分离富集内源性磷酸化肽的方法，尤其涉及一种基于双金属氧化物的磁性介孔纳米材料选择性富集提纯内源性磷酸化肽的方法。
背景技术
人类腮腺分泌的唾液是人体最复杂、最重要的体液之一，具有润滑口腔、帮助消化和抵抗感染等多种功能。因此，科学家认为唾液的变化，包括唾液中肽组学的变化，可以对多种疾病进行评估，如口干症、糖尿病和口腔癌。此外，通过分泌途径，内源性肽可以通过各种翻译后修饰进行加工，包括糖基化、硫酸化和磷酸化。可逆磷酸化可以调节细胞信号传导、分化和凋亡等多种生物学活性。因此，唾液内源性磷酸肽的研究在疾病生物标志物的发现中具有极为重要的前景。然而，在复杂的生物样品中，内源性磷酸肽的丰度低、电离效率差，给直接用质谱法分析内源性磷酸肽带来了很大的挑战。因此，探索高效、特异的内源性磷酸肽富集方法是必不可少的。
到目前为止，已经发展了从复杂生物样品中鉴定磷酸肽的多种富集策略，包括免疫沉淀法、离子交换色谱法（IEC）、金属氧化物亲和色谱法（MOAC）和固定化金属离子亲和色谱法（IMAC）。在这些策略中，由于金属氧化物和位于磷酸化肽上的磷酸基团的特殊相互作用，MOAC是最常用的策略之一。然而，这些金属氧化物（MOs）显示出对于单磷肽和多磷肽的不同倾向，导致磷酸化肽识别的不充分性。因此，发展产生了大量的双金属氧化物，提高了对磷酸化肽的富集效率，从而使磷酸化肽的分析更为全面。然而，如果没有合适的介孔，从含有高浓度蛋白质的复杂生物样品中富集内源性磷酸肽几乎不能实现。因此，有必要制备一种既具有多金属氧化物亲和位点又具有体积排斥能力的探针，以便于更有效的鉴定内源性磷酸肽。
发明内容
本发明的目的在于提出一种特异性分离富集内源性磷酸化肽的方法。制备的新型磁性介孔双金属氧化物纳米复合材料具有Zr-O和Ti-O双重亲和性、独特的介孔结构和优异的磁响应性。与单金属氧化物中心纳米复合材料相比，双金属氧化物纳米复合材料能更全面地识别单磷酸化肽和多磷酸化肽，具有较好的灵敏度。此外，新型磁性介孔双金属氧化物纳米复合物也成功地用于富集人唾液中的内源性磷酸肽，这表明其在肽组学研究和疾病诊断方面的巨大潜力。本发明目的在于提供一种磁性介孔双金属氧化物复合纳米材料的合成方法及其在内源性磷酸化肽段的富集纯化中的应用。
本发明提供一种特异性分离富集内源性磷酸化肽的方法，其富集分离的具体步骤如下：磁性介孔双金属氧化物材料与上样缓冲溶液混合配置成材料分散液，取10-20μL该材料分散液和目标磷酸化肽段溶液加入上样缓冲溶液中，在37℃下孵育30-60分钟，用上样缓冲溶液洗涤，用 0.4 M氨水作为洗脱缓冲液，将洗脱液点靶，进行质谱分析；
其中，磁性介孔双金属氧化物材料与上样缓冲溶液的质量体积比为：10g：1l；
上样缓冲液为含有体积比30%-60% 乙腈和体积比0.1% 三氟乙酸的缓冲溶液；
目标磷酸化肽段溶液为β-酪蛋白酶解液，材料分散液与目标磷酸化肽溶液体积比为：20：1-10000:1。
本发明中，磁性介孔双金属氧化物材料的合成步骤如下：
（1）将六水合三氯化铁溶解于乙二醇中，至溶液澄清透明后加入无水醋酸钠，经充分搅拌超声后转移至反应釜中，在100-450℃下加热10-20小时，反应完毕后待反应釜冷却至室温，用去离子水和无水乙醇充分洗涤所得产物，于40-75℃下真空干燥；
（2）将步骤（1）所得产物均匀分散于溶剂中，加入二氧化锆和二氧化钛前驱体，将所得混合溶液在室温下搅拌反应8-24小时，反应结束后用无水乙醇充分洗涤，所得产物，于40-75℃下真空干燥，接着将产物在500℃下煅烧1-2小时；
（3）将步骤（2）所得产物均匀分散于含有十六烷基三甲基溴化铵的溶剂中，超声分散，然后加入碱，滴加正硅酸四乙酯和乙醇混合溶液，在60℃下加热搅拌12小时，反应完毕冷却至室温，用水和无水乙醇充分洗涤所得产物，于40-75℃下真空干燥；
（4）将步骤（3）所得产物在空气中300-500℃下煅烧1-5小时；即得所需产品。
本发明中，步骤（2）中的溶剂为乙醇或乙醇/水混合溶液。
本发明中，步骤（3）中的碱为氢氧化钠、碳酸钠或氨水中的一种或几种。
本发明中，步骤（2）中二氧化钛前驱体为钛酸四异丙酯、钛酸正丁酯或钛酸四乙酯中的一种或几种，二氧化锆的前驱体为异丙醇锆。
本发明中，步骤（2）中步骤（1）所得产物与二氧化钛和二氧化锆前驱体的质量比为1:3-1:5。
本发明中，步骤（3）中溶剂为去离子水或乙醇/水混合溶液。
本发明所述的特异性分离富集内源性磷酸化肽的方法具有如下优点：
1.磁性介孔双金属氧化物纳米材料具有大比表面积，良好的磁响应性和双金属亲和力，与磷酸化肽具有强烈相互作用，可以更灵敏、更有选择性地分离富集内源性磷酸化肽；
2.磁性介孔双金属纳米材料的介孔结构有益于目标内源性磷酸化肽的捕获和大分子量蛋白质的排阻，使该材料在复杂的生物样品中显示出对内源性磷酸化肽良好的富集能力；
3. 磁性介孔双金属纳米材料应用于肽组学的翻译后修饰研究中，通过双金属氧化物亲和色谱法可以更全面，高灵敏度的富集纯化磷酸化肽翻译后修饰肽段，结合nano-LC MS/MS可以大规模鉴定唾液中的内源性磷酸化肽并确定其磷酸化位点。
附图说明
图1为实施例1合成的磁性介孔双金属材料的透射电子显微镜照片；
图2为实施例1合成的磁性介孔双金属材料的红外谱图；
图3为实施例1合成的磁性介孔双金属材料的氮气吸附等温线以及孔径分布图；
图4为实施例2的磁性介孔双金属材料对标准β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽分离富集的质谱图。其中：A为未经富集的β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的质谱图，B是磁性介孔二氧化锆材料富集的β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的质谱图，C是磁性介孔二氧化锆材料富集的β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的质谱图，D为本材料富集β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的质谱图；
图5为实施例3的磁性介孔双金属材料对标准磷酸化蛋白β-酪蛋白酶解液，BSA蛋白，α-酪蛋白混合液的分离富集质谱图。其中：A为未经富集的β-酪蛋白酶解液，BSA蛋白和α-酪蛋白质量比（1:50:50）的质谱图，B为β-酪蛋白酶解液，BSA蛋白和α-酪蛋白质量比（1:50:50）富集后的质谱图， C为β-酪蛋白酶解液，BSA蛋白和α-酪蛋白质量比（1:500:500）富集后的质谱图，D为β-酪蛋白酶解液，BSA蛋白和α-酪蛋白质量比（1:1000:1000）富集后的质谱图；
图6为实施例4的磁性介孔双金属氧化物材料对人唾液实际样品中内源性磷酸化肽富集的质谱图。其中：A为未经富集的质谱图，B为使用磁性介孔双金属氧化物材料富集的质谱图；
图7为实施例5的磁性介孔双金属氧化物材料富集β-酪蛋白混合酶解产物中磷酸化肽重复性的质谱图。其中：A为本材料第一次富集后磷酸化肽的质谱图，B为本材料第五次富集后磷酸化肽的质谱图。
具体实施方式
本发明利用磁性介孔双金属氧化物材料与磷酸化肽的相互作用来实现对翻译后修饰肽段的富集，以下介绍具体实施方式。
实施例1：磁性介孔双金属氧化物材料的合成
（1）将1.35 g FeCl3·6H2O在75 mL乙二醇中经磁力搅拌至固体完全溶解后，加入3.6g NaAc，再经充分搅拌和超声后转移至水热反应釜中，200℃下加热16个小时，待反应釜冷却后，用去离子水和乙醇分别洗涤产物三次，50℃下真空干燥；
（2）将0.5 ml钛酸正丁酯溶于50 mL乙醇中超声20 分钟，再加0.3 g的异丙醇锆超声30分钟，将步骤（1）所得产物0.1 g溶于上述溶液中再超声30 分钟，然后将水/乙醇（50 mL/10mL）的混合溶液滴加进去并搅拌，所得混合溶液在室温下反应8小时，得到产物用无水乙醇充分洗涤后放50℃下真空干燥，最后在500℃下煅烧1小时；
（3）将步骤（2）所得产物50 mg转移至含有500 mg 十六烷基三甲基溴化铵的50 ml去离子水的混合液中超声分散均匀后，加400 mL 水以及50 mL氢氧化钠溶液60℃下反应30分钟后，滴加2.5 mL(正硅酸四乙酯/乙醇=1/4)的溶液，60℃下反应12小时，得到的产物用水和无水乙醇分别洗涤三次后放50℃下真空干燥；
（4）将步骤（3）中所得产物在空气氛围中500℃煅烧1 小时，得到磁性介孔双金属氧化物纳米材料；
将制得的磁性介孔双金属氧化物材料用透射电子显微镜检测，检测条件是：200kV工作电压下，取少量干燥的材料均匀分散于无水乙醇中并用混合液将微栅网浸润，干燥后插入仪器抽真空，在100纳米比例尺下观察投射电子显微镜图。检测结果如图1所示。
图2为磁性介孔双金属氧化物材料的红外谱图；
图3为磁性介孔双金属氧化物材料的氮气吸附等温线以及孔径分布图。
实施例2：将实施例1得到的磁性介孔双金属氧化物材料作为固相吸附剂用于磷酸化β-酪蛋白酶解产物中磷酸化肽的分离富集：
（1）试样的制备：2 mg β-酪蛋白在50 mM NH4HCO3溶液中37℃酶解16 h；
（2）200 μg 磁性介孔双金属氧化物材料分散在100 μL含有100 fmol/μL步骤（1）的β-酪蛋白酶解产物的上样液中，37℃孵育30 min。用200 μL上样液冲洗样品三次。用10 μL0.4 M氨水洗脱30 min；
（3）质谱分析：取1 μL步骤（2）中洗脱液点靶，自然干燥后进行质谱分析，质谱图如图４所示。
分析结果：由图4可以看出，来自于磷酸化蛋白β-酪蛋白酶解产物的磷酸化肽被本材料所捕获，而在原液中非磷酸化肽造成的干扰被大幅去除，并且双金属氧化物中心的材料比单金属氧化物中心的材料富集到更多的单磷酸化肽和多磷酸肽。
实施例3：将实施例1得到的磁性介孔双金属氧化物材料作为固相吸附剂用于磷酸化蛋白β-酪蛋白酶解产物，BSA蛋白和α-酪蛋白的混合物中磷酸化肽的分离富集：
（1）试样的制备：2 mg β-酪蛋白在50 mM NH4HCO3溶液中37℃酶解16 h；
（2）200 μg 磁性介孔双金属氧化物材料分散在100 μL含有β-酪蛋白酶解液，BSA蛋白和α-酪蛋白质量比（1:50:50）的上样液中，37℃孵育30 min。用200 μL上样液冲洗样品三次。用10 μL 0.4 M氨水洗脱30 min；
（3）质谱分析：取1 μL步骤（2）中洗脱液点靶，自然干燥后进行质谱分析，质谱图如图5所示。
分析结果：由图5可以看出，在用磁性介孔双金属氧化物复合材料进行富集之前，可以明显地检测到蛋白质峰（图5Ａ中的插图），并检测到非磷酸肽，这可能归因于BSA和α-酪蛋白的严重信号干扰。然而，在用磁性介孔双金属氧化物复合材料处理后，一些高强度的磷酸化肽被识别出来，蛋白质信号消失。当质量比增加到1:500:500和1:1000:1000时，如图5Ｂ和图5Ｃ所示，仍然可以在没有任何蛋白质信号的情况下识别β-酪蛋白酶解液中的不同磷酸化肽。
实施例4：将实施例1得到的磁性介孔双金属氧化物材料作为固相吸附剂用于人唾液中内源性磷酸化肽的分离富集。
（1）200 μg磁性介孔双金属氧化物材料分散在100 μL含有10 μL人唾液的上样液中，37℃孵育30 min。用200 μL上样液冲洗样品三次。用10 μL 0.4 M氨水洗脱30 min；
（2）质谱分析：取1 μL步骤（1）中洗脱液点靶，自然干燥后进行质谱分析，质谱图如图6所示。
分析结果：由图6看出，在富集前，只有一个磷酸化肽被鉴定出，具有较低强度，并且非磷酸肽和大尺寸的蛋白质的干扰峰很高。然而，在磁性介孔双金属氧化物富集后，14个磷酸化肽（包括11个多磷酸肽和3个单磷酸肽）占据了大部分的谱图。
实施例5：将实施例1得到的磁性介孔双金属氧化物材料作为固相吸附剂用于富集磷酸化蛋白β-酪蛋白酶解产物中磷酸化肽的重复性实验中。
（1）200 μg 磁性介孔双金属氧化物材料分散在100 μL含有100 fmol/μL的β-酪蛋白酶解产物的上样液中，37℃孵育30 min。用200 μL上样液冲洗样品三次。用10 μL 0.4 M氨水洗脱30 min。重复以上步骤多次；
（2）质谱分析：取1 μL步骤（1）中洗脱液点靶，自然干燥后进行质谱分析，质谱图如图7所示。
分析结果：由图7可以看出，本材料在多次富集磷酸化肽后，磷酸化肽的数目及强度均没有明显降低，说明本材料对磷酸化肽的富集具有很好的重复性。
实施例6：磁性介孔双金属氧化物材料的合成
（1）将1.35 g FeCl3·6H2O在75 mL乙二醇中经磁力搅拌至固体完全溶解后，加入3.6g NaAc，再经充分搅拌和超声后转移至水热反应釜中，200℃下加热16个小时，待反应釜冷却后，用去离子水和乙醇分别洗涤产物三次，50℃下真空干燥；
（2）将0.5 ml钛酸正丁酯溶于50 mL乙醇中超声20 分钟，再加0.3 g的异丙醇锆超声30分钟，将（1）中所得产物0.1 g溶于上述溶液中再超声30 分钟，然后将水/乙醇（50 mL/10mL）的混合溶液滴加进去并搅拌，所得混合溶液在室温下反应8小时，得到产物用无水乙醇充分洗涤后放50℃下真空干燥，最后再500℃下煅烧1小时；
（3）将（2）中所得产物50 mg转移至含有500 mg 十六烷基三甲基溴化铵的50 ml去离子水的混合液中超声分散均匀后，加400 mL 水以及50 mL氢氧化钠溶液60℃下反应30分钟后，滴加2.5 mL(正硅酸四乙酯/乙醇=1/4)的溶液，60℃下反应12小时，得到的产物用水和无水乙醇分别洗涤三次后放50℃下真空干燥；
（4）将（3）中所得产物在空气氛围中500℃煅烧1 小时，得到磁性介孔双金属氧化物纳米材料。

Claims (7)

1.一种特异性分离富集内源性磷酸化肽的方法，其特征在于具体步骤如下：
磁性介孔双金属氧化物材料与上样缓冲溶液混合，配置成材料分散液，取10-20μL该材料分散液和目标磷酸化肽段溶液加入到上样缓冲溶液中，在37℃下孵育30-60分钟，用上样缓冲溶液洗涤，用 0.4 M氨水作为洗脱缓冲液，将洗脱液点靶，进行质谱分析；
其中，磁性介孔双金属氧化物材料与上样缓冲溶液的质量体积比为：10g：1L；
上样缓冲溶液为含有体积比30%-60%乙腈和体积比0.1%三氟乙酸的缓冲溶液；
目标磷酸化肽段溶液为β-酪蛋白酶解液，材料分散液与目标磷酸化肽溶液体积比为：20：1-10000:1。
2.根据权利要求1所述的一种特异性分离富集内源性磷酸化肽的方法，其特征在于，磁性介孔双金属氧化物材料的合成步骤如下：
（1）将六水合三氯化铁溶解于乙二醇中，至溶液澄清透明后加入无水醋酸钠，经充分搅拌超声后转移至反应釜中，在100-450℃下加热10-20小时，反应完毕后待反应釜冷却至室温，用去离子水和无水乙醇充分洗涤所得产物，于40-75℃下真空干燥；
（2）将步骤（1）所得产物均匀分散于溶剂中，加入二氧化锆和二氧化钛前驱体，将所得混合溶液在室温下搅拌反应8-24小时，反应结束后用无水乙醇充分洗涤，所得产物，于40-75℃下真空干燥，接着将产物在500℃下煅烧1-2小时；
（3）将步骤（2）所得产物均匀分散于含有十六烷基三甲基溴化铵的溶剂中，超声分散，然后加入碱，滴加正硅酸四乙酯和乙醇混合溶液，在60℃下加热搅拌12小时，反应完毕冷却至室温，用水和无水乙醇充分洗涤所得产物，于40-75℃下真空干燥；
（4）将步骤（3）所得产物在空气中300-500℃下煅烧1-5小时；即得所需产品。
3.根据权利要求2所述的一种特异性分离富集内源性磷酸化肽的方法，其特征在于步骤（2）中所述的溶剂为乙醇或乙醇/水混合溶液。
4.根据权利要求2所述的一种特异性分离富集内源性磷酸化肽的方法，其特征在于步骤（3）中所述的碱为氢氧化钠、碳酸钠或氨水中的一种或几种。
5.根据权利要求2所述的一种特异性分离富集内源性磷酸化肽的方法，其特征在于步骤（2）中所述二氧化钛前驱体为钛酸四异丙酯、钛酸正丁酯或钛酸四乙酯中的一种或几种，二氧化锆的前驱体为异丙醇锆。
6.根据权利要求2所述的一种特异性分离富集内源性磷酸化肽的方法，其特征在于步骤（2）中步骤（1）所得产物与二氧化钛和二氧化锆前驱体质量之和的质量比为1:3-1:5。
7.根据权利要求2所述的一种特异性分离富集内源性磷酸化肽的方法，其特征在于步骤（3）中溶剂为去离子水或乙醇/水混合溶液。
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