CN111690006A - 一种基于咪唑基离子液体材料及其制备方法及其用于磷酸化肽富集 - Google Patents
一种基于咪唑基离子液体材料及其制备方法及其用于磷酸化肽富集 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于咪唑基离子液体的离子液体材料，及该材料在含有磷酸化肽的样品中，富集磷酸化肽的应用。制备方法包括以下步骤：(1)制备含有机膦酸功能化的咪唑基离子液体；(2)将有机膦酸功能化的咪唑基离子液体修饰到基底材料上。本发明制备的功能化材料具有更好的亲水性、固定金属离子的能力、耐酸碱性和稳定性，具有良好的特异选择性，适合于复杂生物样品的磷酸化肽的富集纯化。该材料在生物医学领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于功能材料、生命科学领域，具体涉及一种基于咪唑基离子液体材料，同时本发明还涉及该材料的制备方法及其在富集磷酸化肽中的应用。
背景技术
自从1994年Williams和Wilkinsons首次提出蛋白质组学以来，开启了生命科学及相关学科领域发展的新阶段。蛋白质组学研究蛋白质的组成、物理化学性质、生物学性质；蛋白质之间相互作用；蛋白质的翻译后修饰等。为生物生理过程机制、寻找和确定生物标志物、疾病诊断和治疗及药物设计开发提供大量的信息。蛋白质磷酸化是生物体内普遍存在的、重要的翻译后修饰。蛋白质磷酸化涉及到代谢、转录、细胞信号传导和交流、增殖、降解多种生物过程。因此，分离鉴定磷酸化蛋白/多肽具有重要意义。然而，蛋白质磷酸化是一个动态可逆过程，磷酸化化学计量数低、样品中存在大量非磷酸化蛋白和多肽的干扰，导致直接检测的困难。蛋白质组学的发展，与现代分离分析技术的发展密不可分。其中，质谱技术应用于蛋白质组学研究越来越体现出其优越性。在样品分析前的磷酸化蛋白/多肽的高特异选择性、高效富集是关键性步骤。特异性富集可以降低样品的复杂性、获得良好的磷酸化多肽的检测灵敏度。从而获得正确的相关信息。
近些年来发展起来的金属离子固定化亲和色谱(immobilized metal ionaffinity chromatography,IMAC)、金属氧化物亲和色谱(metal oxide affinitychromatography,MOAC)技术用于富集，获得了广泛的关注。虽然某些MOAC的金属氧化物吸附材料有高的特异性吸附，但是因为位阻的原因，这类材料不能有效地吸附大体积的磷酸化肽。金属离子固定化亲和色谱(IMAC)材料因表面易于修饰和调控，因此，这类材料近些年来获得较快的发展。早期IMAC材料的制备时基于亚氨基二乙酸(IDA)以及次氮基三乙酸(NTA)作为螯合配体，通过羧基和氨基与金属Fe3+或Ga3+络合，中心离子再与磷酸化肽络合，完成富集。然而，这类早期富集材料最主要的不足在于对磷酸化肽的特异性富集不够强，酸性肽也同时被富集，导致目标磷酸化肽的信号受到极大的抑制(G.H.Han,M.L.Ye,H.F.Zou,Analyst 2008,133,1128-1138.)。要提高磷酸化肽的特异性富集，可以从富集材料结构改造及富集和脱附条件优化两个方面考虑。近年来通过改造用于固定中心金属离子的基底材料、基底材料表面改性、改变中心金属离子等方法，IMAC材料性能虽然有所改善，然而开发抗干扰性强、高特异性、高敏感性、具重复实用性的磷酸化肽富集材料仍然是本领域的研发重点。
发明内容
基于现有技术中所存在的问题，本发明引入一种新的亲水性配体—咪唑基有机膦功能化离子液体(ImPFIL)，将咪唑基有机膦酸基团修饰于基底材料的表面，制得一种功能性离子液体材料。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决。
本申请中的一种基于咪唑基离子液体材料，通过以下方法制备：(1)配体的合成：在甲苯溶液中依次加入咪唑和3-氯丙基三乙氧基硅烷(摩尔比为1：1)，N2氛下搅拌、加热；反应3h后，向其中加入二乙基(3-溴丙基)膦酸酯，继续反应24h，反应结束后用甲苯洗涤产物；(2)将基底材料分散于无水甲苯中，超声分散，向其中加入合成的配体，搅拌、加热，即可得到磷酸修饰的纳米材料，洗涤、烘干；(3)将得到的材料分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用NaOH溶液(pH＝10)洗涤至中性，烘干；(4)将步骤(3)得到的材料分散于Ti(SO4)2溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，也即离子液体材料。
本申请中的一种基于咪唑基离子液体材料的制备方法，包括以下步骤：(1)配体的合成：在甲苯溶液中依次加入咪唑和3-氯丙基三乙氧基硅烷(摩尔比为1：1)，N2氛下搅拌、加热；反应3h后，向其中加入二乙基(3-溴丙基)膦酸酯，继续反应24h，反应结束后用甲苯洗涤产物；(2)将基底材料分散于无水甲苯中，超声分散，向其中加入合成的配体，搅拌、加热，即可得到磷酸修饰的纳米材料，洗涤、烘干；(3)将得到的材料分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用NaOH溶液(pH＝10)洗涤至中性，烘干；(4)将步骤(3)得到的材料分散于Ti(SO4)2溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，也即离子液体材料。
进一步的，所述步骤(1)中，反应的温度为110℃。
进一步的，所述步骤(2)中，反应的温度为110℃，反应时间为24h。
进一步的，所述步骤(1)和(2)中洗涤液均为乙醇。
本申请中还涉及离子液体材料在富集磷酸化肽中的应用：将上述离子液体材料用于富集磷酸化肽。
本发明的原理如下：本发明首先合成含有磷酸基团的配体—3-(3-(二乙基膦酸酯)丙基)-1-(3-(三乙氧基硅烷)丙基)咪唑基溴化盐，然后将合成的配体修饰于基底材料表面，得到有机膦酸基团修饰的纳米材料；在酸化处理后，继而在材料表面的有机酸基团上固载Ti(Ⅳ)离子，得到固定金属离子亲和材料A-ImPFIL-Ti4+。
本发明通过改变基底材料A，分别选择纳米二氧化硅和石墨烯表面包覆介孔二氧化硅，制备了两种不同基底材料的IMAC吸附剂，即A-ImPFIL-Ti4+(A＝nSiO2或G@mSiO2)。
本发明具有以下优点和优异特性：(1)本发明的修饰方法简单，易于操作，并且不会破坏基底材料的基本形貌特征，同时，合成的材料具有良好的稳定性，增加了该材料的实用性。(2)本发明中所合成的固定金属离子亲和材料—A-ImPFIL-Ti4+作为IMAC型吸附剂，可利用金属离子和磷酸化肽中磷酸基团间的亲和性，用于磷酸化肽的特异选择性富集，并且成功地将合成的材料用于标准肽、多肽混合液以及人类唾液样品中磷酸化肽的富集。
附图说明
图1为A-ImPFIL-Ti4+(以nSiO2-ImPFIL-Ti4+为例)的制备流程图。类似地，以G@mSiO2为起始基底材料，可制备得到G@mSiO2-ImPFIL-Ti4+富集材料。
图2为β-酪蛋白酶解液的质谱图；其中，图2a为β-酪蛋白酶解液的直接检测图；图2b为β-酪蛋白酶解液经过nSiO2-ImPFIL-Ti4+处理后的质谱图；图2c为β-酪蛋白酶解液经过G@mSiO2-ImPFIL-Ti4+处理后的质谱图；磷酸化肽信号用*表示，去磷酸残基则用#表示。
图3为β-酪蛋白和牛血清蛋白BSA的酶解混合液(摩尔比为1：1000)的质谱图；其中，图3a为nSiO2-ImPFIL-Ti4+处理后的质谱图；图3b为G@mSiO2-ImPFIL-Ti4+处理后的质谱图；磷酸化肽信号用*表示，去磷酸残基则用#表示。
图4为β-酪蛋白(1.43pmol)和牛血清蛋白BSA的酶解混合液(摩尔比为1：12000)在G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后的质谱图，磷酸化肽信号用*表示，去磷酸残基则用#表示。
图5为唾液质谱图；其中，图5a为nSiO2-ImPFIL-Ti4+处理后的质谱图；图5b为G@mSiO2-ImPFIL-Ti4+处理后的质谱图；磷酸化肽信号用*表示。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
以下实施方式中，自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的原件或具有相同或类似功能的原件，以下通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例一：其中的A＝nSiO2。
实施例二：其中的A＝G@mSiO2。
以上两种实施方式中，区别在于基底材料A的不同，制备方法相同：首先制备含有磷酸基团的配体，再利用合成的配体修饰于基底材料的表面，得到有机膦酸基团修饰的纳米材料A-ImPFIL；酸化处理后，再在有机膦酸基团上固载金属离子，得到固定金属离子亲和材料A-ImPFIL-Ti4+，也就是本申请中的离子液体材料。
具体的制备方法如下。
(1)配体的合成，其合成方法如下：在40mL无水甲苯中依次加入2.7g咪唑、4.5g 3-氯丙基三乙氧基硅烷，通入N2一分钟后，搅拌、加热至110℃，反应3h后，向其中加入5g二乙基(3-溴丙基)膦酸酯，继续反应24h。反应结束后，移除上层液体，用无水甲苯洗涤下层产物3次，除去多余的甲苯，待用。
(2)A-ImPFIL的制备：称取200mg的基底材料于30mL无水甲苯中，超声分散，向其中加入1.5g合成的配体，油浴加热至110℃，反应24h。反应结束后，离心分离固体，并用乙醇多次洗涤，烘干。
(3)A-ImPFIL的酸化处理：将得到的A-ImPFIL分散于5mL的氢溴酸中，在120℃的油浴中搅拌2h。反应结束后，离心分离固体，用氢氧化钠溶液(pH＝10)洗涤至中性，再用去离子水洗涤几次去除残余的氢氧化钠和钠盐。
(4)A-ImPFIL-Ti4+的制备：将经过酸处理后的A-ImPFIL分散于30mL 0.1M Ti(SO4)2溶液中，室温下震荡2h，离心分离固体后，依次用去离子水和乙醇洗涤，85℃烘干，得到的固体即是A-ImPFIL-Ti4+。
实验测试及对附图的说明如下。
(1)为了考察基于不同基底的纳米材料在修饰钛离子(A-ImPFIL-Ti4+)后对磷酸化肽的富集效果，从而确定不同基底材料对磷酸化肽富集效果的影响，我们比较了两种A-ImPFIL-Ti4+(A＝nSiO2或G@mSiO2)吸附剂对标准蛋白β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的富集效果。
将5mgβ-酪蛋白溶解于1mL 25mM碳酸氢氨缓冲溶液(pH＝8)中；向混合溶液中加入胰蛋白酶(胰蛋白酶与底物的质量比为1：50)，在37℃条件下反应12h。酶解后的产物存放于-20℃的冰箱中待用。
为了比较基于不同基底的吸附剂A-ImPFIL-Ti4+(A＝nSiO2或G@mSiO2)对磷酸化肽的富集效果，我们首先选择标准蛋白β-酪蛋白作为富集的样品。
分别称取5mg两种不同基底的吸附剂于1mL的富集缓冲液(50％ACN，0.1％TFA，v/v)中，超声分散后，取出100μL的分散液用于富集实验，向分散液中加入1μL的标准肽酶解液(200fmol/μL)。然后，将混合液体系置于恒温金属浴中，在37℃条件下震荡30min，离心分离固体并用富集缓冲液洗涤固体材料三次。最后，用10μL 0.4M的氨水分散洗涤后的固体材料，在37℃条件下震荡15min，离心后取上清液5μL，与5μL基质溶液(饱和DHB溶液，包含50％ACN和0.1％TFA)混合后，取1μL的混合液滴于MALDI的靶板上，在空气中干燥后进行MALDI-TOF MS分析。
质谱检测结果如图2所示，图2a为样品不经过处理，直接进行质谱分析的结果，在图中非磷酸化肽的信号占主导地位，没有磷酸化肽的信号；图2b为样品经过nSiO2-ImPFIL-Ti4+处理后的结果，可以观察到3个磷酸化肽的信号以及所对应的3个去磷酸残基信号，但谱图的背景较为复杂且存在非磷酸化肽的信号；图2c为样品经过G@mSiO2-ImPFIL-Ti4+处理后的结果，检测到4个磷酸化肽信号，结果表明G@mSiO2-ImPFIL-Ti4+对磷酸化肽的特异性富集优于nSiO2-ImPFIL-Ti4+，其原因可能是基底G@mSiO2比表面积较大，可以固载更多的金属离子，有利于磷酸化肽的富集。
(2)为了进一步评估基于不同基底的材料A-ImPFIL-Ti4+(A＝nSiO2或G@mSiO2)在复杂的环境中对磷酸化肽的选择性富集能力，将磷酸化蛋白β-酪蛋白和非磷酸化蛋白牛血清蛋白BSA的酶解混合液作为富集的样品(β-酪蛋白与BSA的摩尔比为1：1000)。
1mg牛血清蛋白溶解在0.1mL 50mM碳酸氢氨变性缓冲液中(包含8M尿素)，变性后加入0.2mL 0.1M二硫苏糖醇(DTT)溶液，并在37℃条件下反应30min，还原蛋白质中的二硫键，然后再加入0.2mL 0.2M碘乙酰胺(IAA)溶液，于室温条件下避光反应30min，使还原的巯基烷基化；将上述产物用50mM碳酸氢氨缓冲溶液(pH＝8.3)稀释至1mL；向混合溶液中加入胰蛋白酶(胰蛋白酶与底物的质量比为1：50)，在37℃条件下反应16h。酶解后的产物存放于-20℃的冰箱中待用。
分别称取5mg两种基于不同基底的吸附剂于1mL的富集缓冲液(50％ACN，0.1％TFA，v/v)中，超声分散后，取出100μL的分散液用于富集实验，向分散液中加入1μLβ-酪蛋白与BSA的酶解混合液。然后，将混合液体系置于恒温金属浴中，在37℃条件下震荡30min，离心分离固体并用富集缓冲液洗涤固体材料三次。最后，用10μL 0.4M的氨水分散洗涤后的固体材料，在37℃条件下震荡15min，离心后取上清液5μL，与5μL基质溶液(饱和DHB溶液，包含50％ACN和0.1％TFA)混合后，取1μL的混合液滴于MALDI的靶板上，在空气中干燥后进行MALDI-TOF MS分析。
检测结果如图3所示，肽混合液样品在经过nSiO2-ImPFIL-Ti4+和G@mSiO2-ImPFIL-Ti4+处理后，分别可以检测到2个和3个磷酸化肽信号，但从nSiO2-ImPFIL-Ti4+检测的结果(图3a)可以明显地看到非磷酸化肽信号以及较高的基线，所以G@mSiO2-ImPFIL-Ti4+在处理复杂的实际的样品时具有明显的优势，这可能是由于介孔结构的体积排阻效应，可以有效地阻止大分子量的非磷酸化肽的富集。
(3)为了进一步评估G@mSiO2-ImPFIL-Ti4+纳米材料性能的优越性，我们进一步提高β-酪蛋白和牛血清蛋白BSA酶解混合液中BSA酶解液的摩尔比，提高至1：12000，作为选择性富集磷酸化肽的样品。
称取5mg G@mSiO2-ImPFIL-Ti4+于1mL的富集缓冲液(50％ACN，0.1％TFA，v/v)中，超声分散后，取出100μL的分散液用于富集实验，向分散液中加入120μL的蛋白酶解混合液(其中，β-酪蛋白含量为1.43pmol)。然后，将混合液置于恒温金属浴中，在37℃条件下震荡30min，离心分离固体并用富集缓冲液洗涤固体材料三次。最后，用10μL 0.4M的氨水分散洗涤后的固体材料，在37℃条件下震荡15min，离心后取上清液5μL，与5μL基质溶液(饱和DHB溶液，包含50％ACN和0.1％TFA)混合后，取1μL的混合液滴于MALDI的靶板上，在空气中干燥后进行MALDI-TOF MS分析。
质谱检测结果如图4所示，多肽混合液样品经G@mSiO2-ImPFIL-Ti4+处理后，可以检测到4个磷酸化肽信号以及对应的去磷酸残基信号峰，且磷酸化肽信号主导整个质谱图，其信号相对强度较大，所以G@mSiO2-ImPFIL-Ti4+可以在复杂的环境中富集磷酸化肽，具有良好的选择性和特异性。
(4)基于不同基底的富集材料A-ImPFIL-Ti4+(A＝nSiO2或G@mSiO2)对唾液中内源性磷酸化肽的富集采集到的正常人的唾液保存在-20℃的冰箱中。
分别称取5mg两种基于不同基底的吸附剂于1mL的富集缓冲液(50％ACN，0.1％TFA，v/v)中，超声分散后，取出100μL的分散液用于富集实验，向分散液中加入20μL唾液样品。然后，将混合液体系置于恒温金属浴中，在37℃条件下震荡30min，离心分离固体并用富集缓冲液洗涤固体材料三次。最后，用10μL 0.4M的氨水分散洗涤后的固体材料，在37℃条件下震荡15min，离心后取上清液5μL，与5μL基质溶液(饱和DHB溶液，包含50％ACN和0.1％TFA)混合后，取1μL的混合液滴于MALDI的靶板上，在空气中干燥后进行MALDI-TOF MS分析。
质谱检测结果如图5所示，唾液在经过材料nSiO2-ImPFIL-Ti4+和G@mSiO2-ImPFIL-Ti4+处理后，分别可以检测到的磷酸化肽的信号个数为15和18，同时，在检测的谱图中几乎看不到其他杂峰的信号，且磷酸化肽的信号强度很高，表明该类配体材料适合于实际生物样品中磷酸化肽的特异选择性性富集。
本发明的保护范围包括但不限于以上实施方式，本发明的保护范围以权利要求书为准，任何对本技术做出的本领域的技术人员容易想到的替换、变形、改进均落入本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种基于咪唑基离子液体材料，其特征在于，通过以下方法制备：
(1)配体的合成：在甲苯溶液中依次加入咪唑和3-氯丙基三乙氧基硅烷(摩尔比为1：1)，N2氛下搅拌、加热；反应3h后，向其中加入二乙基(3-溴丙基)膦酸酯，继续反应24h，反应结束后用甲苯洗涤产物；
(2)将基底材料分散于无水甲苯中，超声分散，向其中加入合成的配体，搅拌、加热，即可得到磷酸修饰的纳米材料，洗涤、烘干；
(3)将得到的材料分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用NaOH溶液(pH＝10)洗涤至中性，烘干；
(4)将步骤(3)得到的材料分散于Ti(SO4)2溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，也即离子液体材料。
2.一种基于咪唑基离子液体材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配体的合成：在甲苯溶液中依次加入咪唑和3-氯丙基三乙氧基硅烷(摩尔比为1：1)，N2氛下搅拌、加热；反应3h后，向其中加入二乙基(3-溴丙基)膦酸酯，继续反应24h，反应结束后用甲苯洗涤产物；
(2)将基底材料分散于无水甲苯中，超声分散，向其中加入合成的配体，搅拌、加热，即可得到磷酸修饰的纳米材料，洗涤、烘干；
(3)将得到的材料分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用NaOH溶液(pH＝10)洗涤至中性，烘干；
(4)将步骤(3)得到的材料分散于Ti(SO4)2溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，也即离子液体材料。
3.根据权利要求2所述的一种基于咪唑基离子液体材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，反应的温度为110℃。
4.根据权利要求2所述的一种基于咪唑基离子液体材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反应的温度为110℃，反应时间为24h。
5.根据权利要求2所述的一种基于咪唑基离子液体材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和(2)中洗涤液均为乙醇。
6.离子液体材料在富集磷酸化肽中的应用，其特征在于，将权利要求1中的离子液体材料用于富集磷酸化肽。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114272915A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-04-05 | 宁波大学 | 膦基离子液体修饰纳米复合材料及其制备方法及其在富集磷酸化肽中的应用 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101396650A (zh) * | 2007-09-26 | 2009-04-01 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种固定钛离子亲和色谱材料及其制备和应用 |
| CN103396550A (zh) * | 2013-07-08 | 2013-11-20 | 上海师范大学 | 一种咪唑功能化的两亲有序介孔有机硅材料的制备方法 |
| CN104519917A (zh) * | 2012-08-23 | 2015-04-15 | 通用电气公司 | 用于诊断成像的纳米微粒组合物 |
| CN105175588A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-12-23 | 天津科技大学 | 一种用于磷酸肽富集的聚胍基离子液体材料的制备方法 |
| WO2016161407A1 (en) * | 2015-04-02 | 2016-10-06 | University Of Southern California | Fluorescent bisphosphonate analogs |
| CN106925241A (zh) * | 2017-03-31 | 2017-07-07 | 武汉大学 | 一种利用5‑磷酸吡哆醛制备固定金属亲合材料的方法 |
| CN110156869A (zh) * | 2019-04-11 | 2019-08-23 | 复旦大学 | 一种特异性分离富集内源性磷酸化肽的方法 |
| CN111203189A (zh) * | 2020-01-22 | 2020-05-29 | 河南工业大学 | 一种pH响应的羧基功能化聚合离子液体修饰的磁性材料、制备方法及其应用 |
-
2020
- 2020-06-22 CN CN202010575354.4A patent/CN111690006B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101396650A (zh) * | 2007-09-26 | 2009-04-01 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种固定钛离子亲和色谱材料及其制备和应用 |
| CN104519917A (zh) * | 2012-08-23 | 2015-04-15 | 通用电气公司 | 用于诊断成像的纳米微粒组合物 |
| CN103396550A (zh) * | 2013-07-08 | 2013-11-20 | 上海师范大学 | 一种咪唑功能化的两亲有序介孔有机硅材料的制备方法 |
| WO2016161407A1 (en) * | 2015-04-02 | 2016-10-06 | University Of Southern California | Fluorescent bisphosphonate analogs |
| CN105175588A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-12-23 | 天津科技大学 | 一种用于磷酸肽富集的聚胍基离子液体材料的制备方法 |
| CN106925241A (zh) * | 2017-03-31 | 2017-07-07 | 武汉大学 | 一种利用5‑磷酸吡哆醛制备固定金属亲合材料的方法 |
| CN110156869A (zh) * | 2019-04-11 | 2019-08-23 | 复旦大学 | 一种特异性分离富集内源性磷酸化肽的方法 |
| CN111203189A (zh) * | 2020-01-22 | 2020-05-29 | 河南工业大学 | 一种pH响应的羧基功能化聚合离子液体修饰的磁性材料、制备方法及其应用 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114272915A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-04-05 | 宁波大学 | 膦基离子液体修饰纳米复合材料及其制备方法及其在富集磷酸化肽中的应用 |
| CN114272915B (zh) * | 2021-11-30 | 2023-04-25 | 宁波大学 | 膦基离子液体修饰纳米复合材料及其制备方法及其在富集磷酸化肽中的应用 |
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| Publication number | Publication date |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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