CN105277398A - 一种特殊糖肽富集和鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生化分析领域，涉及一种特殊糖肽富集和鉴定的方法。利用反应试剂与这类特殊糖肽(其糖基化的天冬氨酸位于糖肽的N末端)的N末端的氨基反应形成酰胺键，从而使该糖肽能够被常用的糖苷酶(PNGase？F)识别并释放其糖链，进而通过质谱分析获得鉴定。该方法操作简单，省时，高效。通过该方法，可以将天冬氨酸末端的糖肽的鉴定数目提高一倍以上，是对传统糖肽鉴定结果的一个较大补充。
Description
技术领域
本发明涉及生化分析领域，具体的说，是一种通过化学标记，实现一类特殊糖肽的富集和鉴定。
背景技术
蛋白的糖基化修饰是生物体内最常见、最重要的一种翻译后修饰，与细胞粘附、蛋白折叠、信号传导和免疫应答等众多生物学过程密切相关。近些年来，在大规模的糖蛋白质组学的研究中，高效的糖蛋白/糖肽富集技术结合多维色谱分离技术以及高分辨的质谱的应用，极大的增强了糖组学的动态范围和检测限，越来越多的糖基化位点和糖蛋白能够被检测。然而，原始糖肽(包含糖链)的大规模鉴定仍然是一个挑战。因此，目前基于质谱的糖蛋白组学研究通常要先对糖蛋白/糖肽进行去糖基化的处理。
由于酶促去糖基化的高特异性和高选择性。近些年来，人们发现并发展了一批具有较强特异性的去糖基化酶，如PNGaseA、PNGaseF、EndoF和EndoH等(R.A.O'Neill,JournalofChromatographyA,1996,720,201)。其中PNGaseF由于其较强的去糖基化活性和普适性，在糖蛋白组学中得以广泛使用(D.F.Zielinska,F.Gnad,J.R.andM.Mann,Cell,2010,141,897)。早期的一些文献曾报道PNGaseF对于糖基化的天冬氨酸位于肽段N-或C-末端的糖肽具有较差的去糖基化活性(J.-Q.FanandY.C.Lee,JournalofBiologicalChemistry,1997,272,27058；T.PlummerandA.Tarentino,JournalofBiologicalChemistry,1981,256,10243)。然而，PNGaseF的这种歧视效应在当前的研究中却被广泛忽视。
基于该现象，我们提出了一种对这种特殊的糖肽的N端进行选择性标记的方法。通过标记，使PNGaseF能够识别被选择性标记的这种特殊糖肽，从而释放其糖链。在后续的质谱分析中，添加相关标记的可变修饰，即可获得鉴定。
发明内容
本发明为了克服PNGaseF对这种特殊糖肽的歧视效应，通过对这种特殊糖肽进行N端选择性标记形成酰胺键，从而使这种糖肽能够被PNGaseF识别，从而顺利的释放糖链，通过质谱分析并得到鉴定。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
首先利用蛋白酶对蛋白进行酶解得到肽段混合物，然后通过糖肽富集技术对肽段混合物进行富集得到糖肽，并对糖肽进行充分的酶促去糖基化。随后再次利用糖肽富集技术获得上述样品中未被去糖基化的糖肽，并对其氨基端进行化学标记，形成新的酰胺键，并重新进行酶促去糖基化，从而在质谱上获得鉴定。
所述的酶解、富集、标记和去糖基化详细说明如下：
(1)酶解：将蛋白进行变性还原烷基化后，利用蛋白酶，如胰蛋白酶(trypsin)、丝氨酸蛋白酶(lys-c)和蛋白内切酶(glu-c)，37℃条件下对蛋白进行酶解1-24h；
(2)富集：糖肽富集技术包含亲水作用色谱法、酰肼化学法或凝集素富集法等能从肽段混合物中富集得到糖肽的技术；
(3)标记：用一种标记试剂对特殊糖肽的N端进行标记，其中标记试剂为：可与N端α氨基形成酰胺键的酸酐类(如乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐)、羧基活化类(如N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶)、氨基酸类(如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)中的一种试剂；
(4)去糖基化条件：在合适的条件下(pH7.5-8.5)，加入一定量糖苷酶(如PNGaseF)，37℃下孵育1-12h。
与传统糖肽富集相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明操作简单，只需要额外进行一步标记和去糖基化即可获得对特殊糖肽的鉴定；
(2)本发明可以克服糖苷酶(如PNGaseF)对于糖链位于肽段氨基末端这类糖肽的歧视效应，顺利切除其糖链；
(3)本发明鉴定到的特殊糖肽对于传统方法是一个较大的补充。
附图说明
图1为本发明的原理图；
图2为利用传统方法对核糖核酸酶B的糖肽进行去糖基化的产物；
图3为利用特殊方法对核糖核酸酶B的糖肽进行标记后再去糖基化的产物；
图4为策略A和B鉴定到的各类糖肽占总糖肽的比例；
具体实施方式
以下提供本发明一种富集和鉴定特殊糖肽的具体实施方式。
实施例1
标准糖蛋白核糖核酸酶B(RNaseB)中特殊糖肽(糖基化的天冬氨酸位于糖肽的N末端)的富集和鉴定。
首先利用胰蛋白酶对RNaseB进行酶解，得到RNaseB的酶解产物。然后利用亲水相互作用色谱柱对一份RNaseB的酶解产物进行糖肽的富集，然后加入PNGaseF进行去糖基化处理，对产物进行MALDI-TOF分析，见图2。利用亲水相互作用色谱柱对另一份RNaseB的酶解产物进行糖肽的富集，然后对糖肽的N端进行丁二酸酐的标记。接着重新加入PNGaseF进行去糖基化，得到标记的去糖基化的肽段，最后进行MALDI-TOF的分析鉴定，见图3。
亲水相互作用色谱柱(ClickmaltoseHILIC)：300μmi.d.×5cm；
富集条件：上样条件为ACN-H2O-三氟乙酸(TFA)＝80-20-0.1；洗脱条件为ACN-H2O-TFA＝50-50-0.1；
去糖基化条件：去糖基化缓冲液为50mM的pH＝8.5的NH4HCO3；PNGaseF的加入量按照1mg肽段对应500units的比例加入，37摄氏度反应12h；
标记条件：20mM丁二酸酐的磷酸缓冲液(50mM,pH7.5)，标记时间为5min。
由图2所示，质荷比为1033.6的峰为肽段SRN#60LTKDR去糖基化后的肽段，而质荷比为2005.4的峰及后面4个的质荷比相差162的峰为肽段N#60LTKDR所代表的糖肽，每个产物相差一个甘露糖(162Da)。说明肽段SRN#60LTKDR的糖链能够被PNGaseF进行去糖基化，而肽段N#60LTKDR上的糖链却不能被去糖基化。
由图3所示，质荷比为890.6的峰为肽段N端标记了一个丁二酸酐(100Da)的去糖基化的肽段N#60LTKDR；质荷比为1133.6的峰为肽段N端标记了一个丁二酸酐(100Da)的去糖基化的肽段SRN#60LTKDR。说明前者经过丁二酸酐的标记，能够被PNGaseF识别从而释放糖链，而在图2中由于未被标记无法释放糖链，说明N端丁二酸酐标记对于该类糖肽糖链的释放十分必要。
实施例2
海拉细胞蛋白酶解产物中特殊糖肽的富集和鉴定。
将海拉细胞的胰蛋白酶酶解产物通过亲水相互作用色谱柱进行糖肽的富集，然后加入PNGaseF在合适的条件下进行去糖基化。将去糖基化的产物分为等量的两份。一份直接进行质谱分析，即传统的策略A。另一份重新通过亲水相互作用色谱对未糖基化的糖肽进行二次富集，然后加入适量的丁二酸酐进行N端标记，最后加入PNGaseF进行去糖基化及后续的质谱分析，即策略B。并将两次质谱分析的结果(A和B)加以比较，见图4。亲水相互作用色谱柱、富集、去糖基化和标记条件如实施例1所述。
如图4，策略A中一共鉴定到1135条糖肽，而糖基化的天冬酰胺位于肽段首位的糖肽只有47条，占所有糖肽的4.1％。其他位置(从肽段N末端开始为0，即N端)如位置1-5的糖肽比例约10％左右。策略B中，位于0号位糖肽有73条，占策略B中糖肽的75.2％(73/97)，即超过四分之三的糖肽为该特殊类型的糖肽，而在策略A中，其含量只占4.1％。说明绝大多数的该特殊糖肽在策略A中未被鉴定到，归因于传统方法中这类糖肽未能被有效去糖基化。而在策略B中，通过对这类糖肽的有效富集，并通过N端丁二酸酐标记，从而获得充分的去糖基化并得到鉴定。此外，通过对数据分析发现，策略B中获得鉴定的这类特殊糖肽都带上了N端的丁二酸酐的标记，标记效率为100％，充分说明这类糖肽是因为被标记才得以被PNGaseF识别，从而在酶的作用下发生有效的去糖基化。策略B在鉴定这类特殊糖肽方面，在数量和选择性上都大大优于传统方法，通过合并策略A和B的结果，能将这类特殊糖肽占所有糖肽的比重从原来的4.1％左右提升到8.3％，说明该方法是对传统糖肽鉴定方法的一个较大补充。
Claims (9)
1.一种富集和鉴定特殊糖肽的方法，其特征在于：
1)首先通过糖肽富集技术从蛋白的酶解产物中得到糖肽；
2)然后利用标记试剂与糖肽的N端进行反应，待反应完成后，除去标记试剂，加入糖苷酶进行充分去糖基化，最后对其进行质谱鉴定。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：糖肽富集技术是亲水作用色谱法、酰肼化学法或凝集素富集法中的一种或二种以上。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：酶解产物是胰蛋白酶(trypsin)、丝氨酸蛋白酶(lys-c)或蛋白内切酶(glu-c)中的一种或二种以上对蛋白进行酶解后的产物。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：糖苷酶是肽N-糖苷酶A(PNGaseA)和肽N-糖苷酶F(PNGaseF)中的一种或二种。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：标记试剂是与α氨基发生高选择性反应同时生成酰胺键的试剂。
6.按照权利要求5所述的能与α氨基发生高选择性反应同时生成酰胺键的试剂包括：酸酐类试剂(如乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐)、羧基活化类试剂(如N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶)以及氨基酸类试剂(如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的质谱可以是飞行时间类质谱或离子阱类质谱中的一种或二种。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述糖肽的糖基化的天冬氨酸位于糖肽N末端。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)为了提高质谱检测的灵敏度，首先通过糖肽富集技术从蛋白的酶解产物中得到糖肽，然后利用糖苷酶对糖肽进行充分的去糖基化，再利用糖肽富集技术获得未被去糖基化的糖肽。
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