CN102059091A - 一种表面包覆金属氧化物的介孔氧化硅及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及磷酸化肽的分离富集，具体地说是一种表面包覆金属氧化物的介孔氧化硅及制备和在分离富集磷酸化肽中的应用。表面包覆氧化物的介孔材料对于磷酸化肽具有很好的选择性富集性能，和常规的金属氧化物相比，表面包覆氧化物的介孔材料富集磷酸化肽具有更高的灵敏度，更高的选择性，更高的特异性和更大的吸附容量。利用表面包覆氧化物的介孔材料对于磷酸化肽的高效的特异性吸附能力，可以将其应用于复杂体系中磷酸化肽的选择性分离富集，结合质谱，该材料在翻译后修饰蛋白质组学研究等领域具有广阔的应用前景。

Description

一种表面包覆金属氧化物的介孔氧化硅及其制备和应用

技术领域

本发明涉及磷酸化肽的分离富集，具体地说是一种表面包覆金属氧化物的介孔氧化硅及制备和在分离富集磷酸化肽中的应用。

背景技术

蛋白质的磷酸化在细胞生命活动中发挥着重要的调控和信号传导作用，因此研究复杂混合物样品中的磷酸化蛋白对于揭示生命过程的调节机制是非常有意义的。生物质谱是解析磷酸化肽段结构的有利手段，但是质谱在鉴定磷酸化蛋白方面仍然存在着巨大的挑战，具体表现在：第一，磷酸化蛋白在细胞中属于低丰度蛋白；第二，磷酸化肽段的的负电性使其在质谱检测中难以质子化；第三，酶解产物中存在的大量非磷酸化肽段的质谱信号通常会淹没磷酸化肽的离子信号。因此，在质谱分析检测前对磷酸化肽进行选择性富集是十分必要的[Kokubu，M.，Ishihama，Y，Sato，T.，Nagasu，T.et al.，Anal.Chem.2005，77，5144]。目前，固定化金属亲和色谱(IMAC(Fe³⁺，Ga³⁺，Zr⁴⁺))和金属氧化物是最常用的磷酸化肽的分离富集技术。其中IMAC是目前使用最广泛最传统的富集方法，但是由于其对酸性磷酸化肽的非特异性吸附和对多磷酸化肽的强吸附导致了其操作的复杂性。近年来，利用TiO₂、ZrO₂、Al₂O₃、Al(OH)₃和SnO₂等[Larsen，M.R.，Thingholm，T.E.，Jensen，O.N.，Roepstorff，P.et al.，Mol.Cell.Proteomics2005，4，873；Kweon，H.K.，

K.，Anal.Chem.2006，78，1743；Wolschin，F.，Wienkoop，S.，Weckwerth，W.，Proteomics 2005，5，4389；CHENC.T.，CHEN Y.C.J.，Mass Spectrom.2008，43，538；Sturm M，Leitner A，

J.H，Lindén M，Lindner W.，Adv.Funct.Mater.2008，18，2381.]金属氧化物富集和纯化磷酸化肽开始受到人们的广泛关注。

自从1992年Mobil公司的科学家合成出有序介孔氧化硅材料MCM-41以来[Kresge C.T.，Leonowicz M.E.，Roth W.J.，Vartuli J.C.，Beck J.S.，Nature 1992，359，710]，介孔氧化硅材料因其具有结构规整、孔径分布单一而且在一定范围内可调、很高的比表面积和孔容等特点，在催化、吸附、大分子分离、生物传感器、微电子、光学、磁学以及新型纳米材料的制备等领域展示了广阔的应用前景[Lin H.P.，Mou C.Y.，Acc.Chem.Res.2002，35，927]。制备金属氧化物包覆的介孔氧化硅材料，可以将介孔氧化硅的有序结构和大的比表面积与金属氧化物对于磷酸化肽段的选择性结合起来，实现混合物中磷酸化肽段的快速高效富集。但是在制备金属氧化物包覆的介孔氧化硅材料过程中采用层层自组装或者有机金属盐反应时，特别容易形成纳米金属氧化物颗粒，从而导致模版介孔氧化硅材料的有序孔道堵塞。近来，Ogura等[Krishnan C.K.，Hayashi T.，Ogura M.，Adv.Mater.2008，9999，1]发展了氨蒸气处理进行金属氧化物包覆的方法。利用此方法可以在介孔氧化硅材料的介孔壁上均匀包覆质量百分含量＞20％的金属氧化物而没有孔道的堵塞，这样得到的金属氧化物保持了介孔氧化硅的有序结构和大的比表面积，从而实现对磷酸化肽段的快速高效地富集。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对于磷酸化肽的分离富集具有高灵敏度，高选择性，高特异性和高吸附容量的表面包覆金属氧化物的介孔氧化硅材料及其制备和应用。

本发明涉及的表面包覆金属氧化物的介孔氧化硅材料，通过在介孔氧化硅材料的表面均匀包覆一层金属氧化物制得，其合成路线图如图1所示，得到的材料不但具有介孔氧化硅材料的高的比表面和有序的介孔孔道结构，而且表面具有金属氧化物的性质。这里的金属氧化物包括ZrO₂、Al₂O₃、Ga₂O₃或者这些金属的复合金属氧化物中的一种或多种；金属氧化物于其包覆的介孔氧化硅材料的质量百分比为1％-80％。

介孔氧化硅材料为MCM-41、MCM-48、SBA-15、FSM-16、APMS、MCF、MSU-n。介孔氧化硅材料的形貌为球形，介孔氧化硅颗粒的粒径大小为0.5-100微米，比表面为100-800m²/g，介孔孔道直径大小为2-50纳米。

所述介孔氧化硅材料的制备方法，包括以下步骤，

1)无机盐前驱体浸渍：将可溶性金属无机盐前驱体溶解到水中形成质量浓度1-30％的溶液，然后按金属氧化物与氧化硅质量比为0.01-0.8∶1的量与介孔氧化硅混合均匀，在40-120℃下搅拌至水完全挥发，然后在60-200℃下干燥0.5-12小时；

2)按金属氧化物与氨水(或三乙胺)1g/10-500mL的量将浸渍了金属前驱体的介孔氧化硅置于含有质量浓度1-28％氨水(或三乙胺)溶液的反应釜中在50-200℃水热处理0.1-20小时，通过高温下的碱蒸气分散水解孔道中的金属前驱体，得到表面包覆氧化物的介孔氧化硅材料；

3)将经过氨气处理的表面包覆氧化物前驱体的介孔氧化硅材料在500-600℃焙烧得到表面包覆氧化物的介孔氧化硅材料。

步骤1)中可溶性金属盐前驱体为金属硝酸盐、硫酸盐或氯化物。

所述金属氧化物包覆的介孔氧化硅材料在分离富集磷酸化肽中应用。

具体操作时采用装柱萃取，过程如下，

1)将表面包覆金属氧化物的介孔氧化硅材料装入萃取柱中，采用平衡液平衡柱子，将蛋白酶解物上到柱上，表面包覆金属氧化物的介孔氧化硅材料与蛋白酶解物重量比例为10-200∶1；

2)分别采用30-40倍柱体积的含pH 0-7有机酸溶液冲洗萃取柱；

3)采用1-10倍柱体积的质量浓度2-28％NH₃.H₂O洗脱得到磷酸化肽；

所述有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸；所述步骤1)的平衡液为含有有机酸的体积浓度为10-95％的乙腈/水溶液，其pH＝0-7。

所述步骤1)的平衡液中可含有质量体积浓度为0.5-300mg/mL的有机酸3-hydroxypropionic acid；所述步骤2)的清洗液中可含有体积浓度为0.01-10％的有机酸。

具体操作时采用离心或过滤分离，过程如下，

1)先采用平衡液平衡介孔氧化硅材料，将表面包覆金属氧化物的介孔氧化硅材料与蛋白酶解物以质量比例为10-200∶1混合，孵化0.5分钟-12小时；过滤或者离心分离，弃上层清液，收集沉淀；

2)采用pH＝0-7的有机酸溶液对沉淀清洗；

3)将清洗后的沉淀采用质量浓度2-28％NH₃.H₂O洗涤，沉淀与NH₃.H₂O的质量体积比为1mg/10-100μL，过滤或者离心分离，收集上层清液；浓缩得到磷酸化肽。

所述有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸；所述步骤1)的平衡液为含有有机酸的体积浓度为10-95％的乙腈/水溶液，其pH＝0-7。

所述步骤1)的平衡液中可含有质量体积浓度为0.5-300mg/mL的有机酸3-hydroxypropionic acid；所述步骤2)的清洗液中可含有体积浓度为0.01-10％的有机酸。

本发明具有如下优点：

1.本发明制备的表面包覆氧化物的介孔氧化硅材料因其具有大的比表面积，且其表面为金属氧化物的性质，因此在分离富集磷酸化肽时表现出了更高的特异性、更好的选择性、更高的吸附容量和更高的灵敏度。

2.本发明制备的表面包覆氧化物的介孔氧化硅材料可以方便的装填成不同长度，不同内径的微柱，特别适合微量生物样品中磷酸化肽段的分离富集，并且可以与ESI-MS联用，提高质谱的检测限和灵敏度。

3.本发明制备的表面包覆氧化物的介孔氧化硅材料可以为MCM-41、MCM-48、SBA-15、FSM-16、APMS、MCF、MSU-n。介孔氧化硅材料的形貌为球形，介孔氧化硅颗粒的粒径大小为0.5-100微米，比表面为100-800m²/g，介孔孔道直径大小为2-50纳米。

附图说明

图1为表面包覆ZrO₂质量百分含量为12％的SBA-15介孔氧化硅材料对标准磷酸化蛋白α-casein(40pmol)酶解产物中磷酸化肽富集前后的ESI-MS谱图。(a)α-casein酶解产物未经富集，经过C₁₈脱盐，(b)250μgZrO₂(12)/SBA-15对α-casein酶解产物富集后，(c)100μg ZrO₂(12)/SBA-15对α-casein酶解产物富集后。

图2为表面包覆ZrO₂质量百分含量为12％的SBA-15介孔氧化硅材料对混合的复杂的蛋白酶解样品α-casein∶BSA＝1∶10(摩尔比)中磷酸化肽段的纯化和富集前后的ESI-MS谱图。(a)α-casein∶BSA＝1∶10酶解产物经过C₁₈脱盐，(b)250μg ZrO₂(12)/SBA-15对α-casein∶BSA＝1∶10酶解产物富集后。

具体实施方式

本发明的目的在于提供一种对于磷酸化肽的分离富集具有高灵敏度，高选择性，高特异性和吸附容量的表面包覆金属氧化物的介孔氧化硅材料。下面结合附图通过具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不受这些实施例的限制。

样品溶液的制备：1mg的α-酪蛋白溶解在1mL碳酸氢铵溶液中(50mM，pH 8.0)，按照与胰蛋白酶的质量比1∶40(w/w)的比例加入胰蛋白酶进行酶解37℃反应18小时。

1mg的牛血清白蛋白溶解在1mL碳酸氢铵溶液中(50mM，pH 8.2，8M尿素)，室温4h，加入DTT溶液，37℃反应2h。加入IAA，室温避光静置30min，经过上述处理，蛋白完全变性，二硫键被打开，巯基被封闭。再按照与胰蛋白酶的质量比1∶40(w/w)的比例加入胰蛋白酶进行酶解37℃反应16小时。

实施例1

表面包覆氧化锆的SBA-15介孔氧化硅材料的制备：将对应于SBA-15氧化硅12％氧化锆质量的硝酸氧锆溶解到水中形成质量浓度10％的溶液，然后与SBA-15混合均匀在40℃下搅拌至水完全挥发，然后在100℃下干燥2小时。将1.0克的浸渍了硝酸氧锆的SBA-15置于含有20毫升质量浓度14％氨水的反应釜中100℃水热处理1小时，通过高温下的氨蒸气分散水解孔道中的金属氧化物前驱体，然后在500℃焙烧得到表面包覆氧化锆的ZrO₂(12)/SBA-15材料。

磷酸化肽段的选择性富集：250μg ZrO₂(12)/SBA-15材料装入tip管中，1μL(40pmol)蛋白酶解液上样，分别用20μL含有质量体积浓度为100mg/mL有机酸3-hydroxypropionic acid的80％CH₃CN/0.1％FA/20％H₂O，40μL50％CH₃CN/0.1％FA/50％H₂O和20μL0.1％FA水溶液洗，20μL2％氨水洗脱。洗脱液用10％FA中和后上到1mg C₁₈小柱上，20μL 0.1％FA水溶液洗，10μL 50％CH₃CN/0.1％FA/50％H₂O洗脱。然后在Q-TOF上进行直接进样分析。

由图1a和1b可见，磷酸化蛋白α-酪蛋白酶解产物中的磷酸化肽被表面包覆氧化锆的ZrO₂(12)/SBA-15介孔氧化硅材料所捕获，而非磷酸化肽被洗脱，说明表面包覆氧化锆的SBA-15介孔氧化硅材料能特异性的富集和纯化磷酸化肽。

实施例2

与实施例1不同之处在于，

磷酸化肽段的选择性富集：100μg ZrO₂(12)/SBA-15材料装入tip管中，1μL(40pmol)蛋白酶解液上样，分别用质量体积浓度为20μL 80mg/mL有机酸3-hydroxypropionic acid的80％CH₃CN/0.1％FA/20％H₂O，40μL50％CH₃CN/0.1％FA/50％H₂O和20μL 0.1％FA水溶液洗，20μL 2％氨水洗脱。洗脱液用10％FA水溶液中和后上到1mg C₁₈小柱上，20μL 0.1％FA水溶液洗，10μL 50％CH₃CN/0.1％FA/50％H₂O洗脱。然后在Q-TOF上进行直接进样分析。

由图1a和1c可见，磷酸化蛋白α-酪蛋白酶解产物中的磷酸化肽在用100μg ZrO₂(12)/SBA-15材料装成的tip管中被表面包覆氧化锆的SBA-15介孔氧化硅材料所有效捕获，而显示出此介孔材料在特异性富集和纯化磷酸化肽时的高效性。

实施例3

与实施例1不同之处在于，

磷酸化肽段的选择性富集：250μg ZrO₂(12)/SBA-15材料装入tip管中，α-酪蛋白酶解液(40pmol)和牛血清白蛋白蛋白酶解液混合按照摩尔比1∶10上样，分别用40μL 50％CH₃CN/0.1％FA/50％H₂O和20μL 0.1％FA水溶液洗，20μL 2％氨水洗脱。洗脱液用10％FA水溶液中和后上到1mg C₁₈小柱上，20μL 0.1％FA水溶液洗，10μL 50％CH₃CN/0.1％FA/50％H₂O洗脱。然后在Q-TOF上进行直接进样分析。

由图2a和2b可见，磷酸化蛋白α-酪蛋白酶解产物和非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液按照摩尔比1∶10混合物中的磷酸化肽被表面包覆氧化锆的SBA-15介孔氧化硅材料所有效捕获，从而显示出此介孔材料在特异性富集和纯化磷酸化肽时的高效性和特异性。

实施例4

与实施例1不同之处在于，

表面包覆氧化锆的SBA-15介孔氧化硅材料的制备：将对应于介孔氧化硅48％氧化锆质量的硝酸锆溶解到水中形成质量浓度1％的溶液，然后与SBA-15混合均匀在120℃下搅拌至水完全挥发，然后在200℃下干燥0.5小时。将0.5克的浸渍了硝酸锆的SBA-15置于含有250毫升质量浓度1％氨水的反应釜中200℃水热处理20小时，通过高温下的氨蒸气分散水解孔道中的硝酸锆，然后在600℃焙烧得到表面包覆氧化锆的ZrO₂(48)/SBA-15材料。

磷酸化肽段的分离、富集与纯化条件同实施例1或3，富集后的样品在Q-TOF上直接进样分析，得到的结果与同实施例1，3类似。

实施例5

与实施例1不同之处在于，

表面包覆氧化铝的SBA-15介孔氧化硅材料的制备：将对应于介孔氧化硅36％氧化铝质量的硝酸铝溶解到水中形成质量浓度20％的溶液，然后与SBA-15混合均匀在40℃下搅拌至水完全挥发，在60℃下干燥12小时。将0.5克的浸渍了氯化铝的SBA-15置于含有30毫升质量浓度为7％氨水的反应釜中200℃水热处理0.1小时，通过高温下的氨蒸气分散水解孔道中的氯化铝，然后在550℃焙烧得到表面包覆氧化铝的Al₂O₃(36)/SBA-15材料。

磷酸化肽段的分离、富集与纯化条件同实施例1，富集后的样品在Q-TOF上直接进样分析，得到的结果与同实施例1，4类似。

实施例6

与实施例1不同之处在于，

表面包覆氧化锆的SBA-15介孔氧化硅材料的制备：将对应于介孔氧化硅80％氧化锆质量的氯氧化锆溶解到水中形成质量浓度30％的溶液，然后与SBA-15混合均匀在80℃下搅拌至水完全挥发，然后在200℃下干燥0.5小时。将0.5克的浸渍了氯氧化锆的SBA-15置于含有250毫升质量浓度1％氨水的反应釜中80℃水热处理20小时，通过高温下的氨蒸气分散水解孔道中的氯氧化锆，然后在600℃焙烧得到表面包覆氧化锆的ZrO₂(80)/SBA-15材料。

磷酸化肽段的分离、富集与纯化条件同实施例1，富集后的样品在Q-TOF上直接进样分析，得到的结果与同实施例1，4，5类似。

实施例7

与实施例5不同之处在于，

表面包覆氧化铝的SBA-15介孔氧化硅材料的制备：将对应于介孔氧化硅1％氧化铝质量的氯化铝溶解到水中形成质量浓度1％的溶液，然后与SBA-15混合均匀在60℃下搅拌至水完全挥发，然后在200℃下干燥0.5小时。将0.5克的浸渍了氯化铝的SBA-15置于含有10毫升质量浓度28％氨水的反应釜中50℃水热处理20小时，通过高温下的氨蒸气分散水解孔道中的氯化铝，然后在600℃焙烧得到表面包覆氧化铝的Al₂O₃(24)/SBA-15材料。

磷酸化肽段的分离、富集与纯化条件同实施例5，富集后的样品在Q-TOF上直接进样分析，得到的结果与同实施例5类似。

实施例8

与实施例1不同之处在于，

表面包覆氧化镓的MCM-41介孔氧化硅材料的制备：将对应于介孔氧化硅24％氧化镓质量的硝酸镓溶解到水中形成质量浓度20％的溶液，然后与MCM-41混合均匀在100℃下搅拌至水完全挥发，然后在180℃下干燥8小时。将浸渍了硝酸镓的MCM-41置于含有氨水的反应釜中进行水热处理，通过高温下的氨蒸气分散水解孔道中的硝酸镓，然后在600℃焙烧得到表面包覆氧化镓的Ga₂O₃(24)/MCM-41材料。

磷酸化肽段的分离、富集与纯化条件同实施例1，富集后的样品在Q-TOF上直接进样分析，得到的结果与同实施例1，2，4，5类似。

实施例9

与实施例1不同之处在于，

表面包覆氧化锆的FSM-16介孔氧化硅材料的制备：将对应于介孔氧化硅24％氧化锆质量的硝酸氧锆溶解到水中形成质量浓度30％的溶液，然后与FSM-16混合均匀在40℃下搅拌至水完全挥发，然后在180℃下干燥8小时。将1.0克的浸渍了硝酸氧锆的FSM-16置于含有20毫升质量浓度14％氨水的反应釜中100℃水热处理1小时，通过高温下的氨蒸气分散水解孔道中的硝酸氧锆，然后在500℃焙烧得到表面包覆氧化锆的ZrO₂(24)/FSM-16材料。

磷酸化肽段的分离、富集与纯化条件同实施例1或3，富集后的样品在Q-TOF上直接进样分析，得到的结果与同实施例1，2，3，4，5类似。

实施例10

与实施例1不同之处在于，

表面包覆氧化锆的MCF介孔氧化硅材料的制备：将对应于介孔氧化硅36％氧化锆质量的硝酸锆溶解到水中形成质量浓度15％的溶液，然后与MCF混合均匀在100℃下搅拌至水完全挥发，然后在60℃下干燥12小时。将0.5克的浸渍了硝酸锆的MCF置于含有5毫升质量浓度28％氨水的反应釜中120℃水热处理0.1小时，通过高温下的氨蒸气分散水解孔道中的硝酸锆，然后在550℃焙烧得到表面包覆氧化锆的ZrO₂(36)/MCF材料。

磷酸化肽段的分离、富集与纯化条件同实施例1或3，富集后的样品在Q-TOF上直接进样分析，得到的结果与同实施例1，2，3，4，5类似。

实施例11

表面包覆氧化锆的MCF介孔氧化硅材料的制备：将对应于介孔氧化硅1％氧化锆质量的硝酸氧锆溶解到水中形成质量浓度1％的溶液，然后与MCF混合均匀在100℃下搅拌至水完全挥发，然后在60℃下干燥12小时。将1.0克的浸渍了硝酸氧锆的MCF置于含有500毫升质量浓度1％氨水的反应釜中150℃水热处理20小时，通过高温下的氨蒸气分散水解孔道中的硝酸氧锆，然后在500℃焙烧得到表面包覆氧化锆的ZrO₂(0.1)/MCF材料。

磷酸化肽段的分离、富集与纯化条件同实施例1或3，富集后的样品在Q-TOF上直接进样分析，得到的结果与同实施例1，2，3，4，5类似。

本发明表面包覆氧化物的介孔材料对于磷酸化肽具有很好的选择性富集性能，和常规的金属氧化物相比，表面包覆氧化物的介孔材料富集磷酸化肽具有更高的灵敏度，更高的选择性，更高的特异性和更大的吸附容量。利用表面包覆氧化物的介孔材料对于磷酸化肽的高效的特异性吸附能力，可以将其应用于复杂体系中磷酸化肽的选择性分离富集，结合质谱，该材料在翻译后修饰蛋白质组学研究等领域具有广阔的应用前景。

Claims (10)

1.一种表面包覆金属氧化物的介孔氧化硅材料，其特征在于：所述金属氧化物为ZrO₂、Al₂O₃、Ga₂O₃、或者这些金属的复合金属氧化物中的一种或多种；金属氧化物于其包覆的介孔氧化硅材料的质量百分比为1％-80％。

2.按照权利要求1所述介孔氧化硅材料，其特征在于：所述介孔氧化硅材料为MCM-41、MCM-48、SBA-15、FSM-16、APMS、MCF、MSU-n中的一种或多种。

3.按照权利要求1或2所述介孔氧化硅材料，其特征在于：所述介孔氧化硅材料的形貌为球形，介孔氧化硅颗粒的粒径大小为0.5-100微米，比表面为100-800m²/g，介孔孔道直径大小为2-50纳米。

4.一种权利要求1所述介孔氧化硅材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，

1)无机盐前驱体浸渍：将可溶性金属无机盐前驱体溶解到水中形成质量浓度1-30％的溶液，然后按金属氧化物与氧化硅质量比为0.01-0.8∶1的量与介孔氧化硅混合均匀，在40-120℃下搅拌至水完全挥发，然后在60-200℃下干燥0.5-12小时；

2)按金属氧化物与氨水或三乙胺1g/10-500mL的量将浸渍了金属前驱体的介孔氧化硅置于含有质量浓度1-28％氨水或三乙胺溶液的反应釜中在50-200℃水热处理0.1-20小时，通过高温下的碱蒸气分散水解孔道中的金属前驱体，得到表面包覆氧化物的介孔氧化硅材料；

3)将经过氨气处理的表面包覆氧化物前驱体的介孔氧化硅材料在500-600℃焙烧得到表面包覆金属氧化物的介孔氧化硅材料。

5.按照权利要求4所述介孔氧化硅材料的制备方法，其特征在于：步骤1)中可溶性金属盐前驱体为金属硝酸盐、硫酸盐或氯化物。

6.一种权利要求1所述介孔氧化硅材料在分离富集磷酸化肽中应用。

7.按照权利要求6所述介孔氧化硅材料在分离富集磷酸化肽中应用，其特征在于：

具体操作时采用装柱萃取，过程如下，

1)将表面包覆金属氧化物的介孔氧化硅材料装入萃取柱中，采用平衡液平衡柱子，将蛋白酶解物上到柱上，表面包覆金属氧化物的介孔氧化硅材料与蛋白酶解物质量比例为10-200∶1；

2)分别采用30-40倍柱体积的含pH 0-7有机酸溶液冲洗萃取柱；

3)采用1-10倍柱体积的质量浓度2-28％NH₃.H₂O洗脱得到磷酸化肽。

8.按照权利要求6所述介孔氧化硅材料在分离富集磷酸化肽中应用，其特征在于：

具体操作时采用离心或过滤分离，过程如下，

1)先采用平衡液平衡介孔氧化硅材料，将表面包覆金属氧化物的介孔氧化硅材料与蛋白酶解物以质量比例为10-200∶1混合，孵化0.5分钟-12小时；过滤或者离心分离，弃上层清液，收集沉淀；

2)采用pH＝0-7的有机酸溶液对沉淀清洗；

3)将清洗后的沉淀采用质量浓度2-28％ NH₃.H₂O洗涤，沉淀与NH₃.H₂O的质量体积比为1mg/10-100μL，过滤或者离心分离，收集上层清液；浓缩得到磷酸化肽。

9.按照权利要求7或8所述介孔氧化硅材料在分离富集磷酸化肽中应用，其特征在于：

所述有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸；所述步骤1)的平衡液为含有有机酸的体积浓度为10-95％的乙腈/水溶液，其pH＝0-7。

10.按照权利要求7或8所述介孔氧化硅材料在分离富集磷酸化肽中应用，其特征在于：

所述步骤1)的平衡液中可含有质量体积浓度为0.5-300mg/mL的有机酸3-hydroxypropionic acid；所述步骤2)的清洗液中可含有体积浓度为0.01-10％的有机酸。

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