CN105363426A - 一种介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法 - Google Patents
一种介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105363426A CN105363426A CN201510892678.XA CN201510892678A CN105363426A CN 105363426 A CN105363426 A CN 105363426A CN 201510892678 A CN201510892678 A CN 201510892678A CN 105363426 A CN105363426 A CN 105363426A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- meso
- solution
- perfluoroalkyl
- titanium dioxide
- porous titanium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
Abstract
本发明提出了一种介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，将磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料用于全氟烷基衍生的肽段的基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析。该材料对于氟相衍生的磷酸化肽显示出超强的亲和作用，同时在水溶液中保持了良好的分散性。该材料所具有的四氧化三铁磁性内核简化了富集分离的过程。基于该磁性微球表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料的固相微萃取方法取得了对于非磷酸化肽的选择性富集，并被能够成功应用于人体血清中的内源性磷酸化肽的富集。
Description
技术领域
本发明属于先进纳米材料与生物技术领域，涉及一种介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，具体涉及一种磁性微球四氧化三铁表面包覆聚全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料在全氟烷基衍生的磷酸化肽富集与MALDI-TOFMS分析中的应用。
背景技术
全氟烷基能够在含氟环境中产生离域效应，氟氟固相微萃取便是利用这一特性，通过全氟烷基修饰的介质，将含有全氟烷基的物质同不含氟的物质分离开来。氟氟固相微萃取技术通常被应用于靶向合成、非均相催化和有机小分子化合物的分离提纯等。近来，氟氟固相微萃取的应用已拓展到生物化学领域，包括蛋白质和肽段的分析鉴定、纳米微阵列设计和荧光检测等。
然而生物分子通常是不含氟的，所以必须用合适的含全氟烷基的亲和试剂进行衍生后，再利用氟氟相互作用将它们提取出来。基于氟亲和作用的蛋白质组学便是将生物样品中特定的蛋白/肽段标记上全氟烷基基团后，用氟氟固相微萃取技术进行富集的新型分析平台。传统的基于亲和作用的富集策略只适用于某一类有着特定功能基团的蛋白/肽段，比如金属氧化物亲和色谱用于磷酸化肽的富集，硼酸亲和色谱用于糖肽的富集等。与上述基于亲和作用的富集方法不同，对目标蛋白/肽段进行适当的衍生后，基于氟亲和作用的富集方法能够应用于富集含有不同功能基团或翻译后修饰的蛋白/肽段，并展现了很高的选择性。
另一方面，基于氟亲和作用的富集方法还被同功能化磁性纳米材料进行了结合。全氟癸基功能化的磁性纳米微球被成功合成并应用于水样中含氟物质的萃取，为结合了磁性材料的氟氟固相微萃取技术应用于蛋白质组学研究提供了启示。考虑到磁性分离的快速和简便性，融合了磁性材料的氟氟固相微萃取方法与质谱鉴定技术相结合，是取代传统亲和方法鉴定肽段的理想手段。此外，这一新的富集策略具有从一个蛋白样品中同时富集多种含有不同功基团或翻译后修饰肽段的潜力，而无须对富集的介质做出改变。
本发明中设计与合成的磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料，被成功应用于全氟烷基衍生的肽段的富集。首先通过传统水热合成方法制备四氧化三铁磁性微球，接着通过表面活性剂辅助的一锅法在四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅，其中正硅酸乙酯作为硅源，十六烷基三甲基溴化铵作为介孔形成的模板剂，1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基硅烷作为全氟烷基的来源。由于材料表面富含硅羟基而介孔二氧化硅孔道中修饰有全氟烷基，合成所得复合材料具有良好的分散性、较高的富集容量和对于全氟烷基衍生肽段的特异性吸附作用，能够应用于氟相衍生的低浓度肽段的富集与质谱检测。
发明内容
本发明目的在于提供一种介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法。
该方法将介孔二氧化硅复合材料配成浓度为10mg/mL的分散液,溶剂为50%（体积分数）乙醇；将该分散液加入全氟烷基衍生的肽段溶液稀释液中，混合，在酶解仪中孵育30-60分钟；通过外加磁场分离出介孔二氧化硅复合材料，用去离子水洗涤，用0.4M氨水洗脱；取1μL洗脱液点在基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）靶板上，自然干燥后再滴加0.8μL浓度为20mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于被分析物液滴上，形成薄基质层，干后进行质谱分析。
其中，所述介孔二氧化硅材料为磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料。
本发明中，介孔二氧化硅复合材料的具体制备步骤如下：
（1）将六水合三氯化铁溶于乙二醇中，磁力搅拌至澄清后，加入醋酸钠，充分搅拌溶解后转移至水热合成反应釜中，超声5分钟后，放入烘箱中190-200℃下加热10-18小时，取出反应釜，冷却10-12小时；从反应釜中倒出反应所得的磁球，并用去离子水和无水乙醇充分洗涤，40-60℃下真空干燥；
（2）将步骤（1）所得产物与十六烷基三甲基溴化铵按质量比1：10分散在去离子水中，超声30分钟；将所得分散液与氢氧化钠溶液混合，超声5分钟后得到均一稳定的分散液；将该混合溶液在60℃水浴中加热搅拌30分钟后，向其中缓慢滴加正硅酸乙酯/乙醇溶液，滴加完毕后在60℃水浴中加热搅拌30分钟；
（3）将1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基硅烷/正硅酸乙酯溶液滴加到步骤（2）所得产物中，在60℃水浴中加热搅拌12小时；
（4）用磁铁将步骤（3）所得产物从反应液中分离出来，在60℃乙醇溶液中加热回流除去十六烷基三甲基溴化铵模板剂，在40-60℃下真空干燥。
本发明中，步骤（1）中六水合三氯化铁和醋酸钠的质量比为：(1.0-1.5)：(3.0-10.0)。
本发明中，步骤（2）中步骤（1）所得的产物和去离子水的质量比为1.0：1.0；氢氧化钠溶液的浓度范围为1.0×10-3摩尔/升-1.5×10-3摩尔/升；氢氧化钠溶液与去离子水的体积比为9.0：1.0；正硅酸乙酯与分散液的体积比为1.0：1000；正硅酸乙酯与乙醇的体积比为1.0：4.0。
本发明中，步骤（3）中1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基硅烷与正硅酸乙酯的体积比为1.0：2.0；1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基硅烷/正硅酸乙酯混合溶液与步骤（2）中正硅酸乙酯/乙醇混合溶液的体积比为1.0：（15.0-20.0）。
本发明中，全氟烷基衍生的肽段溶液稀释液的具体制备步骤如下：
（1）向标准磷酸化肽、蛋白酶解液或人体血清中依次加入二甲亚砜/乙醇溶液、饱和氢氧化钡溶液、浓度为500mM的氢氧化钠溶液和衍生试剂1H,2H,2H,2H-全氟-1-硫醇，在酶解仪中37℃下避光反应1小时；
（2）加入体积分数为5%的三氟乙酸溶液，将步骤（1）所得的溶液调节至酸性，终止衍生反应，然后加入过氧化氢溶液在酶解仪中20℃下氧化30分钟，磷酸化肽中的磷酸根将被全氟烷基所取代；用去离子水将衍生液稀释100倍。
本发明中，步骤（1）中二甲亚砜/乙醇溶液与肽段溶液的体积比为1.0：1.0，二甲亚砜与乙醇的体积比为3.0：1.0，饱和氢氧化钡溶液与二甲亚砜/乙醇溶液的体积比为23.0：25.0，500mM氢氧化钠溶液与二甲亚砜/乙醇溶液的体积比为1.0：5.0，1H,2H,2H,2H-全氟-1-硫醇与二甲亚砜/乙醇溶液的体积比为7.0：50.0
本发明中，步骤（2）中5%三氟乙酸溶液与二甲亚砜/乙醇溶液的体积比为3.0：5.0，过氧化氢溶液的终浓度为体积分数3%。
本发明的有益效果在于：所提供的介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法中，磁性微球包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料用表面活性剂辅助的一锅合成法合成，制备方法简便，合成所得材料具有良好的磁响应性、大比表面积和在水溶液中的分散性，对全氟烷基衍生的磷酸化肽具有很强的亲和作用，可作为富集分离全氟烷基修饰的磷酸化肽的固相微萃取吸附剂。该材料以全氟烷基修饰的介孔二氧化硅作为壳层，提供了对目标含氟肽段的特异性吸附，并显示出了很高的选择性，取得了对于非磷酸化肽1:1000（物质的量之比）的选择性，并适用于复杂生物样品中全氟烷基衍生的磷酸化肽的鉴定。
附图说明
图1为实施例1所得的磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料的透射电子显微镜照片和扫描电子显微镜照片，其中（a）为磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅的透射电子显微镜照片；（b）为磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅的扫描电子显微镜照片；
图2为实施例1所得的磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料的磁滞回曲线；
图3为实施例1所得的磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料在77K测得的氮气吸附-脱附曲线；
图4为实施例2所得的磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料在水中的分散液照片和该分散液经磁铁分离2秒后的照片，其中（a）为磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料在水中的分散液照片；（b）为磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料的分散液经磁铁分离2秒后的照片；
图5为实施例2中4×10-7M的全氟烷基衍生的β-casein酶解液的稀释液的质谱图和该稀释液经磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料选择性富集后的质谱图，其中（a）为4×10-7M的全氟烷基衍生的β-casein酶解液的稀释液的质谱图；（b）为4×10-7M的全氟烷基衍生的β-casein酶解液的稀释液经磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料选择性富集后的质谱图；
图6为实施例4中物质的量之比为1：100的β-casein和BSA蛋白酶解液混合液经全氟烷基衍生后的稀释液的质谱图和该稀释液经磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料选择性富集后的质谱图，其中，（a）为物质的量之比为1：100的β-casein和BSA蛋白酶解液混合液经全氟烷基衍生后的稀释液的质谱图；（b）为全氟烷基衍生的物质的量之比为1：100的β-casein和BSA蛋白酶解液混合液稀释液经磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料选择性富集后的质谱图；
图7为实施例4中物质的量之比为1：1000的β-casein和BSA蛋白酶解液混合液经全氟烷基衍生后的稀释液的质谱图和该稀释液经磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料选择性富集后的质谱图，其中，（a）为物质的量之比为1：1000的β-casein和BSA蛋白酶解液混合液经全氟烷基衍生后的稀释液的质谱图；（b）为全氟烷基衍生的物质的量之比为1：1000的β-casein和BSA蛋白酶解液混合液稀释液经磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料选择性富集后的质谱图；
图8为实施例6中人体血清经全氟烷基衍生后的稀释液的质谱图和该稀释液经磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料选择性富集后的质谱图，其中，（a）为人体血清经全氟烷基衍生后的稀释液的质谱图；（b）为全氟烷基衍生的人体血清稀释液经磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料选择性富集后的质谱图。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1：一种磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料的合成
（1）将1.35g六水合三氯化铁（FeCl3·6H2O）溶于75mL乙二醇中，磁力搅拌至澄清后，加入3.6g醋酸钠，充分搅拌至溶解后继续搅拌0.5h，转移至水热合成反应釜中，超声5分钟后，放入烘箱中200℃下加热16小时，取出反应釜，冷却10小时；从反应釜中倒出反应所得的磁球，并用去离子水和无水乙醇充分洗涤，50℃下真空干燥；
（2）将步骤（1）所得磁球75mg与十六烷基三甲基溴化铵750mg分散在75mL去离子水中，超声30分钟；将所得分散液与675mL浓度为10-3M的氢氧化钠溶液混合，超声5分钟后得到均一稳定的分散液；将该混合溶液在60℃水浴中加热搅拌30分钟后，向其中缓慢滴加正硅酸乙酯/乙醇溶液3.75mL（体积比为1：4），滴加完毕后在60℃水浴中加热搅拌30分钟；
（3）将1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基硅烷/正硅酸乙酯溶液（体积比为1：2）225μL滴加到步骤（2）所得分散液中，在60℃水浴中加热搅拌12小时；
（4）用磁铁将步骤（3）所得产物从反应液中分离出来，在60℃乙醇溶液中加热回流除去十六烷基三甲基溴化铵模板剂；所得产物在50℃下真空干燥。
图1为所得的磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料的透射电子显微镜照片和扫描电子显微镜照片；透射电镜型号为JEM-2100F（JOEL），将纯化后的磁性微球的乙醇分散液滴在覆有碳膜的铜网上，自然干燥后用透射电子显微镜观察并拍照；扫描电镜型号为PhenomProx（Phenom），将纯化后的样品均匀涂布在导电胶上，SEM表征前表面喷涂一层钯。
图2为所得的磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料的磁滞回曲线，饱和磁化强度为57.8emug-1；磁学测量系统型号为MPMS(SQUID)。
图3为所得的磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料在77K测得的氮气吸附-脱附曲线，Brunauer-Emmett-Teller方法计算得出的比表面积为241.236m2g-1；比表面积和孔分析仪型号为MicromeritcsTristar3000。
实施例2：将实施例1得到的磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料作为固相微萃取吸附剂用于全氟烷基衍生的低浓度β-casein酶解液的富集与MALDI-TOFMS检测。
（1）标准蛋白酶解液的制备：准确称取5mg标准蛋白β-casein溶于25mM碳酸氢铵缓冲液中，煮沸10分钟，用25mM碳酸氢铵缓冲液稀释到1mg/mL，然后按照与蛋白质量比1：40加入适量的胰蛋白酶（trypsin），37℃下酶解16小时。
（2）标准蛋白酶解液的衍生：向步骤（1）所得β-casein酶解液10μL中依次加入二甲亚砜/乙醇溶液（体积比为3：1）10μL、饱和氢氧化钡溶液9.2μL、浓度为500mM的氢氧化钠溶液2μL和衍生试剂1H,2H,2H,2H-全氟-1-硫醇1.4μL，在酶解仪中37℃下避光反应1小时；加入三氟乙酸溶液（5%，体积分数）6μL将反应液调节至酸性，终止衍生反应，然后加入终浓度为3%（体积分数）的过氧化氢溶液在酶解仪中20℃下氧化30分钟，磷酸化肽中的磷酸根将被全氟烷基所取代；富集前，用去离子水将衍生液稀释100倍。
（3）试样的富集：向200μL步骤（2）所得β-casein酶解液的全氟烷基衍生液稀释液中，加入10μL磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料的分散液（浓度为10mg/mL，溶剂为50%乙醇），在酶解仪中37℃下孵育30分钟；通过外加磁场分离出磁性微球，用去离子水洗涤三次后，用0.4M氨水10μL洗脱10分钟，用磁铁将洗脱液与材料分离开来。
图4为所得磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料在水中的分散液照片和该分散液经磁铁分离2秒后的照片，磁铁购置于PCCW有限公司，长宽均为2cm，高1cm，表面磁场强度是1000高斯。
（4）点靶：取1μL步骤（3）所述洗脱液点到MALDI-TOFMS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，再取0.8μL浓度为20mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，干后进行质谱分析。
（5）质谱分析以磁性微球包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料作为吸附剂富集到的全氟烷基衍生的磷酸化肽分子。
图5为浓度为4×10-7M的β-casein酶解液的全氟烷基衍生液的稀释液质谱图和该稀释液经磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料选择性富集后的质谱图。富集后，质谱图中出现了四条β-casein蛋白酶解磷酸化肽经全氟烷基衍生的峰（m/z=3404,2838，2343和1560）以及五条α-casein蛋白酶解磷酸化肽经全氟烷基衍生的峰（m/z=2209，2114，1942，1843和1748）。
实施例3：一种磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料的合成
（1）将1.35g六水合三氯化铁（FeCl3·6H2O）溶于70mL乙二醇中，磁力搅拌至澄清后，加入5.0g醋酸钠，充分搅拌至溶解后继续搅拌0.5h，转移至水热合成反应釜中，超声5分钟后，放入烘箱中190℃下加热18小时，取出反应釜，冷却12小时；从反应釜中倒出反应所得的磁球，并用去离子水和无水乙醇充分洗涤，60℃下真空干燥；
（2）将步骤（1）所得磁球50mg与十六烷基三甲基溴化铵500mg分散在50mL去离子水中，超声30分钟；将所得分散液与450mL浓度为10-3M的氢氧化钠溶液混合，超声5分钟后得到均一稳定的分散液；将该混合溶液在60℃水浴中加热搅拌30分钟后，向其中缓慢滴加正硅酸乙酯/乙醇溶液2.5mL（体积比为1：4），滴加完毕后在60℃水浴中加热搅拌30分钟；
（3）将1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基硅烷/正硅酸乙酯溶液（体积比为1：2）150μL滴加到步骤（2）所得分散液中，在60℃水浴中加热搅拌12小时；
（4）用磁铁将步骤（3）所得产物从反应液中分离出来，在60℃乙醇溶液中加热回流除去十六烷基三甲基溴化铵模板剂；所得产物在60℃下真空干燥。
实施例4：将实施例3得到的磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料作为固相微萃取吸附剂用于全氟烷基衍生的β-casein和BSA蛋白酶解液混合液的衍生液的富集与MALDI-TOFMS检测。
（1）标准蛋白酶解液的制备：准确称取5mg标准蛋白β-casein和10mg标准蛋白BSA溶于25mM碳酸氢铵缓冲液中，煮沸10分钟，用25mM碳酸氢铵缓冲液分别稀释到1mg/mL和2mg/mL，然后按照与蛋白质量比1：40加入适量的胰蛋白酶（trypsin），37℃下酶解16小时。
（2）标准蛋白酶解液的衍生：分别按物质的量之比1：100和1：1000将步骤（1）所得β-casein酶解液与BSA酶解液混合，向10μL混合溶液中依次加入二甲亚砜/乙醇溶液（体积比为3：1）10μL、饱和氢氧化钡溶液9.2μL、浓度为500mM的氢氧化钠溶液2μL和衍生试剂1H,2H,2H,2H-全氟-1-硫醇1.4μL，在酶解仪中37℃下避光反应1小时；加入三氟乙酸溶液（5%，体积分数）6μL将反应液调节至酸性，终止衍生反应，然后加入终浓度为3%（体积分数）的过氧化氢溶液在酶解仪中20℃下氧化30分钟，磷酸化肽中的磷酸根将被全氟烷基所取代；富集前，用去离子水将衍生液稀释100倍。
（3）试样的富集：向200μLβ-casein与BSA酶解液混合液的全氟烷基衍生液稀释液中，加入10μL磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料的分散液（浓度为10mg/mL，溶剂为50%乙醇），在酶解仪中37℃下孵育30分钟；通过外加磁场分离出磁性微球，用去离子水洗涤三次后，用0.4M氨水10μL洗脱10分钟，用磁铁将洗脱液与材料分离开来。
（4）点靶：取1μL步骤（3）所述洗脱液点到MALDI-TOFMS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，再取0.8μL浓度为20mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，干后进行质谱分析。
（5）质谱分析以磁性微球包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料作为吸附剂富集到的全氟烷基衍生的磷酸化肽分子。
图6为物质的量之比为1：100的β-casein和BSA蛋白酶解液混合液经全氟烷基衍生后的稀释液的质谱图和该稀释液经磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料选择性富集后的质谱图。富集后，质谱图中出现了四条β-casein蛋白酶解磷酸化肽经全氟烷基衍生的峰（m/z=3404,m/z=2838，m/z=2343和m/z=1560）以及五条α-casein蛋白酶解磷酸化肽经全氟烷基衍生的峰（m/z=2209，m/z=2114，m/z=1942，m/z=1843和m/z=1748）。
图7为物质的量之比为1：1000的β-casein和BSA蛋白酶解液混合液经全氟烷基衍生后的稀释液的质谱图和该稀释液经磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料选择性富集后的质谱图。富集后，质谱图中出现了四条β-casein蛋白酶解磷酸化肽经全氟烷基衍生的峰（m/z=3404，2838，2343和1560）以及五条α-casein蛋白酶解磷酸化肽经全氟烷基衍生的峰（m/z=2209，2114，1942，1843和1748）。
实施例5：一种磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料的合成
（1）将2.0g六水合三氯化铁（FeCl3·6H2O）溶于100mL乙二醇中，磁力搅拌至澄清后，加入7.0g醋酸钠，充分搅拌至溶解后继续搅拌0.5h，转移至水热合成反应釜中，超声5分钟后，放入烘箱中190℃下加热18小时，取出反应釜，冷却12小时；从反应釜中倒出反应所得的磁球，并用去离子水和无水乙醇充分洗涤，50℃下真空干燥；
（2）将步骤（1）所得磁球60mg与十六烷基三甲基溴化铵600mg分散在60mL去离子水中，超声30分钟；将所得分散液与540mL浓度为1.5×10-3M的氢氧化钠溶液混合，超声5分钟后得到均一稳定的分散液；将该混合溶液在60℃水浴中加热搅拌30分钟后，向其中缓慢滴加正硅酸乙酯/乙醇溶液3.0mL（体积比为1：4），滴加完毕后在60℃水浴中加热搅拌30分钟；
（3）将1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基硅烷/正硅酸乙酯溶液（体积比为1：2）180μL滴加到步骤（2）所得分散液中，在60℃水浴中加热搅拌12小时；
（4）用磁铁将步骤（3）所得产物从反应液中分离出来，在60℃乙醇溶液中加热回流除去十六烷基三甲基溴化铵模板剂；所得产物在50℃下真空干燥。
实施例6：将实施例5得到的磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料作为固相微萃取吸附剂用于肝癌病人血清样品溶液中全氟烷基衍生的磷酸化肽的富集与MALDI-TOFMS检测。
（1）血清样品的衍生：向血清样品10μL中依次加入二甲亚砜/乙醇溶液（体积比为3：1）10μL、饱和氢氧化钡溶液9.2μL、浓度为500mM的氢氧化钠溶液2μL和衍生试剂1H,2H,2H,2H-全氟-1-硫醇1.4μL，在酶解仪中37℃下避光反应1小时；加入三氟乙酸溶液（5%，体积分数）6μL将反应液调节至酸性，终止衍生反应，然后加入终浓度为3%（体积分数）的过氧化氢溶液在酶解仪中20℃下氧化30分钟，磷酸化肽中的磷酸根将被全氟烷基所取代；富集前，用去离子水将衍生液稀释100倍。
（2）试样的富集：向200μL步骤（1）所得人体血清的全氟烷基衍生液稀释液中，加入10μL磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料的分散液（浓度为10mg/mL，溶剂为50%乙醇），在酶解仪中37℃下孵育30分钟；通过外加磁场分离出磁性微球，用去离子水洗涤三次后，用0.4M氨水10μL洗脱10分钟，用磁铁将洗脱液与材料分离开来。
（3）点靶：取1μL步骤（2）所述洗脱液点到MALDI-TOFMS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，再取0.8μL浓度为20mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，干后进行质谱分析。
（4）质谱分析以磁性微球包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料作为吸附剂从肝癌病人血清溶液中富集到的全氟烷基衍生的磷酸化肽分子。
全氟烷基衍生的肝癌病人血清溶液富集前，全氟烷基衍生的磷酸化肽在质谱中的信号受到非磷酸化肽的严重干扰而难以检测到；经磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料富集后，质谱图中显示出四条肝癌病人的特征磷酸化肽经全氟烷基衍生的峰（m/z=1671,1742,1827和1898）和去磷酸化肽经全氟烷基衍生的峰（m/z=1489和1591）。
Claims (8)
1.一种介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，其特征在于：将介孔二氧化硅复合材料配成浓度为10mg/mL的分散液,溶剂为50%体积分数的乙醇；将该分散液加入全氟烷基衍生的肽段溶液稀释液中，混合，在酶解仪中孵育30-60分钟；通过外加磁场分离出介孔二氧化硅复合材料，用去离子水洗涤，用0.4M氨水洗脱；取1μL洗脱液点在基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱靶板上，自然干燥后再滴加0.8μL浓度为20mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸溶液于被分析物液滴上，形成薄基质层，干后进行质谱分析；
其中，所述介孔二氧化硅复合材料为磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料。
2.根据权利要求1所述的介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，其特征在于所述介孔二氧化硅复合材料的具体制备步骤如下：
（1）将六水合三氯化铁溶于乙二醇中，磁力搅拌至澄清后，加入醋酸钠，充分搅拌溶解后转移至水热合成反应釜中，超声5分钟后，放入烘箱中190-200℃下加热10-18小时，取出反应釜，冷却10-12小时；从反应釜中倒出反应所得的磁球，并用去离子水和无水乙醇充分洗涤，40-60℃下真空干燥；
（2）将步骤（1）所得产物与十六烷基三甲基溴化铵按质量比1：10分散在去离子水中，超声30分钟；将所得分散液与氢氧化钠溶液混合，超声5分钟后得到均一稳定的分散液；将该混合溶液在60℃水浴中加热搅拌30分钟后，向其中缓慢滴加正硅酸乙酯/乙醇溶液，滴加完毕后在60℃水浴中加热搅拌30分钟；
（3）将1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基硅烷/正硅酸乙酯溶液滴加到步骤（2）所得产物中，在60℃水浴中加热搅拌12小时；
（4）用磁铁将步骤（3）所得产物从反应液中分离出来，在60℃乙醇溶液中加热回流除去十六烷基三甲基溴化铵模板剂，在40-60℃下真空干燥。
3.根据权利要求2所述的介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，其特征在于步骤（1）中六水合三氯化铁和醋酸钠的质量比为：(1.0-1.5)：(3.0-10.0)。
4.根据权利要求2所述的介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，其特征在于步骤（2）中步骤（1）所得的产物和去离子水的质量比为1.0：1.0；氢氧化钠溶液的浓度范围为1.0×10-3摩尔/升-1.5×10-3摩尔/升；氢氧化钠溶液与去离子水的体积比为9.0：1.0；正硅酸乙酯与分散液的体积比为1.0：1000；正硅酸乙酯与乙醇的体积比为1.0：4.0。
5.根据权利要求2所述的介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，其特征在于步骤（3）中1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基硅烷与正硅酸乙酯的体积比为1.0：2.0；1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基硅烷/正硅酸乙酯混合溶液与步骤（2）中正硅酸乙酯/乙醇混合溶液的体积比为1.0：（15.0-20.0）。
6.根据权利要求1所述的介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，其特征在于全氟烷基衍生的肽段溶液稀释液的具体制备步骤如下：
（1）向标准磷酸化肽、蛋白酶解液或人体血清中依次加入二甲亚砜/乙醇溶液、饱和氢氧化钡溶液、浓度为500mM的氢氧化钠溶液和衍生试剂1H,2H,2H,2H-全氟-1-硫醇，在酶解仪中37℃下避光反应1小时；
（2）加入体积分数为5%的三氟乙酸溶液，将步骤（1）所得的溶液调节至酸性，终止衍生反应，然后加入过氧化氢溶液在酶解仪中20℃下氧化30分钟，磷酸化肽中的磷酸根将被全氟烷基所取代；用去离子水将衍生液稀释100倍。
7.根据权利要求6所述的介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，其特征在于步骤（1）中二甲亚砜/乙醇溶液与肽段溶液的体积比为1.0：1.0，二甲亚砜与乙醇的体积比为3.0：1.0，饱和氢氧化钡溶液与二甲亚砜/乙醇溶液的体积比为23.0：25.0，500mM氢氧化钠溶液与二甲亚砜/乙醇溶液的体积比为1.0：5.0，1H,2H,2H,2H-全氟-1-硫醇与二甲亚砜/乙醇溶液的体积比为7.0：50.0。
8.根据权利要求5所述的在磷酸化肽上修饰全氟烷基的衍生方法，其特征在于步骤（2）中5%三氟乙酸溶液与二甲亚砜/乙醇溶液的体积比为3.0：5.0，过氧化氢溶液的终浓度为体积分数3%。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510892678.XA CN105363426B (zh) | 2015-12-08 | 2015-12-08 | 一种介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510892678.XA CN105363426B (zh) | 2015-12-08 | 2015-12-08 | 一种介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105363426A true CN105363426A (zh) | 2016-03-02 |
| CN105363426B CN105363426B (zh) | 2018-10-16 |
Family
ID=55366344
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510892678.XA Expired - Fee Related CN105363426B (zh) | 2015-12-08 | 2015-12-08 | 一种介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105363426B (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106732408A (zh) * | 2017-02-09 | 2017-05-31 | 复旦大学 | 一种亲水性磁性介孔硅材料的合成方法及其应用 |
| CN107064109A (zh) * | 2017-04-18 | 2017-08-18 | 厦门大学 | 一种检测饮料中苯甲酸的方法 |
| CN108440641A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-08-24 | 复旦大学 | 一种特异性分离富集磷酸化肽和糖基化肽的方法 |
| CN108940213A (zh) * | 2018-08-08 | 2018-12-07 | 武汉谱信环保科技有限公司 | 用于磁性固相萃取的磁性纳米材料及其制备方法 |
| CN113842672A (zh) * | 2021-09-16 | 2021-12-28 | 暨南大学 | 一种固相微萃取薄膜及其制备方法与应用 |
| WO2022016683A1 (zh) * | 2020-07-20 | 2022-01-27 | 中山大学 | 一种激光离子化的固相微萃取-飞行时间质谱联用的系统 |
| CN114011376A (zh) * | 2021-11-01 | 2022-02-08 | 中国药科大学 | 一种金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料及制备方法与应用 |
| CN114573725A (zh) * | 2022-03-02 | 2022-06-03 | 徐州工程学院 | 一种酸枣仁多糖提取物的提取方法 |
| CN116060106A (zh) * | 2021-10-29 | 2023-05-05 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种Al-SBA-15/β核壳型复合分子筛及其制备方法和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020098595A1 (en) * | 2000-02-08 | 2002-07-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Protein separation and display |
| CN101054406A (zh) * | 2007-05-24 | 2007-10-17 | 复旦大学 | 采用金属氧化物磁性微球分离富集磷酸化肽段的方法 |
| CN102059091A (zh) * | 2009-11-16 | 2011-05-18 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种表面包覆金属氧化物的介孔氧化硅及其制备和应用 |
| CN103091153A (zh) * | 2011-10-31 | 2013-05-08 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种血清中痕量内源性磷酸化肽的富集方法 |
-
2015
- 2015-12-08 CN CN201510892678.XA patent/CN105363426B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020098595A1 (en) * | 2000-02-08 | 2002-07-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Protein separation and display |
| CN101054406A (zh) * | 2007-05-24 | 2007-10-17 | 复旦大学 | 采用金属氧化物磁性微球分离富集磷酸化肽段的方法 |
| CN102059091A (zh) * | 2009-11-16 | 2011-05-18 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种表面包覆金属氧化物的介孔氧化硅及其制备和应用 |
| CN103091153A (zh) * | 2011-10-31 | 2013-05-08 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种血清中痕量内源性磷酸化肽的富集方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| WAN-FU MA ET AL.: "Tailor-Made Magnetic Fe3O4@mTiO2 Microspheres with a Tunable Mesoporous Anatase Shell for Highly Selective and Effective Enrichment of Phosphopeptides", 《ACS NANO》 * |
| 孙念荣 等: "碳功能化的磁性石墨烯/介孔硅复合材料的合成及其在糖肽/糖链分离分析中的应用", 《第二十届全国色谱学术报告会及仪器展览会论文集》 * |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106732408A (zh) * | 2017-02-09 | 2017-05-31 | 复旦大学 | 一种亲水性磁性介孔硅材料的合成方法及其应用 |
| CN107064109A (zh) * | 2017-04-18 | 2017-08-18 | 厦门大学 | 一种检测饮料中苯甲酸的方法 |
| CN108440641A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-08-24 | 复旦大学 | 一种特异性分离富集磷酸化肽和糖基化肽的方法 |
| CN108440641B (zh) * | 2018-02-07 | 2021-11-19 | 复旦大学 | 一种特异性分离富集磷酸化肽和糖基化肽的方法 |
| CN108940213A (zh) * | 2018-08-08 | 2018-12-07 | 武汉谱信环保科技有限公司 | 用于磁性固相萃取的磁性纳米材料及其制备方法 |
| CN108940213B (zh) * | 2018-08-08 | 2021-03-12 | 武汉谱信环保科技有限公司 | 用于磁性固相萃取的磁性纳米材料及其制备方法 |
| WO2022016683A1 (zh) * | 2020-07-20 | 2022-01-27 | 中山大学 | 一种激光离子化的固相微萃取-飞行时间质谱联用的系统 |
| CN113842672A (zh) * | 2021-09-16 | 2021-12-28 | 暨南大学 | 一种固相微萃取薄膜及其制备方法与应用 |
| CN116060106A (zh) * | 2021-10-29 | 2023-05-05 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种Al-SBA-15/β核壳型复合分子筛及其制备方法和应用 |
| CN116060106B (zh) * | 2021-10-29 | 2024-05-07 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种Al-SBA-15/β核壳型复合分子筛及其制备方法和应用 |
| CN114011376A (zh) * | 2021-11-01 | 2022-02-08 | 中国药科大学 | 一种金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料及制备方法与应用 |
| CN114011376B (zh) * | 2021-11-01 | 2024-02-27 | 中国药科大学 | 一种金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料及制备方法与应用 |
| CN114573725A (zh) * | 2022-03-02 | 2022-06-03 | 徐州工程学院 | 一种酸枣仁多糖提取物的提取方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105363426B (zh) | 2018-10-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105363426A (zh) | 一种介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法 | |
| CN103894161B (zh) | 一种磁性金属有机骨架复合材料的合成方法及其应用 | |
| CN106512965A (zh) | 一种金属有机骨架纳米复合材料的合成方法及其应用 | |
| CN103143331A (zh) | 磁性微球四氧化三铁表面包覆[Cu3(btc)2]金属有机骨架复合材料的合成方法及其应用 | |
| Yang et al. | Design and synthesis of an immobilized metal affinity chromatography and metal oxide affinity chromatography hybrid material for improved phosphopeptide enrichment | |
| Sun et al. | Hydrophilic Nb5+-immobilized magnetic core–shell microsphere–A novel immobilized metal ion affinity chromatography material for highly selective enrichment of phosphopeptides | |
| Kailasa et al. | Nanomaterial-based miniaturized extraction and preconcentration techniques coupled to matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry for assaying biomolecules | |
| Hajduk et al. | Challenges in biomarker discovery with MALDI-TOF MS | |
| Li et al. | Hydrophilic probe in mesoporous pore for selective enrichment of endogenous glycopeptides in biological samples | |
| Yao et al. | Rapid synthesis of titanium (IV)‐immobilized magnetic mesoporous silica nanoparticles for endogenous phosphopeptides enrichment | |
| CN106732409B (zh) | 磺酸基修饰的金属有机骨架纳米复合材料的合成方法及其应用 | |
| AU2011232434B2 (en) | Early detection of recurrent breast cancer using metabolite profiling | |
| Li et al. | Magnetic mesoporous silica nanocomposites with binary metal oxides core-shell structure for the selective enrichment of endogenous phosphopeptides from human saliva | |
| CN106140094A (zh) | 金属有机骨架修饰的磁性石墨烯复合材料的合成方法和应用 | |
| Zhao et al. | Coupling a solid phase microextraction (SPME) probe with ambient MS for rapid enrichment and detection of phosphopeptides in biological samples | |
| CN105536748B (zh) | 一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法 | |
| CN109942667A (zh) | 二维金属有机骨架纳米片富集磷酸化肽段的方法和应用 | |
| CN107607640A (zh) | 一种硼酸修饰的纳米复合材料的糖肽富集与质谱检测方法 | |
| CN108440641A (zh) | 一种特异性分离富集磷酸化肽和糖基化肽的方法 | |
| CN110308025A (zh) | 用于离子液体样品制备的质谱兼容盐的形成 | |
| Bie et al. | Preparation of salbutamol imprinted magnetic nanoparticles via boronate affinity oriented surface imprinting for the selective analysis of trace salbutamol residues | |
| CN105823847A (zh) | 一种两性亲水复合纳米材料的糖肽富集与检测方法 | |
| CN103969321B (zh) | 基于固定化酶原位高效酶解法的蛋白鉴定及质谱成像的方法 | |
| Yang et al. | A microscale solid-phase microextraction probe for the in situ analysis of perfluoroalkyl substances and lipids in biological tissues using mass spectrometry | |
| Zhang et al. | Selective detection of phospholipids in human blood plasma and single cells for cancer differentiation using dispersed solid-phase microextraction combined with extractive electrospray ionization mass spectrometry |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20181016 Termination date: 20211208 |