CN105200103B - 一种介孔材料表面蛋白质环冠的选择性酶解方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种介孔纳米粒子表面蛋白质环冠的选择性酶解方法。它省略了酶解前的蛋白质变性、还原及烷基化反应，减少了因蛋白质变性从介孔孔道内的流出，并利用介孔材料的排阻效应，通过将磁性固定化酶用于介孔材料表面蛋白质环冠的酶解和分析。该方法首次实现了介孔材料表面吸附的蛋白质环冠的选择性酶解和分析，在消除了介孔纳米材料孔道内吸附蛋白质的干扰的同时，达到了高效选择性酶解和分析介孔材料表面蛋白质环冠的目的，对于我们正确理解作为药物载体、基因载体等的介孔纳米材料在与生物体相互作用时在生物体内的分布、堆积及排出产生重要的影响及其对生物体产生的影响等具有非常重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物纳米医药领域，具体涉及一种介孔材料表面蛋白质环冠的选择性酶解方法。
背景技术
近年来，纳米材料因其独特的性质被广泛用作药物和基因载体。研究表明，纳米材料可以综合多靶向定位，传感，诊断和治疗等功能于一体且几乎可以到达生物体的任何部位，从而进入肿瘤细胞内部进而杀死肿瘤细胞(文献1.Moghimi,S.M.；Hunter,A.C.；Murray,J.C.Nanomedicine:Current status and future prospects,Faseb Journal，2005,19,311-330.)。然而，当纳米材料进入生理环境(血液或细胞)时，其表面会迅速被蛋白质覆盖，形成蛋白质环冠(文献2.Lynch,I.；Dawson,K.A.Protein-nanoparticleinteractions,Nano Today2008,3,40-47.文献3.Lundqvist,M.；Stigler,J.；Elia,G.；Lynch,I.；Cedervall,T.；Dawson,K.A.Nanoparticle size and surface propertiesdetermine the protein corona with possible implications for biologicalimpacts,Proc.Natl.Acad.Sci.2008,105,14265-14270.)。由于蛋白质环冠在纳米材料表面的吸附，使得材料的尺寸、聚集状态及其表面性质发生改变，同时导致其生物识别性质区别于材料的自身性质(材料合成时所具有的表面化学性质、大小、形状)(文献4.Lynch,I.；Salvati,A.；Dawson,K.A.Protein-nanoparticle interactions what does the cellsee？,Nat.Nanotechnol.2009,4,546-547.)。纳米材料的生物识别性质是被生物大分子、细胞、生物界面等识别的材料的形态，决定了材料在生理系统内的运输和活性等，更是引起纳米材料在生物体内的生理反应的决定因素(文献5.Nel,A.E.,et al.,Understandingbiophysicochemical interactions at the nano-bio interface,Nat.Mater.,2009,8,543-55.)。只有真正了解纳米材料与蛋白质之间的相互作用机制才能有效的控制纳米材料在生命医药领域的应用，否则可能会导致其错误的靶向正常细胞引起生物体的毒性，因此，有效的控制纳米材料与生命系统之间的相互作用是纳米药物面临的最基本的考验。
介孔材料因其独特的性质被广泛用于药物载体、基因载体等生物医药领域(文献6.Yang,M.；Li,H.；Javadi,A.；Gong,S.,Multifunctional mesoporous silicananoparticles as labels for the preparation of ultrasensitive electrochemicalimmunosensors,Biomaterials,2010,31,3281-3286.文献7.Meng,H.；Mai,W.X.；Zhang,H.；Xue,M.；Xia,T.；Lin,S.；Wang,X.；Zhao,Y.；Ji,Z.；Zink,J.I.；Nel,A.E.,Codelivery ofan optimal drug/sirna combination using mesoporous silica nanoparticles toovercome drug resistance in breast cancer in vitro and in vivo,Acs Nano,2013,7,994-1005.)，但是对于介孔材料在生理环境中表面形成的蛋白质环冠的分析却未见报道。这是由于介孔材料在进入生物系统后，系统中的蛋白质不但会吸附在纳米粒子的外表面，同时还会进入介孔孔道的内部从而保留在孔道内部(文献8.Lu,S.；Song,Z.H.；He,J.,Diffusion-controlled protein adsorption in mesoporous silica,J.Phys.Chem.B,2011,115,7744-7750.文献9.Han,Y.J.；Stucky,G.D.；Butler,A.,Mesoporous silicatesequestration and release of proteins,J.Am.Chem.Soc.,1999,121,9897-9898.文献10.Slowing,II；Trewyn,B.G.；Lin,V.S.Y.,Mesoporous silica nanoparticles forintracellular delivery of membrane-impermeable proteins,J.Am.Chem.Soc.,2007,129,8845-8849.)，而决定纳米粒子生物识别性质的是材料外表面吸附的蛋白质环冠，因此要实现对介孔材料表面蛋白质环冠的分析和鉴定，必须选择性地对介孔材料表面吸附的蛋白质进行酶解和质谱鉴定，从而消除孔道内部吸附蛋白质的影响，这为介孔材料表面蛋白质环冠的分析提出了难题。而目前对纳米粒子表面蛋白质环冠的分析和鉴定主要是通过先用表面活性剂，如SDS等，将蛋白质从纳米材料表面洗脱下来，然后利用有机溶剂如乙腈、丙酮等将蛋白质过夜沉淀(文献11.Tenzer,S.；Docter,D.；Rosfa,S.；Wlodarski,A.；Kuharev,J.；Rekik,A.；Knauer,S.K.；Bantz,C.；Nawroth,T.；Bier,C.；Sirirattanapan,J.；Mann,W.；Treuel,L.；Zellner,R.；Maskos,M.；Schild,H.；Stauber,R.H.,Nanoparticlesize is a critical physicochemical determinant of the human blood plasmacorona:A comprehensive quantitative proteomic analysis,Acs Nano,2011,5,7155-7167.)或者SDS-PAGE(文献12.Sund,J.；Alenius,H.；Vippola,M.；Savolainen,K.；Puustinen,A.,Proteomic characterization of engineered nanomaterial-proteininteractions in relation to surface reactivity,Acs Nano,2011,5,4300-4309.文献13.Lundqvist,M.；Stigler,J.；Elia,G.；Lynch,I.；Cedervall,T.；Dawson,K.A.,Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona withpossible implications for biological impacts,Proc.Natl.Acad.Sci.,2008,105,14265-14270.)将蛋白质从SDS的洗脱液中分离出来，然后再通过将蛋白质溶解经溶液酶解或胶内酶解的方式进行质谱分析。但是对介孔材料而言，当使用SDS洗脱时，孔道内部吸附的蛋白质会随同表面吸附的蛋白质一起洗脱下来，干扰检测。而近期出现的用胰蛋白酶“在材料上原位酶解”蛋白质环冠的方法(文献14.Zhang,H.；Burnum,K.E.；Luna,M.L.；Petritis,B.O.；Kim,J.-S.；Qian,W.-J.；Moore,R.J.；Heredia-Langner,A.；Webb-Robertson,B.-J.M.；Thrall,B.D.；Camp,D.G.,II；Smith,R.D.；Pounds,J.G.；Liu,T.,Quantitative proteomics analysis of adsorbed plasma proteins classifiesnanoparticles with different surface properties and size，Proteomics，2011,11，4569-4577.)，也不适用于孔径较大的介孔材料(孔径大于trypsin的尺寸大小，3.8×3.8×3.8nm3)，这是由于材料的孔径大于trypsin的大小时，trypsin可以进入孔道内部并对孔道内的蛋白质进行酶解(文献15.Min,Q.；Wu,R.a.；Zhao,L.；Qin,H.；Ye,M.；Zhu,J.-J.；Zou,H.,Size-selective proteolysis on mesoporous silica-based trypsin nanoreactorfor low-mw proteome analysis，Chem.Commun.，2010,46:6144-6146.)，而且用trypsin进行酶解时需要过夜酶解，而长时间的酶解过程中孔道内的蛋白质也会不断从孔道内扩散出来，从而会干扰介孔材料表面蛋白质环冠的分析。最近，Hu等提出的将磁性固定化酶用于无孔纳米材料表面蛋白质环冠的快速分析(文献16.Hu Z.Y.,Zhao L.,Zhang H.Y.,ZhangY.,Wu R.A.,Zou H.F.,The On-bead Digestion of Protein Corona on Nanoparticleby Trypsin Immobilized on a Magnetic Nanoparticle[J].J.Chromatogr.A2014,1334:55-63.)，发现磁性固定化酶酶解1h后得到的鉴定结果要优于游离trypsin过夜酶解的鉴定结果，这一发现为介孔纳米材料表面蛋白质环冠的分析提供了可能性。
发明内容
本发明目的在于提供一种高效可靠的介孔纳米材料表面蛋白质环冠的选择性酶解方法，该方法利用介孔材料的体积排阻效应，将大于介孔材料孔道内径(2～50nm)的磁性固定化酶(～250nm)用于介孔纳米材料外表面吸附的蛋白质的选择性酶解，首次实现了介孔纳米材料表面吸附的蛋白质环冠的选择性酶解和分析，消除了吸附在介孔材料孔道内部的蛋白质的影响，对于我们正确理解作为药物载体、基因载体等的介孔纳米材料在与生物体相互作用时在生物体内的分布、堆积及排出产生重要的影响及其对生物体产生的影响等具有非常重要的意义。
所述的介孔纳米材料表面蛋白质环冠的选择性酶解方法，所述的介孔材料表面蛋白质环冠的选择性分析是通过在材料上原位酶解的方法来实现的。
所述的介孔纳米材料表面蛋白质环冠的选择性酶解方法，所述介孔材料表面蛋白质环冠的选择性分析是利用介孔材料的排阻效应来实现的。
所述的介孔纳米材料表面蛋白质环冠的选择性酶解方法，所述的介孔材料表面蛋白质环冠的选择性分析需要通过固定化酶酶解的方法来实现。
所述的介孔纳米材料表面蛋白质环冠的选择性酶解方法，所述的固定化酶原位酶解介孔材料表面蛋白质环冠的方法在酶解时不需要使用变性剂尿素或盐酸胍对蛋白质进行变性。
所述的介孔纳米材料表面蛋白质环冠的选择性酶解方法，所述的固定化酶原位酶解介孔材料表面蛋白质环冠的方法在酶解时需要省略二硫苏糖醇(DTT)/碘代乙酰胺(IAA)的还原和烷基化反应。
所述的介孔纳米材料表面蛋白质环冠的选择性酶解方法，所述的固定化酶原位酶解介孔材料表面蛋白质环冠的方法使用的固定化酶是通过将trypsin固载在磁性纳米材料上制成的。
所述的介孔纳米材料表面蛋白质环冠的选择性酶解方法，所述的介孔材料表面蛋白质环冠的分析方法中使用的固定化酶是通过将trypsin固载在包覆了二氧化硅层的磁性纳米材料上制成的。
所述的介孔纳米材料表面蛋白质环冠的选择性酶解方法，所述的介孔材料表面蛋白质环冠的分析方法中使用的固定化酶在合成时可以通过戊二醛交联固定法或EDC交联固定法将trypsin固载在包覆了二氧化硅层的磁性纳米材料上。
本发明所述介孔纳米材料表面蛋白质环冠的选择性酶解方法，具体步骤为：将100μg表面吸附了蛋白质环冠的介孔纳米材料分散在含200μL50mMNH4HCO3溶液中，加入10μg磁性固定化酶，在恒温振荡器上37±0.5℃进行原位酶解，酶解时间为1±0.1h。酶解反应完成后，利用磁铁将磁性固定化酶从介孔材料及蛋白质环冠酶解液中分离出来，经过离心去除介孔材料，即得到介孔材料表面蛋白质环冠的酶解肽段，，即可进行液相色谱质谱分析鉴定。
由质谱鉴定结果即可得到介孔纳米材料表面吸附的蛋白质环冠的信息，对于分析纳米材料在与细胞相互作用时其表面蛋白质环冠的变化情况及其细胞对于纳米材料的响应等具有非常重要的意义，为推进纳米药物的真正实现作出了贡献。
本发明的优点：
该介孔纳米材料表面蛋白质环冠的选择性酶解方法，在酶解前省略了对蛋白质的变性步骤及还原和烷基化反应步骤，减少了因蛋白质结构的破坏而导致的介孔材料孔道内部吸附蛋白质的流出，并利用介孔材料的体积排阻效应，首次通过固定化酶原位酶解的方法实现了介孔纳米材料表面吸附的蛋白质环冠的选择性酶解和分析。而且由于没有使用尿素等变性剂，该方法酶解后收集的肽段可直接用于质谱分析和鉴定，操作简便。该方法实现的对介孔材料表面蛋白质环冠的分析，对于我们正确理解作为药物载体、基因载体等的介孔纳米材料在与生物体相互作用时在生物体内的分布、堆积及排出产生重要的影响及其对生物体产生的影响等具有非常重要的意义。
附图说明
下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1介孔纳米材料表面蛋白质环冠的分析方法流程图。
图2介孔硅纳米材料表面由BSA和cytochrome C组成的蛋白质环冠经磁性固定化酶原位酶解前(A)后(B)表面的蛋白质分布的SDS-PAGE图。
图3介孔硅纳米材料表面由BSA和lysozyme组成的蛋白质环冠经磁性固定化酶原位酶解前(A)后(B)表面的蛋白质分布的SDS-PAGE图。
图4介孔硅纳米粒子表面吸附的血浆蛋白质环冠经磁性固定化酶原位酶解前(A)后(B)的SDS-PAGE图。
具体实施方式
磁性固定化酶的制备(戊二醛法)：取2.70g FeCl3·6H2O溶于100mL的乙二醇中，机械搅拌得到黄色透明溶液，然后加入7.20g无水NaAc，机械搅拌0.5h后，将所得溶液转入200mL的Teflon内衬的不锈钢反应釜中，200℃下反应8h；反应完毕，取出反应釜，冷却至室温，所得磁性材料用30mL乙醇和30mL水各洗3次，以除去醋酸钠和乙二醇等水溶性杂质；60℃干燥过夜获得Fe3O4颗粒；称取0.5g Fe3O4颗粒，分散在50mL的浓度为0.1M的稀盐酸中，超声10min。用磁铁分离除去盐酸溶液，再用去离子水清洗三次；将经过表面处理的磁性Fe3O4颗粒分散到160mL乙醇、40mL水和2.0mL的浓氨水中，搅拌10min，加入1.0mL的TEOS，室温搅拌6.0h后，在磁铁的帮助下分离磁性颗粒，并用50mL无水乙醇清洗3次，得到包覆了SiO2层的Fe3O4@SiO2,然后把Fe3O4@SiO2分散到60mL的异丙醇中，加入1.0mL的APTES，室温下机械搅拌24h，经无水乙醇清洗后，得到氨基修饰的Fe3O4@SiO2纳米粒子(即Fe3O4@SiO2@NH2)；将3mgFe3O4@SiO2@NH2纳米颗粒分散在200μL PBS缓冲液中，加入200μL戊二醛溶液(25％，wt)，在震荡下反应1.5h，使纳米颗粒表面被醛基活化；经醛基活化的磁性纳米材料用PBS缓冲液清洗3次后，加入到含0.6mg的胰蛋白酶和1％(w/v)NaBH3CN的PBS缓冲液中，在室温下震荡反应3h；除去酶溶液，计算固定到磁性材料上的trypsin用量(65μg/mg)，加入1.0mL含0.75％(w/v)甘氨酸和1％NaBH3CN的PBS缓冲液中，在室温下震荡反应1h；反应后，用PBS缓冲液清洗5次，然后将固定化酶按照2mg/mL磁性材料的浓度分散在1.5mL含0.02％(w/v)NaN3的PBS缓冲溶液中，并置于4℃下保存。
所获取固定化酶的尺寸250-300nm。
实施例1
将4mg牛血清白蛋白(BSA)与4mg细胞色素C(cytochrome C)溶解于2mL50mMNH4HCO3(pH8.2)缓冲液中配制成2mg/mL的标准蛋白混合溶液，冷藏备用。取100μL分散在PBS(0.2％，wt)中的介孔硅纳米材料(MSNs，孔径约为6nm)纳米粒子加入200μL上述的标准蛋白混合溶液中，在震荡条件下37℃孵育1h，制备表面吸附了BSA与cytochrome C的蛋白质环冠的介孔硅纳米粒子。此处为了减少尿素溶液及DTT/IAA处理对MSNs介孔孔道内吸附蛋白质构型的影响，从而减少低分子量蛋白质因构型变化而从孔道内的流出，在酶解过程中省略尿素溶液及DTT/IAA处理的步骤，将得到的表面具有混合标准蛋白组成的蛋白质环冠的MSNs纳米粒子用PBS缓冲液洗涤三次后，直接分散在50mM NH4HCO3的溶液中。然后加入10μg磁性固定化酶来酶解纳米粒子外表面吸附的标准蛋白组成的蛋白质环冠，37℃反应1h。反应完毕，将磁铁放在离心管外壁，吸出样品酶解液，收集酶解后的MSNs纳米材料并将其分散在SDS-PAGE上样缓冲液中，对MSNs材料表面酶解后剩余的蛋白质进行SDS-PAGE分析。
经SDS-PAGE分离和考马斯亮蓝染色后，发现介孔硅纳米材料与BSA(5×7×7nm3)与cytochrome C(2.6×3.2×3.3nm3)的混合溶液孵育后，表面会吸附BSA和cytochrome C组成蛋白质环冠(附图2A)。而且，由于cytochrome C的尺寸小于介孔材料的孔径大小，会同时吸附在材料的外表面及介孔孔道内部。因此，经磁性固定化酶原位酶解后，如附图2B所示，较大尺寸的只吸附在材料表面的蛋白质BSA条带消失，即被完全酶解，而较小尺寸的同时吸附在材料表面和孔径内的cytochrome C条带强度降低，即吸附在材料表面的蛋白质被酶解，而孔道内吸附的蛋白质被保留下来，实现了介孔材料表面蛋白质环冠的高效选择性酶解。
实施例2
将4mg牛血清白蛋白(BSA)与4mg溶菌酶蛋白(lysozyme)溶解于2mL50mM NH4HCO3(pH8.2)缓冲液中配制成2mg/mL的标准蛋白混合溶液，冷藏备用。取100μL分散在PBS(0.2％，wt)中的介孔硅纳米粒子(MSNs，孔径约为6nm)加入200μL上述的标准蛋白混合溶液中，在震荡条件下37℃孵育1h，制备表面吸附了BSA与lysozyme的蛋白质环冠的MSNs纳米粒子。此处为了减少尿素溶液及DTT/IAA处理对MSNs介孔孔道内吸附蛋白质构型的影响，从而减少低分子量蛋白质因构型变化而从孔道内的流出，在酶解过程中省略尿素溶液及DTT/IAA处理的步骤，将得到的表面具有混合标准蛋白组成的蛋白质环冠的MSNs纳米粒子用PBS缓冲液洗涤三次后，直接分散在50mMNH4HCO3的溶液中。然后加入10μg磁性固定化酶来酶解纳米粒子外表面吸附的标准蛋白组成的蛋白质环冠，37℃反应1h。反应完毕，将磁铁放在离心管外壁，吸出样品酶解液，收集酶解后的MSNs纳米材料并将其分散在SDS-PAGE上样缓冲液中，对MSNs材料表面酶解后剩余的蛋白质进行SDS-PAGE分析。
经SDS-PAGE分离和考马斯亮蓝染色后，发现介孔硅纳米材料与BSA(5×7×7nm3)与lysozyme(1.9×2.5×4.3nm3)的混合溶液孵育后，表面会吸附BSA和lysozyme组成蛋白质环冠(附图3A)。而且，由于lysozyme的尺寸小于介孔材料的孔径大小，不但会吸附在材料的表面，同时还会进入孔道内部。因此，经磁性固定化酶原位酶解后，如附图3B所示，较大尺寸的只吸附在材料表面的蛋白质BSA条带消失，即被完全酶解，而较小尺寸的同时吸附在材料表面和孔径内的lysozyme条带强度降低，则说明材料外表面吸附的lysozyme被完全酶解而孔道内部的则被保留下来，实现了介孔材料表面蛋白质环冠的高效选择性酶解。
实施例3
将100μL分散在PBS缓冲液中的介孔硅纳米粒子(MSNs，孔径约为6nm)与100μL人血浆在恒温振荡器上37℃孵育1h制备表面吸附牛血清蛋白质环冠的MSNs纳米粒子。然后，离心收集表面吸附了牛血清蛋白质的MSNs纳米材料，用PBS洗涤三次后，将其分散于包含50mMNH4HCO3的溶液中，直接加入10μg磁性固定化酶在37℃酶解1h。反应完毕，将磁铁放在离心管外壁，吸出并收集样品酶解液，离心收集酶解后的MSNs纳米粒子，进行SDS-PAGE分析。
附图4A为介孔硅纳米材料表面及介孔孔道内吸附的血浆蛋白质分布，经磁性固定化酶原位酶解后，将酶解后的介孔硅纳米材料收集起来并经SDS-PAGE分离和考马斯亮蓝染色(附图4B)，发现介孔硅纳米材料外表面吸附的高分子量的蛋白质被完全酶解，而进入到孔道内部的低分子量端蛋白质被保留(尺寸较小)，说明该方法实现了介孔材料表面吸附的血浆蛋白质环冠的高效选择性酶解。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
本发明介孔纳米材料表面蛋白质环冠的选择性酶解方法可在介孔纳米材料表面形成的蛋白质环冠的选择性分析方面应用。它省略了酶解前的蛋白质变性、还原及烷基化反应，减少了因蛋白质变性从介孔孔道内的流出，该方法利用介孔材料的体积排阻效应，通过将磁性固定化酶用于介孔材料表面蛋白质环冠的酶解和分析。首次实现了介孔纳米材料外表面吸附的蛋白质环冠的选择性酶解和分析，消除了进入并吸附在介孔孔道内部的蛋白质的影响，达到了高效选择性酶解和分析介孔材料表面蛋白质环冠的目的。这对于我们理解介孔纳米材料在作为药物/基因载体等与生物体相互作用时蛋白质环冠对于其在生物体内的分布、堆积及排出等产生的影响具有非常重要的意义。
Claims (3)
1.一种介孔纳米材料表面蛋白质环冠的选择性酶解方法，其特征在于：所述蛋白质环冠的选择性酶解是利用介孔材料的排阻效应、通过固定化酶在介孔材料表面进行的原位酶解；所述固定化酶为胰蛋白酶固载在尺寸大于50 nm且小于500 nm的包覆了二氧化硅层的磁性纳米材料上制成的；所述介孔材料的孔道特征为大于2nm且小于50nm；
所述的固定化酶原位酶解介孔材料表面蛋白质环冠的方法在酶解时不需要使用变性剂尿素或盐酸胍对蛋白质进行变性以减少因蛋白质变性导致的孔道内部吸附蛋白质的流出；
所述的固定化酶原位酶解介孔材料表面蛋白质环冠的方法在酶解时需要省略二硫苏糖醇（DTT）/碘代乙酰胺（IAA）的还原和烷基化反应，以减少因蛋白质结构破坏而引起的孔道内部吸附蛋白质的流出。
2.按照权利要求1所述的选择性酶解方法，其特征在于：所述的介孔材料表面蛋白质环冠的选择性酶解方法中使用的固定化酶在合成时通过戊二醛交联固定法或EDC交联固定法将胰蛋白酶固载在包覆了二氧化硅层的磁性纳米材料上。
3.按照权利要求 1或2所述的选择性酶解方法，其特征在于：
（1）将100 μg表面吸附了蛋白质环冠的介孔纳米材料分散在含200 μL 50 mM NH4HCO3溶液中，加入10 μg 磁性固定化酶，在恒温振荡器上37±0.5 ℃进行原位酶解，酶解时间为1±0.1 h；
（2）酶解反应完成后，利用磁铁将磁性固定化酶从介孔材料及蛋白质环冠酶解液中分离出来，经过离心去除介孔材料，即得到介孔材料表面蛋白质环冠的酶解肽段；
（3）酶解肽段经除盐、冻干后，用质量浓度0.1%的甲酸水溶液复溶，即直接进行液相色谱质谱分析鉴定。
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| On-plate digestion of proteins using novel trypsin-immobilized magnetic nanospheres for MALDI-TOF-MS analysis;Yan Li等;《Proteomics》;20071020;第7卷(第20期);第3663页左栏第1段 * |
| Qianhao Min等.Size-selective proteolysis on mesoporous silica-based trypsin nanoreactor for low-MW proteome analysis.《Chemical Communications》.2010,第46卷第6144页摘要，第6146页右栏第2段. * |
| Size-selective proteolysis on mesoporous silica-based trypsin nanoreactor for low-MW proteome analysis;Qianhao Min等;《Chemical Communications》;20100727;第46卷;第6144页摘要，右栏第1段，第6145页左栏图1，第6146页右栏第2段 * |
| The on-bead digestion of protein corona on nanoparticles by trypsin immobilized on the magnetic nanoparticle;Zhengyan Hu等;《Journal of Chromatography A》;20140321;第1334卷;第55页最后一段，第56页右栏第1-2段，第2.2小节，第57页左栏第1-3段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105200103A (zh) | 2015-12-30 |
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