CN115779133A - 快速吸水与良好生物相容性的止血冷冻凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速吸水与良好生物相容性的止血冷冻凝胶的制备方法，首先，将壳聚糖以及羟乙基纤维素分别进行改性，获得季铵化壳聚糖和氧化羟乙基纤维素，即QCS和OHEC，然后在‑196～0℃条件下将QCS和OHEC共混搅拌，发生交联反应以及氢键相互作用；其中，QCS主链上氨基、羟基和N‑乙酰氨基与OHEC主链上羟基形成氢键相互作用，而在后续的时间中，QCS主链上氨基与OHEC上醛基会发生希夫碱反应，形成第二重交联，增强冷冻凝胶的力学性能，冷冻干燥后获得冷冻凝胶海绵。通过本方法得到一种超快吸水速率和力学强度优良的冷冻凝胶，具有优异止血性能和良好生物相容性，作为止血材料有良好的前景。
Description
技术领域
本发明涉及医疗材料的技术领域，尤其是指一种快速吸水与良好生物相容性的止血冷冻凝胶的制备方法。
背景技术
出血是各类事故现场中最常见的伤情之一，人体虽然会在出血部位自发的形成血栓来完成止血，但是止血过程相对缓慢，尤其在严重出血情况下无效。如果没有其它手段来干预止血，将会错过最佳的止血时间，即“白金5分钟”。因此在发生创伤后及时使用止血材料完成止血能降低死亡率挽救伤者的生命。理想的止血材料可以模拟、放大和利用止血机制，同时应具有良好的生物相容性、易于存储、易于操作和成本低廉。
低温凝胶化是一种利用冷冻/低温方法制备多孔冷冻凝胶的技术。当含有单体等组分的溶液被冷冻至溶剂结晶温度以下，部分溶剂分子形成结晶，单体等组分被浓缩在一个非冷冻液相微区；高浓度单体在低温下发生聚合凝胶化反应，生成交联聚合物相；反应结束，溶剂晶粒所占据的空间在解冻后形成贯通孔隙。冷冻凝胶相比于水凝胶具有更大的比表面积、大孔结构有利于快速吸水膨胀、细胞渗透和黏附。因此冷冻凝胶以及被用于各种生物医学应用，包括药物输送、组织工程、蛋白质纯化等。冷冻凝胶通常表现出较差的力学性能，当应用于大出血位点时，无法形成坚固的物理屏障，从而影响冷冻凝胶的止血性能。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提出了一种快速吸水与良好生物相容性的止血冷冻凝胶海绵的制备方法，采用氢键相互作用和希夫碱反应的多重交联方式，所得产物具有良好的力学性能，在较大的压缩形变条件下仍能迅速吸水恢复原来形状，并且在出血位点处形成坚固的物理屏障，阻止出血；该产物具有快速吸水以及高吸水率的特点，能够在应用于出血位点处迅速吸收血液中的水分，浓缩凝血活性因子，能够利用和放大人体的凝血机制，完成快速止血；且产物具有优良的生物相容性和生物降解性能，不会对组织有刺激性同时能在体内降解，无需二次手术取出，避免对机体的二次损伤。
为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：快速吸水与良好生物相容性的止血冷冻凝胶的制备方法，首先，将壳聚糖以及羟乙基纤维素分别进行改性，获得季铵化壳聚糖和氧化羟乙基纤维素，即QCS和OHEC，然后在-196～0℃条件下将QCS和OHEC共混搅拌，发生交联反应以及氢键相互作用；其中，QCS主链上氨基、羟基和N-乙酰氨基与OHEC主链上羟基形成氢键相互作用，而在后续的时间中，QCS主链上氨基与OHEC上醛基会发生希夫碱反应，形成第二重交联，增强冷冻凝胶的力学性能，冷冻干燥后获得冷冻凝胶海绵。
进一步，所述的快速吸水与良好生物相容性的止血冷冻凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将壳聚糖溶于乙酸溶液，冰乙酸：去离子水的体积比为1：10～100，其中壳聚糖的质量用量为乙酸溶液的0.5％～5％，加入2，3-环氧丙基三甲基氯化铵，其中壳聚糖主链上氨基分子与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵分子摩尔比为1：0.1～1，提高反应温度至40～90℃，反应12～24h后，得到产物经预冷丙酮沉淀提纯，提纯产物再溶解于去离子水中，使用8000～14000透析袋透析3～7天，最后冷冻干燥得到季铵化壳聚糖，即QCS；
将羟乙基纤维素溶解于去离子水中，其中羟乙基纤维素的质量用量为去离子水的0.5％～5％，加入高碘酸钠，其中羟乙基纤维素结构单元与高碘酸钠分子摩尔比为1：0.1～1，提高反应温度至30～50℃，反应8～16h后，加入乙二醇终止反应，使用8000-14000透析袋透析3～7天，最后冷冻干燥得到氧化羟乙基纤维素，即OHEC；
将QCS水相溶液和OHEC水相溶液低温混合，搅拌均匀，得到混合溶液，将混合溶液倒入模具中，于-196～0℃静置成胶，冷冻干燥得到冷冻凝胶海绵。
进一步，所述壳聚糖的分子量为50000～300000，脱乙酰度为85％～95％，QCS接枝率为20％～40％。
进一步，所述羟乙基纤维素的分子量为150～500mpa，OHEC取代度为20％～80％。
进一步，所述QCS水相溶液的质量浓度为0.5～5w/v％。
进一步，所述OHEC水相溶液的质量浓度为0.5～5w/v％。
进一步，将QCS水相溶液和OHEC水相溶液低温搅拌混合时间为30～120min。
进一步，将混合溶液静置成胶时间为12～48h。
本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：
1、本发明所得产物具有优异的生物相容性，避免了使用传统毒性较大的交联剂。
2、本发明所得产物具有超快吸水速率，能够迅速在出血位点处浓缩凝血活性因子，放大人体自身的凝血机制。
3、本发明所得产物具有良好的力学性能，在较大压缩形变条件下，仍能保持完整结构，吸水后能恢复原来形状，利于将产物压缩放入各种器械中，同时方便日常携带。
4、本发明所选用的原料均具有良好生物相容性，无需加入任何交联剂和引发剂，保证了所得产物的无毒性和细胞相容性。
5、本发明所得产物使用简便、易于存储和价格低廉，能够适用于各种极端条件。
附图说明
图1为实施例1中制备季铵化改性的壳聚糖的红外光谱图。
图2为实施例1中制备醛基化改性的羟乙基纤维素的红外光谱图。
图3为实施例1-4中冷冻凝胶微观形貌图。
图4为实施例1-4中冷冻凝胶的快速吸水性能图。
图5为实施例2和实施例3中冷冻凝胶的循环压缩应力应变曲线图；图中，stress表示应力，strain表示应变。
图6为实施例3中冷冻凝胶的细胞毒性结果。
图7为实施例3中冷冻凝胶的溶血性能结果。
图8为实施例3中冷冻凝胶的体外凝血性能结果。
具体实施方式
下面结合多个具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
季铵化壳聚糖的制备：将3g壳聚糖溶解于100mL 1％(v/v)醋酸溶液中，常温下搅拌半小时，随后加入6g 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵，在60℃水浴条件下反应20h。然后将所得产物经丙酮沉淀，去离子水溶解，使用8000-14000Da透析袋透析5天，最后冷冻干燥得到接枝率为34％的季铵化壳聚糖，即QCS。
对上述两种高分子进行红外光谱测试，检测有无新的特征吸收峰生成，确定产物的合成情况。两种高分子的红外光谱图见图1所示。
比较两种高分子的红外光谱图，可以发现QCS的红外光谱图在1476波数处出现了一个全新的吸收峰，此处收缩振动峰为2，3-环氧丙基三甲基氯化铵上三甲基铵上的-C-H振动峰，红外光谱图的结果证明成功在壳聚糖分子链上接枝了季铵盐基团，即成功制备了季铵化壳聚糖。
氧化羟乙基纤维素的制备：将3g羟乙基纤维素溶解在300mL去离子水中，随后加入1.5g高碘酸钠，将反应温度升至40℃，避光反应8h，然后加入1.5mL乙二醇终止反应。最后将所得产物用8000-14000Da透析袋于去离子水中透析3天，最后冷冻干燥得到氧化度为46％的氧化羟乙基纤维素，即OHEC。
对上述两种高分子进行红外光谱测试，检测有无新的特征吸收峰生成，确定产物的合成情况。两种高分子的红外光谱图见图2所示。
比较两种高分子的红外光谱图，发现氧化羟乙基纤维素的红外光谱图在1723波数处出现一个全新的吸收峰，此处收缩振动峰为-C＝O振动峰，红外光谱图的结果证明羟乙基纤维素分子链上发生氧化反应，生成醛基，即成功合成了氧化羟乙基纤维素。
冷冻凝胶的制备：季铵化壳聚糖和氧化羟乙基纤维素溶于去离子水中配置成质量分数为0.5％的水溶液。量取5mLQCS水溶液置于烧杯中，然后加入等量的OHEC水溶液，在冰浴条件下搅拌30min。将混合溶液倒入特定聚四氟乙烯模具中。将模具转移到-10℃冷阱中，反应36h后，冷冻干燥得到冷冻凝胶海绵。
实施例2
与实施例1不同的是，本实施例将季铵化壳聚糖和氧化羟乙基纤维素溶于去离子水中配置成质量分数为2％的水溶液。量取5mLQCS水溶液置于烧杯中，然后加入等量的OHEC水溶液，在冰浴条件下搅拌30min。将混合溶液倒入特定聚四氟乙烯模具中。将模具转移到-10℃冷阱中，反应36h后，冷冻干燥得到冷冻凝胶海绵。
实施例3
与实施例1不同的是，本实施例将季铵化壳聚糖和氧化羟乙基纤维素溶于去离子水中配置成质量分数为3％的水溶液。量取5mLQCS水溶液置于烧杯中，然后加入等量的OHEC水溶液，在冰浴条件下搅拌30min。将混合溶液倒入特定孔板中。将模具转移到-10℃冷阱中，反应24h后，冷冻干燥得到冷冻凝胶海绵。
实施例4
与实施例1不同的是，本实施例将季铵化壳聚糖和氧化羟乙基纤维素溶于去离子水中配置成质量分数为5％的水溶液。量取10mLQCS水溶液置于烧杯中，然后加入等量的OHEC水溶液，在冰浴条件下搅拌30min。将混合溶液倒入注射器中。将模具转移到-10℃冷阱中，反应24h后，冷冻干燥得到冷冻凝胶海绵。
实施例5
将实施例1-4的四种冷冻凝胶海绵切成薄片，用导电胶固定在电镜台上，喷金60s，用钨灯丝扫描电镜进行截面观察。
截面扫描电镜结果如图3所示，几种冷冻凝胶海绵均表现出相互连通的大孔结构，孔径大小都在100～300微米。并且孔径大小随着聚合物含量的提升而减小，聚合物壁都非常光滑，没有明显裂缝。
实施例6
将实施例1-4的两种冷冻凝胶海绵切成圆柱状，称量初始重量W0，随后将上述两种冷冻凝胶海绵放入去离子水，在预定时间取出吸水后的海绵，并用滤纸擦去冷冻凝胶表面的残留水分，称重W1。每组实验重复3次，通过公式计算出冷冻凝胶海绵的吸水率。
吸水率(g/g)＝(W1-W0)/W0
图4是实施例1-4的几种冷冻凝胶海绵的饱和吸水率以及吸水速率。如图所示实施例1-4的几种冷冻凝胶海绵均能在4s左右达到吸水饱和。实施例1的冷冻凝胶海绵的饱和吸水率达到自身重量的67.89倍，实施例4的冷冻凝胶海绵吸水率相较与实施例1有所下降，下降到自身重量的55倍。但是所有冷冻凝胶海绵的饱和吸水率以及吸水速率均明显高于市售的XSTAT止血海绵。
实施例7
将实施例2和实施例3的两种冷冻凝胶海绵切成圆柱状，将样品置于热动态机械分析仪上，设置最大压缩形变为80％，压缩速度为5mm/min，图5是实施例2和实施例3的两种冷冻凝胶海绵的压缩循环应力应变曲线。
如图5所示，两种冷冻凝胶海绵在经历十次压缩循环后均能维持原来形状，并且机械性能没有明显损失。实施例3的冷冻凝胶海绵具有更高的压缩强度，具有更强的机械性能。
实施例8
在48孔板内以10000细胞/每孔的数量种植L929细胞，37℃培养24h后，更换为新鲜的培养基，同时将2mg的实施例3的冷冻凝胶海绵加入孔板内共培养，在培养24h和72h后，移除冷冻凝胶海绵以及培养基，加入MTT工作液孵育2.5h，随后用异丙醇溶解紫色的甲臜，使用酶标仪测其在570nm处的吸光度。其中，对照组为不加冷冻凝胶的完全培养基组。图6是冷冻凝胶海绵的细胞毒性结果。
如图6所示，L929细胞在与冷冻凝胶海绵共孵育24h和72h后，均没有表现出明显的细胞毒性，甚至共培养72h后，冷冻凝胶海绵组OD值略高于对照组。
实施例9
取5mL新采集的羊血，在3000rpm速度下离心10min，弃去上清液，重复离心3次，随后用PBS重悬红细胞，得到红细胞悬浮液。按照500、1000和2000μg称取实施例1的冷冻凝胶海绵，加入到800μlPBS中得到不同浓度的冷冻凝胶海绵悬浮液，随后加入200μl红细胞悬浮液，在37℃下共孵育1h后，以3000rpm的速度离心样品，将100μl上清液转移到96孔板中，测量其在540nm处的吸光度。DW(去离子水)和PBS分别作为阳性和阴性对照。根据以下公式计算溶血率：
溶血率(％)＝(ODsample-ODnegative control)/(ODpositive sample-ODnegative control)*100
ODsample代表样品上清液的吸光度值，ODpositive control代表阳性对照组上清液的吸光度，ODnegative control代表阴性对照组上清液的吸光度。
图7为实施例3冷冻凝胶海绵的溶血率图片。其中阳性对照组为DW组，阴性对照组为PBS组。溶血率按照上述公式计算得出。如图7所示结果，冷冻凝胶组溶血率均低于国际标准的5％，证明冷冻凝胶具有良好的血细胞相容性。
实施例10
将实施例3的冷冻凝胶放在西林瓶中，在37℃预热的100μl复钙化全血，滴加在冷冻凝胶表面，在37℃孵育5min后，用10mL去离子水溶解不稳定的血凝块，在50rpm速度的摇床中摇晃5min，随后使用酶标仪测量上清液在540nm处的吸光度。商用纱布以及明胶海绵作为对照组，海绵的体外凝血指数BCI通过下列公式计算得到。
BCI(％)＝ODsample/ODcontrol*100
ODsample代表样品的吸光度，ODcontrol代表100μl复钙化全血血在37℃孵育5min后，加入10mL DW溶解凝血块测得的吸光度值
图8为实施例3的冷冻凝胶海绵的体外凝血性能图，冷冻凝胶海绵的体外凝血性能优于市售的纱布和明胶海绵。
以上所述实施例只为本发明之较佳实施例，并非以此限制本发明的实施范围，故凡依本发明之形状、原理所作的变化，均应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.快速吸水与良好生物相容性的止血冷冻凝胶的制备方法，其特征在于：首先，将壳聚糖以及羟乙基纤维素分别进行改性，获得季铵化壳聚糖和氧化羟乙基纤维素，即QCS和OHEC，然后在-196～0℃条件下将QCS和OHEC共混搅拌，发生交联反应以及氢键相互作用；其中，QCS主链上氨基、羟基和N-乙酰氨基与OHEC主链上羟基形成氢键相互作用，而在后续的时间中，QCS主链上氨基与OHEC上醛基会发生希夫碱反应，形成第二重交联，增强冷冻凝胶的力学性能，冷冻干燥后获得冷冻凝胶海绵。
2.根据权利要求1所述的快速吸水与良好生物相容性的止血冷冻凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将壳聚糖溶于乙酸溶液，冰乙酸：去离子水的体积比为1：10～100，其中壳聚糖的质量用量为乙酸溶液的0.5％～5％，加入2，3-环氧丙基三甲基氯化铵，其中壳聚糖主链上氨基分子与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵分子摩尔比为1：0.1～1，提高反应温度至40～90℃，反应12～24h后，得到产物经预冷丙酮沉淀提纯，提纯产物再溶解于去离子水中，使用8000～14000透析袋透析3～7天，最后冷冻干燥得到季铵化壳聚糖，即QCS；
将羟乙基纤维素溶解于去离子水中，其中羟乙基纤维素的质量用量为去离子水的0.5％～5％，加入高碘酸钠，其中羟乙基纤维素结构单元与高碘酸钠分子摩尔比为1：0.1～1，提高反应温度至30～50℃，反应8～16h后，加入乙二醇终止反应，使用8000-14000透析袋透析3～7天，最后冷冻干燥得到氧化羟乙基纤维素，即OHEC；
将QCS水相溶液和OHEC水相溶液低温混合，搅拌均匀，得到混合溶液，将混合溶液倒入模具中，于-196～0℃静置成胶，冷冻干燥得到冷冻凝胶海绵。
3.根据权利要求2所述的快速吸水与良好生物相容性的止血冷冻凝胶的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖的分子量为50000～300000，脱乙酰度为85％～95％，QCS接枝率为20％～40％。
4.根据权利要求2所述的快速吸水与良好生物相容性的止血冷冻凝胶的制备方法，其特征在于，所述羟乙基纤维素的分子量为150～500mpa，OHEC取代度为20％～80％。
5.根据权利要求2所述的快速吸水与良好生物相容性的止血冷冻凝胶的制备方法，其特征在于，所述QCS水相溶液的质量浓度为0.5～5w/v％。
6.根据权利要求2所述的快速吸水与良好生物相容性的止血冷冻凝胶的制备方法，其特征在于，所述OHEC水相溶液的质量浓度为0.5～5w/v％。
7.根据权利要求2所述的快速吸水与良好生物相容性的止血冷冻凝胶的制备方法，其特征在于，将QCS水相溶液和OHEC水相溶液低温搅拌混合时间为30～120min。
8.根据权利要求2所述的快速吸水与良好生物相容性的止血冷冻凝胶的制备方法，其特征在于，将混合溶液静置成胶时间为12～48h。
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| CN107383397A (zh) * | 2017-07-26 | 2017-11-24 | 武汉理工大学 | 以氧化羟乙基纤维素为交联剂的透明质酸衍生物自交联水凝胶及其制备方法 |
| CN112156222A (zh) * | 2020-09-22 | 2021-01-01 | 华南理工大学 | 一种止血抗菌促愈合的冷冻凝胶海绵制备方法 |
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