CN107903337A - 具有粘膜粘附性和Pept－1靶向性的一种壳聚糖衍生物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种巯基化壳聚糖衍生物及其制备方法，属于功能性高分子材料合成及应用领域。具体涉及接枝甘氨酰‑肌氨酸的Pept‑1靶向性和接枝谷胱甘肽的粘膜粘附性的壳聚糖衍生物及其具体的制备方法。其由于谷胱甘肽上巯基与粘膜黏蛋白上巯基的相互作用可显著增加药物在粘膜前的滞留时间，且甘氨酰‑肌氨酸的Pept‑1靶向性可增强药物的促渗透作用。

Description

具有粘膜粘附性和Pept-1靶向性的一种壳聚糖衍生物及其制 备方法
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖衍生物及其制备方法，属于功能性高分子材料合成及应用领域。其对粘膜的粘附性和对Pept-1转运蛋白的靶向性通过角膜前滞留试验和对原代人角膜上皮细胞转运实验进行了初步探索。
背景技术
壳聚糖是一种碱性天然多糖，具有生物相容性高、毒性低、可生物降解、不具免疫原性等优异性能，在酸性条件下易溶。壳聚糖分子链上有多个活泼的2-氨基和3/6-羟基，结构修饰后的壳聚糖衍生物具有新的物理化学或生物学特性。壳聚糖阳离子静电荷对生物膜有良好吸附作用和穿透力，可用作某些药物载体，在医疗和制药方面应用前景广阔。
谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的三肽化合物(L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸)，可与壳聚糖主链通过酰胺键连接形成巯基化壳聚糖。巯基化壳聚糖能以谷胱甘肽的游离巯基与细胞表面黏蛋白末端半胱氨酸上巯基通过游离巯基氧化反应或硫交换反应形成共价二硫键，增强对黏膜的黏附能力，从而延长粘膜前滞留时间。本课题组前期研究发现谷胱甘酰-壳聚糖对粘膜具有良好粘附性，刺激性低且可生物降解(Qin ZG，Zhang J，Chi HB，Cao F.J Nanopart Res，2015，17：468.)；此外，巯基化壳聚糖对药物具有高效的促渗透作用。
靶向寡肽转运载体(Pept)属于内流跨膜转运蛋白，是一种质子依赖型的转运蛋白，具有12个跨膜区域和膜外的糖基化结构。目前所知的Pept主要位于上皮细胞的刷状缘膜和基底外侧膜。位于刷状缘膜的Pept有两种常见亚型，即Pept-1和Pept-2。Pept-1主要分布于小肠上皮细胞，同时，有文献表明，人角膜上皮也存在Pept-1转运体。Pept-1亲和力和表达量高，其底物必须含有一个游离的氨基，是目前研究最广泛的靶向转运器。已有研究表明一些分子对肽转运体具有靶向作用，而某些肽类(如寡核苷酸、二肽及三肽)及模拟肽主要利用Pept转运体完成跨膜转运，可用于眼部生物膜的转运。如Majumdar等对多种二肽单酯更昔洛韦前药(L-络氨酰-L-缬氨酸、L-甘胺酰-L-缬氨酸及L-缬氨酰-L-缬氨酸)的玻璃体药动学以及其对兔视网膜组织的Pept-1转运体的靶向作用进行研究，结果表明，与寡肽前药缬氨酰-更昔洛韦相比，二肽前药在视网膜色素上皮的渗透性得到显著性提高[Majumdar S，Kansara V，Mitra AK.2006；22(4)：231-41.]。如专利CN 103204893 A，利用Pept-1靶向拟肽类二酯前药技术提高羧酸类药物口服吸收的方法，通过将羧酸类药物修饰成部分氨基酸-药物类型的前药分子提高其口服吸收效果。本课题组证明以L-缬氨酸和L-缬氨酰缬氨酸进行眼用药物载体的修饰，可达到促进药物在角膜的渗透，增加药物在眼内组织分布的作用(Xu T，Zhang J，Chi H，Cao F.Acta Biomater，2016，36：152-63.)。文献调研二肽甘氨酰-肌氨酸为Pept-1转运体的天然底物，并广泛用于Pept-1转运体转运机制研究中的抑制剂。
经过文献调查，目前还没有关于在壳聚糖活泼氨基端接枝谷胱甘肽和甘氨酰-肌氨酸以达到对粘膜粘附性和Pept-1靶向性功能的研究报道。为了进一步验证具有Pept-1靶向性和对粘膜的粘附性的壳聚糖衍生物的应用范围，本发明选择将接枝后的壳聚糖衍生物与载药的层状双氢氧化物纳米材料(LDH)进行杂化，得到有机/无机杂化-层状双氢氧化物纳米复合物，由角膜前滞留试验和人原代细胞摄取试验验证接枝后的壳聚糖衍生物能显著增加药物在粘膜的滞留时间，且对药物具有高效促渗透作用。
发明内容
本发明公开了一类新的同时具有靶向性和粘膜粘附性的壳聚糖衍生物，以壳聚糖为骨架，2-氨基为修饰位点，通过酰胺键来接枝甘氨酰-肌氨酸和谷胱甘肽，形成新型靶向性粘附性的聚合物。谷胱甘酰-壳聚糖对粘膜具有良好的粘附性，可显著增加药物在粘膜的滞留时间；甘氨酰-肌氨酸作为Pept-1的天然转运底物可通过特异性识别将药物载体转运至生物膜内，达到对药物的高效促渗透作用。
本发明的壳聚糖衍生物为冻干制品，蓬松多孔，微黄块状，易溶于水。
本发明的一个目的是提供上述壳聚糖衍生物的制备方法。
本发明另一个目的是提供上述壳聚糖衍生物在与其他载体杂化中的应用。如本发明的壳聚糖衍生物可与载药的无机纳米材料LDH进行杂化，通过增加对粘膜粘附性和膜上皮Pept-1的特异性识别、主动转运作用来增加药物在膜前的滞留和透过膜吸收的效率，增加生物利用度。
本发明的壳聚糖衍生物的结构为如下：
上式所选用壳聚糖的平均相对分子质量为10～100KDa，所优选壳聚糖的平均相对分子质量25～50KDa。
当壳聚糖：芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酸＝1∶0.5时，所制壳聚糖衍生物甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖的取代度Y为3.4％～8.7％。所制壳聚糖衍生物甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖-谷胱甘肽的巯基含量为288.3μmol/g～431.27μmol/g。
当壳聚糖：芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酸＝1∶1时，所制壳聚糖衍物甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖的取代度Y为3.4％～14.2％。所制壳聚糖衍生物甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖-谷胱甘肽的巯基含量为287.0μmol/g～459.46μmol/g。
本发明壳聚糖衍生物的合成路线如下：合成反应制得芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酸，所得产物与壳聚糖反应制得芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖，随后对上一步所得产物脱保护除去芴甲氧羰酰基得甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖，谷胱甘肽通过酰胺键与甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖上的2-氨基反应制得甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖-谷胱甘肽(CG-GS)。
壳聚糖衍生物简单的合成路线为：
本发明壳聚糖衍生物的制备条件：a)二氧己环，H2O，NaHCO3，芴甲氧羰酰氯，冰浴；b)EDC，DMSO，NHS，冰浴；c)H2O，哌啶，HCl；d)H2O，HCl，EDC，NHS，谷胱甘肽。
本发明壳聚糖衍生物的制备方法具体如下：
a.甘氨酰-肌氨酸溶于反应溶剂中；并称取适量NaHCO3加入上述溶液中，室温搅拌至溶液澄清。芴甲氧羰酰氯溶于反应溶剂中，在冰浴条件下缓慢加入到上述溶液中并搅拌，以薄层色谱(TLC)监测反应完全后，除去反应溶剂，调节产物pH；乙酸乙酯萃取得有机相并以无水硫酸钠干燥得油状粗品，后以二氯甲烷：甲醇为洗脱液过硅胶色谱柱得油状产物。重结晶得中间体芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酸。
b.壳聚糖用HCl溶胀后，加入去离子水溶解，并调节pH。称取适量的芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酸与碳化二亚胺盐酸盐(EDC)溶于反应溶剂中，与活化剂N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液混合，室温下搅拌活化。随后在冰浴条件下，滴入至壳聚糖溶液中，调节pH。N2保护下，室温搅拌反应一定时间，反应液用中速滤纸抽滤后进行透析，冷冻干燥，即得中间体芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖。
c.芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酸-壳聚糖样品分散于反应介质中，加入一定量哌啶，搅拌反应一段时间，以有机溶剂萃取洗涤，加入少量HCl溶解后对水避光透析，冷冻干燥，即得中间体甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖。
d.甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖样品溶于反应溶剂中。加入EDC、NHS进行活化后，加入还原型谷胱甘肽，以NaOH溶液，调节pH。N2保护下室温避光反应，反应液用中速滤纸抽滤，滤液分别对HCl溶液、含NaCl的HCl溶液室温避光透析，透析后以NaOH溶液调节pH，冷冻干燥，即得终产物CG-GS。
附图说明
图1为验证性试验PRN的纳米复合滴眼液在家兔角膜前滞留行为。
图2为验证性试验载药杂化纳米复合物在原代人角膜上皮细胞中定量摄取。
图3为验证性试验不同的内吞抑制剂对CG-GS-FITC-LDH纳米复合物细胞摄取的抑制作用。
图4为验证性试验不同浓度的甘氨酰-肌氨酸对CG-GS-FITC-LDH杂化纳米复合物细胞摄取的影响。
具体实施方式
平均相对分子质量25～50KDa的壳聚糖脱乙酰度在95％以上，透析袋截留分子量为8000～14000Da。
实施例1
壳聚糖：芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酸＝1∶0.5时，CG-GS的合成
1.芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酸的合成
称取1.0g甘氨酰-肌氨酸溶于二氧己环及纯水中；并称取1.15g NaHCH3加入至上述溶液中，室温搅拌至溶液澄清。称取2.77g芴甲氧羰基碳酸酯溶于二氧己环中，在冰浴条件下逐渐缓慢加入到上述溶液中，搅拌20min。以薄层色谱(TLC)监测反应完全后，减压除去反应溶剂，并调节产物pH到5.0，以乙酸乙酯萃取3次后得有机相并以无水硫酸钠干燥；去除有机溶剂后得到油状粗品，以二氯甲烷∶甲醇＝70∶1-10∶1为洗脱液得到油状产物。最后以石油醚和丙酮重结晶得芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酸。
2.甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖的合成
称取0.6g壳聚糖(平均相对分子质量为50KDa)用HCl溶胀，加入去离子水超声至溶解，以1M NaOH调节pH至5.0。称取0.6864g芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酸与1.43g EDC溶于DMSO溶液中，室温搅拌活化，加入NHS的DMSO溶液混合，在冰浴条件下，再滴入至壳聚糖溶液中混合，以1M NaOH调节pH至5.0。N2保护下，室温搅拌反应一定时间，取出反应液，用中速滤纸抽滤，滤液置8～14KDa透析袋中，对去离子水室温避光透析两天，冷冻干燥，即得芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖。
称取50mg芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖样品分散于8mL反应介质中，加入30μL哌啶，搅拌反应一段时间，加入4mL有机溶剂萃取/洗涤2-3次，加入少量0.1M HCl溶解后对水透析两天，冷冻干燥，即得甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖。
3.CG-GS的合成
称取0.5g甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖用去离子水溶解，加少量HCl助溶，得甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖溶液。分别称取适量EDC、NHS以及谷胱甘肽，分别溶于5mL去离子水中，依次滴入甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖溶液中，以NaOH调节pH至5.0。N2保护下室温避光反应18h，反应液取出，用中速滤纸抽滤，滤液分别对5mmol/L HCl溶液室温避光透析、含1％NaCl的5mmol/LHCl溶液室温避光透析以及1mmol/L HCl溶液室温避光透析，透析后以1M NaOH调节pH至5.0，冷冻干燥，即得CG-GS。
根据1H NMR中H的积分面积可以计算出甘氨酰-肌氨酸的取代度为12.50％；由Ellman’s试剂法测定产物中巯基的含量的方法测得巯基含量为352.32μmol/g。
实施例2
壳聚糖：芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酸＝1∶1时，CG-GS的合成
1.芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酸的合成
称取1.0g甘氨酰-肌氨酸溶于二氧己环及纯水中；并称取1.15g NaHCH3加入至上述溶液中，室温搅拌至溶液澄清。称取2.77g芴甲氧羰基碳酸酯溶于二氧己环溶剂中，在冰浴条件下逐渐缓慢加入到上述溶液中，搅拌20min。以薄层色谱(TLC)监测反应完全后，减压除去反应溶剂，并调节产物pH到5.0，以乙酸乙酯萃取3次后得有机相并以无水硫酸钠干燥；去除有机溶剂后得到油状粗品，以二氯甲烷∶甲醇＝70∶1-10∶1为洗脱液得到油状产物。最后以石油醚和丙酮重结晶得芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酸。
2.甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖(甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖)的合成
称取0.6g壳聚糖(平均相对分子质量为50KDa)用HCl溶胀，加入去离子水超声至溶解，以NaOH调节pH至5.0。称取1.3728g芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酸与1.43g EDC溶于DMSO溶液中，室温搅拌活化，加入NHS的DMSO溶液混合，在冰浴条件下，再滴入至壳聚糖溶液中混合，以NaOH调节pH至5.0。N2保护下，室温搅拌反应一定时间，取出反应液，用中速滤纸抽滤，滤液置8～14KDa透析袋中，对去离子水室温避光透析两天，冷冻干燥，即得芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖。
称取50mg芴甲氧羰酰-甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖样品分散于8mL反应介质中，加入30μL哌啶，搅拌反应一段时间，加入4mL有机溶剂萃取/洗涤2-3次，加入少量0.1M HCl溶解后对水透析两天，冷冻干燥，即得甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖。
3.CG-GS的合成
称取0.5g甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖用去离子水溶解，加少量HCl助溶，得甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖溶液。分别称取适量EDC、NHS以及谷胱甘肽，分别溶于5mL去离子水中，依次滴入甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖溶液中，以NaOH调节pH至5.0。N2保护下室温避光反应18h，反应液取出，用中速滤纸抽滤，滤液分别对5mmol/L HCl溶液室温避光透析、含1％NaCl的5mmol/LHCl溶液室温避光透析以及1mmol/L HCl溶液室温避光透析，透析后以1M NaOH调节pH至5.0，冷冻干燥，即得CG-GS。
根据1H NMR中H的积分面积可以计算出甘氨酰-肌氨酸的取代度为4.52％；由Ellman’s试剂法测定产物中巯基的含量的方法测得巯基含量为431.27μmol/g。
验证性试验
本课题设计合成了以Pept-1转运体的天然底物二肽甘氨酰-肌氨酸为靶头的巯基化壳聚糖衍生物——CG-GS；其次，选择甘氨酰-肌氨酸的取代度为4.52％，巯基含量为431.27μmol/g的CG-GS；以吡诺克辛钠(PRN)为模型药物，通过共沉淀法将CG-GS与PRN共插层于LDH双层中，制备得到CG-GS-PRN-LDH杂化纳米复合物；并对制备的CG-GS-PRN-LDH杂化纳米复合物滴眼液考察其角膜前滞留行为，在细胞水平上研究其在原代人角膜上皮的摄取行为。
角膜前滞留行为的考察
采用共沉淀法分别制备CG-GS(1∶1)接枝率相同但CG-GS投料量不同的CG-GS-PRN-LDH杂化纳米复合物。
将Mg(NO3)2·6H2O和Al(NO3)3·9H2O，溶于反应溶剂中，得到混盐溶液。NaOH溶于反应溶剂中，得到碱液。超声溶解适量药物PRN，调节pH至9.0。将pH为9.0的CG-GS溶液滴加至药物溶液中。在0℃和氮气保护下同步向反应介质中滴加混盐溶液和碱液，反应体系的pH维持9～10之间。搅拌反应1h后，反应液反复离心、洗涤，除去未反应的离子和药物。沉淀用水重悬并在100℃下熟化5h，得CG-GS-PRN-LDH杂化纳米复合物混悬液。冷冻干燥，得CG-GS-PRN-LDH杂化纳米复合物粉末。
以仅含PRN的药物溶液作为介质，其余步骤同CG-GS-PRN-LDH杂化纳米复合物粉末的制备，制得PRN-LDH粉末，记作PRN-LDH粉末。
首先制备CG-GS-PRN-LDH杂化纳米复合物滴眼液。每组家兔左眼结膜囊(N＝6)分别给予50μL PRN市售制剂及CG-GS接枝率相同，CG-GS投料量不同的CG-GS-PRN-LDH杂化纳米复合物滴眼液(PRN浓度：50μg/mL)，右眼滴入生理盐水为对照。滴眼后，分别于固定时刻用毛细管取家兔泪液进行处理，通过液相色谱仪测定泪液中的PRN浓度。
实验结果：
比较不同CG-GS(1∶1)投料量的CG-GS-PRN-LDH杂化纳米复合物滴眼液在家兔角膜前的滞留行为，同时与Commercial product，PRN-LDH纳米粒滴眼液进行对比，结果如图1。
由上述结果，与市售制剂组及PRN-LDH纳米粒组相比，CG-GS-PRN-LDH杂化纳米复合物组在角膜前滞留时间明显增加，其中市售制剂组仅能在2h内检测到PRN药物浓度，而CG-GS-PRN-LDH杂化纳米复合物组可检测到6h内的PRN药物浓度，同时，当CG-GS投料量降低时，其滞留时间有所降低。
采用pKSolver药动学软件，对泪液中药物的浓度和时间数据进行隔室模型的拟合，拟合结果如下表。
不同杂化纳米复合物滴眼液在家兔泪液中的药物代谢动力学参数(Mean±SD，n＝6).
*P＜0.05，与Commercial product组相比，差异性显著.
**P＜0.05，与PRN-LDH组相比，差异性显著.
从泪液药动学数据可知，与市售制剂及PRN-LDH组相比，载药杂化纳米复合物滴眼液CG-GS-PRN-LDH(1∶1)，PRN药物在家兔泪液中经时曲线下面积(AUC0-6h)眼部平均滞留时间(MRT)及Cmax等药动参数具有显著性提高(P＜0.05)，其中CG-GS-PRN-LDH(1∶1)-50滴眼液组AUC0-6h为市售制剂的6.7倍，MRT为市售制剂的2.1倍，Cmax为市售制剂的3.5倍。当CG-甘氨酰-肌氨酸投料量降低为25mg时；与CG-GS-PRN-LDH(1∶1)-50滴眼液组相比，药动参数AUC0-6h及MRT所下降，而Cmax与市售制剂具有显著性提高。表明巯基化壳聚糖衍生物中的巯基与家兔角膜上皮表面的粘蛋白中的半胱氨酸形成的二硫键增加了载药杂化纳米复合物滴眼液的生物粘附性。在一定范围内，有机杂化材料中的巯基含量增加，可增加其生物粘附性，从而增加其在角膜前的滞留时间，以提高模型药物PRN的生物利用度。
细胞摄取实验
载药纳米复合物载体在原代人角膜上皮细胞中定量摄取的研究
按原代人角膜上皮细胞培养条件培养细胞后，每孔分别加入适宜浓度(PRN终浓度为2μg/mL)的PRN溶液，CG-甘氨酰-肌氨酸-PRN溶液，PRN-LDH纳米粒及不同甘氨酰-肌氨酸接枝率的CG-GS-PRN-LDH杂化纳米复合物溶液。于培养箱分别孵育1，2，4h。随后测定细胞样品中PRN药物的浓度(C)及蛋白含量(M)，通过公式
Drug uptake(μg/mg protein)＝C/M
计算细胞对药物的摄取量。
在相同给药浓度(PRN：2μg/mL)下，原代人角膜上皮细胞在不同孵育时间下摄取结果如图2所示。以与CG-GS-PRN-LDH相同CG-GS质量浓度的CG-GS-PRN混合溶液作为对照。随着孵育时间的延长，细胞内PRN药物摄取量逐渐增加，其结果与载FITC纳米粒的细胞定性摄取相一致。不同甘氨酰-肌氨酸接枝率的CG-GS-PRN-LDH杂化纳米复合物在不同时间段的原代人角膜上皮细胞药物摄取量无显著性差异，4h摄取指数分别为PRN溶液的3.43及3.03倍；分别为PRN-LDH纳米粒组的1.73及1.54倍。而与其相同CG-GS质量浓度的对照组相比，4h摄取指数为对照组的2.53倍。结果表明，CG-GS-PRN-LDH杂化纳米复合物在细胞水平的促渗作用更加明显，可能是由于甘氨酰-肌氨酸二肽作为Pept-1受体的天然底物，对原代人角膜上皮细胞表面Pept-1受体具较大亲和作用。
细胞摄取机制研究
细胞摄取的抑制性实验
本文考察能量抑制剂叠氮化钠；网格蛋白内吞抑制剂氯丙嗪及蔗糖对细胞摄取FITC标记的CG-GS-LDH杂化纳米复合物的影响。分别加入0.5mL內吞抑制剂(2mg/mL叠氮化钠；0.45M蔗糖；10μg/mL氯丙嗪)原代人角膜上皮细胞培养板孵育30min后，每孔分别加入0.5mL培养基稀释的CG-GS-FITC-LDH(FITC终浓度为2μg/mL)，于CO2培养箱中恒温继续培养4h，随后处理配成单细胞悬液(浓度为：5×105～1×106cells/mL)。以未给药的空白细胞作为阴性对照，以未给抑制剂仅给制剂的细胞作为阳性对照，采用流式细胞仪测定细胞内的FITC荧光强度(FITC激发波长：495am，发射波长：525nm)。
实验结果：在预先加入抑制剂孵育细胞阻断细胞转运通路后，再与CG-GS-FITC-LDH共孵育4h后，以未加抑制剂的给药细胞作为对照，通过流式细胞仪测定FITC荧光强度，结果如图3所示。
CG-GS-FITC-LDH杂化纳米复合物在叠氮化钠能量抑制作用下，与对照组相比，细胞摄取量呈现显著性降低(P＜0.001)，表明细胞内吞过程涉及能量消耗。在网格蛋白内吞抑制剂蔗糖及氯丙嗪的作用下，原代人角膜上皮细胞对CG-GS-FITC-LDH杂化纳米复合物的摄取也具有显著性抑制(P＜0.0.01，P＜0.5)。结果表明，CG-GS-FITC-LDH杂化纳米复合物的细胞摄取主要是网格蛋白介导的细胞内吞，与课题组前期研究以及文献报道一致。
天然底物甘氨酰-肌氨酸对细胞摄取抑制性试验
通过在原代人角膜上皮细胞中加入浓度分别为10mM、5mM及1mM的Pept-1底物竞争性抑制剂甘氨酰-肌氨酸，对Pept-1转运体进行不同程度的抑制，以考察不同甘氨酰-肌氨酸取代度的CG-GS-FITC-LDH杂化纳米复合物对细胞表面PepT-1转运体的主动靶向性。
甘氨酰-肌氨酸对CG-GS-FITC-LDH杂化纳米复合物细胞摄取的抑制作用。在处理好的原代人角膜上皮细胞培养板中，每孔分别加入0.5mL不同浓度的甘氨酰-肌氨酸(1mM，5mM，10mM)，随后测定细胞中FITC的荧光强度。甘氨酰-肌氨酸每个浓度设置3个复孔。
结果如图4所示。与对照组相比，当甘氨酰-肌氨酸浓度为5mM及1mM时，对不同甘氨酰-肌氨酸取代度的CG-GS-FITC-LDH杂化纳米复合物均无显著性细胞摄取抑制性；当甘氨酰-肌氨酸浓度提高为10mM时，不同甘氨酰-肌氨酸取代度的CG-GS-FITC-LDH杂化纳米复合物的细胞摄取均存在显著性抑制(P＜0.01)。表明原代人角膜上皮对该杂化纳米复合物的细胞摄取过程可能涉及PepT-1转运体的主动靶向作用。

Claims (8)

1.所合成的壳聚糖衍生物，其特点在于壳聚糖骨架上的不同氨基分别与具有Pept-1靶向性的甘氨酰-肌氨酸、粘膜粘附性的谷胱甘肽通过酰胺键偶联，使得壳聚糖具有对粘膜的粘附性和Pept-1靶向性的性质。其中壳聚糖分子通式为(C6H11NO4)n，平均相对分子质量为10～100KDa。其中甘氨酰-肌氨酸对壳聚糖上氨基的取代度为3.4％～15.53％；谷胱甘肽对壳聚糖取代后的衍生物甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖-谷胱甘肽的巯基含量为288.3μmol/g～459.46μmol/g。
2.权利要求1所优选壳聚糖的平均相对分子质量25～50KDa，脱乙酰度在95％以上。
3.权利要求1上式壳聚糖衍生物甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖-谷胱甘肽的巯基含量为250.00μmol/g～459.46μmol/g；优选巯基含量为288.3μmol/g～350.00μmol/g壳聚糖衍生物。
4.权利要求1、2上式壳聚糖衍生物甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖-谷胱甘肽中甘氨酰-肌氨酸的取代度为3.4％～15.53％；优选取代度为10.0％～14.0％的壳聚糖衍生物。
5.权利要求1上式壳聚糖衍生物，其特征在于壳聚糖上的反应基团是活泼的氨基；壳聚糖与两种接枝物甘氨酰-肌氨酸、谷胱甘肽均是通过酰胺键进行偶联。
6.权利要求3、4中具有粘膜粘附性和Pept-1靶向性的壳聚糖衍生物，甘氨酰-肌氨酸、谷胱甘肽和壳聚糖进行偶联的制备方法，特征包括下列步骤：
(1)合成反应制得芴甲氧羰酰基-甘氨酰-肌氨酸；
(2)所得产物与壳聚糖反应制得芴甲氧羰酰基-甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖；
(3)随后对上一步所得产物脱保护除去芴甲氧羰酰基得甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖；
(4)谷胱甘肽通过酰胺键与甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖上的2-氨基反应制得甘氨酰-肌氨酰-壳聚糖-谷胱甘肽。
7.权利要求1所述的具有粘膜的粘附性和Pept-1靶向性的壳聚糖衍生物载体的用途：由于壳聚糖衍生物能以谷胱甘肽的游离巯基与细胞表面黏蛋白末端半胱氨酸上巯基通过游离巯基氧化反应或硫交换反应形成共价二硫键，增强对黏膜的黏附能力，延长药物在粘膜前的滞留时间。且由于甘氨酰-肌氨酸对膜上Pept-1转运体的靶向作用。该功能化壳聚糖主要用于延长消化道、呼吸道、泌尿生殖道粘膜和眼表等粘膜丰富部位给药的作用时间，比如角膜、胃肠道粘膜、鼻粘膜和耳膜等。
8.权利要求1所述的具有粘膜的粘附性和Pept-1靶向性的壳聚糖衍生物载体与其他药物递送系统联合给药，可增强药物的粘膜前渗透作用，延长药物在粘膜前的循环时间。可与载药的无机纳米材料LDH、载药脂质体、脂质纳米粒、立方晶纳米粒、类脂质体、胶束、纳米乳、环糊精纳米粒和聚合物纳米粒等进行杂化或者联合递送药物。
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