CN103204893A - 利用Pep T 1靶向拟肽类二酯前药技术提高羧酸类药物口服吸收的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及靶向前药制剂技术方法。包括氨基酸或二肽对一类含有羧基的模型药物经连接臂进行修饰的Pep T1靶向前药的结构设计合成，并所述前药改善或提高了模型药物的口服生物利用度。本发明通式I

Description

利用Pep T 1靶向拟肽类二酯前药技术提高羧酸类药物口服吸收的方法

技术领域

本发明涉及靶向前药技术方法领域。包括氨基酸和二肽对一类含有羧基的模型药物经连接臂进行修饰的Pep T1靶向前药的结构设计合成，前药的膜通透性和对PepT1载体的靶向性通过在体肠吸收实验和Caco-2细胞转运实验进行了初步探索，验证了所述前药提高了羧酸类母体药物的口服生物利用度的可行性。

技术背景

口服药物的吸收是一个复杂的过程。药物在吸收的屏障可以归纳为4个方面：①溶解性差；②生物膜的通透性差；③化学稳定性差；④首过效应强，包括小肠和肝脏的首过效应。其中溶解性低和通透性差是制剂研究者最常见的问题。按照生物药剂学分级系统(Bioavailability Classification System，BCS)，药物可以分为四类，I类药物为高溶解度、高渗透性；II类药物为低溶解度、高渗透性；III类药物为高溶解度、低渗透性；IV类药物为低溶解度、低渗透性。其中I类药物无生物利用度问题，易于制成口服制剂；其他药物的口服吸收几乎均存在问题，生物利用度均不是很理想。因II类药物的溶解度底，针对提高药物溶解度传统的药剂学增溶手段有超细粉碎、成盐、添加增溶剂、助溶剂等；而III和IV类药物通透性差，这些增容方法可增加难溶性药物的水溶性，但可能改变不了药物的通透性，而前药的提出解决了通透性问题。通过对母体药物的分子构型进行优化改变，在体内经过化学或酶降解释放出母体药物发挥药效，其在改良普通药物溶解性和通透性方面具有重要意义。如生物药剂学分类系统中第III和IV类药物由于对生物膜渗透性有限，单纯的剂型设计很难显著改善其口服吸收。利用前药设计的理念，对模型药物进行结构优化，可以显著改善模型药物的生物利用度。

前药设计的一个重要方向是靶向性前药设计。它主要是将药物靶向到组织、器官、细胞内部特定的酶和基因、细胞表面某些抗原、受体以及转运载体等。其中，细胞转运载体因其重要的生理功能而倍受关注。它的主要功能是协助分子的细胞内外流动，而且这些内流转运载体的底物不仅局限于内源性物质，与内源性物质结构类似的药物也被这些转运载体识别并转运透过肠细胞进而显著提高口服吸收。在所有的靶向内流转运载体的前药研究中，肽类转运载体Pep T底物广泛，结合力强，是目前研究最深入，最广泛的一类内流跨膜转运蛋白。这种蛋白是一种质子依赖型的转运蛋白，具有12个跨膜区域和膜外的糖基化结构。目前所知的Pep T主要位于上皮细胞的刷状缘膜和基底外侧膜。位于刷状缘膜的Pep T有两种常见亚型，即Pep T1和Pep T2。Pep T1主要分布于小肠上皮细胞，主要转运食物中蛋白质水解的二肽和三肽，也参与一些口服药物，如β-内酰胺类抗生素头孢羟氨苄和阿莫西林、血管紧张素转化酶抑制剂福辛普利和依那普利、抗病毒药物贝他定和伐昔洛韦等的吸收。Pep T2则主要分布于肾，对由肾小球滤入血液中的寡肽进行重吸收，另在脉络丛及肺部等处也有分布。

将通透性差的母体药物通过与氨基酸或寡肽偶联后形成一种拟肽类的前药，靶向小肠的肽类转运载体Pep T1，从而提高母体药物的通透性，改善其口服生物利用度。这种策略是目前口服靶向前药研究的热点(Varma MV et al.Targeting intestinal transporters foroptimizing oral drug absorption.Curr Drug Metab.2010，11(9)：730-42.)。这种拟肽类前药主要有以下三个特点：①氨基酸或寡肽为一种两亲性化合物，引入到母体药物分子结构中，可改善药物的亲水亲脂性，这些基本理化性质的改变有利于改变药物的溶解，溶出及通透性；②各种拟肽类前药降解代谢产物为氨基酸或寡肽，对机体几乎无毒副作用，还可能有一定的营养作用；③这种拟肽类前药可能Pep T1的底物，从而利用Pep T1的转运作用显著增加药物的肠通透性进而提高口服生物利用度。另外如果母体药物是外排转运器(如P-糖蛋白或多药耐药相关蛋白MRP-2)的底物，修饰后前药可以逃逸外排蛋白的外排作用从而提高药物的吸收(Jain R，Agarwal S，Mandava NK，et al.Interaction of dipeptide prodrugs ofsaquinavir with multidrug resistance protein-2(MRP-2)：evasion of MRP-2 mediatedefflux.Iht J Pharm.2008，362(1-2)：44-51.)。总之，肠膜通透性差的母体药物通过结构修饰后形成靶向PepT1的口服前药这一思路对于改善一些生物药剂学性质差的药物的口服吸收具有重大的理论意义和实际应用价值。

目前已上市的有两个最成功的典型Pep T1靶向前药例子。一个是抗病毒药物伐昔洛韦(Valacyclovir)，其母体药物阿昔洛韦(Acyclovir)水溶性差，难以透过肠道上皮细胞，口服生物利用度只有20％。而伐昔洛韦是用L-缬氨酸将阿昔洛韦的3-0H酯化得到的前药，其为Pep T1的底物，经小肠上皮的Pep T1转运进入体内，再经肠道和肝脏首过作用转化为母体药物阿昔洛韦发挥抗病毒活性。这一结构的修饰使得伐昔洛韦的口服生物利用度比阿昔洛韦提高了3～5倍。另一个酯类前药的典型例子是抗病毒药物更昔洛韦的L-缬氨酸酯--缬更昔洛韦。缬更昔洛韦比母体药物更昔洛韦对Pep T1有更高的亲和力，能通过Pep T1转运进入体内，再经小肠细胞的酯酶水解成更昔洛韦发挥药效。更昔洛韦的口服生物利用度仅为6％，而缬更昔洛韦的口服生物利用度则提高至61％。

还有一些药物具有游离氨基，将其和配体氨基酸或寡肽的羧基形成肽键，可形成与Pep T1亲和力较强的酰胺类前药。例如礼来公司开发的抗焦虑药物LY354740在多种动物模型实验中有较好的治疗效果。由于LY354740属于BCS III类药物，即水溶性高，生物透过能力差的药物，其在大鼠和狗体内的口服生物利用度仅分别为10％和45％。对此，一系列针对提高膜透过能力的前药被开发研究，将LY354740的氨基与丙氨酸以肽键相连得到的前药LY544344，其在体肠灌流实验结果显示，当药物浓度为0.1mM时，渗透系数P_eff提高了10倍左右。除大约10％通过被动扩散进入细胞外，大部分LY544344经Pep T1转运进入细胞内部，并在细胞内被包括金属肽酶在内的多种肽酶几乎完全水解成LY354740，再通过被动扩散进入血液。其大鼠体内口服生物利用度有原来的10％提高到80％。

鉴于Pep T1靶向前药的广阔前景，很多研究者对Pep T1底物的结构进行了研究，一致的结论是Pep T1底物必须具有一个游离的氨基(Foley DW et al.Bioavailabilitythrough PepT1：the role of computer modelling in intelligent drug design.Curr ComputAided Drug Des.2010，6(1)：68-78.)。目前几乎所有的Pep T1靶向前药都是将氨基酸或寡肽的羧基与母体药物的羟基或氨基相连形成酯类或酰胺类前药，以保证合成的前药中保留游离的氨基。目前还没有针对含有羧基的母体药物进行PepT1靶向前药的研究报道。为了进一步拓宽PepT1靶向前药的应用范围，本发明选择模型药物的羧基作为修饰位点，通过乙二醇或1，2-丙二醇连接臂，将药物的羧基和氨基酸的羧基相连，形成了一种Pep T1靶向拟肽类二酯前药。首次将药物的范围扩展至羧基化合物，为解决部分羧基类药物通透性差，口服生物利用度低等问题提供了一种解决方案。

目前Pep T1靶向前药的主要设计思路是用具有特定空间结构和立体结构的氨基酸或寡肽修饰模型药物，以获得与Pep T1亲和力较强的前药。目前报道的模型药物多含有羟基或氨基，直接将其与氨基酸的羧基结合形成前药。而本发明选用齐墩果酸这一含有羧基的BCS IV类药物作为模型药物。齐墩果酸(oleaonic acid，OA)，又名庆四素，五环三萜类化合物，结构式如II，是一种从植物中提取的天然产物，有抗病毒、消炎、增强免疫和抑制免疫(免疫双向调解作用)、降脂、保肝等多种生物活性并且对恶性肿瘤化疗造成的免疫功能下降的恢复和对抗结核药物的肝损害的保护意义重大，毒性很低底。但是齐墩果酸水溶性和渗透性均较差，其大鼠口服生物利用度仅为0.7％，BCS分类，属于IV类药物。齐墩果酸的3-OH位阻大，不易被修饰，因此本发明以其羧基为修饰位点，合成了不同连接臂和不同氨基酸或二肽的二酯前药，通过大鼠在体肠吸收实验和Caco-2细胞实验对其膜通透性和靶向性进行了比较，以寻找具有较好连接臂和氨基酸或二肽的前药改善母体药物的通透性，进而显著改善其口服生物利用度。

另外目前已报道的丙二醇为连接臂的合成方法是由甲基环氧乙烷开环加成羧酸类化合物得到2-羟基丙酯，后与被保护的氨基酸或二肽在催化剂的作用下酯化后脱保护得到目标产物。但这种方法中杂质多，主产物与副产物难以分离，主要因为甲基环氧乙烷有两种开环机理导致。我们开始采用此法合成丙二醇为连接臂的二酯前药时也发现很难纯化最终的目标化合物。本发明使用了新的方法，使得分离简单，产品纯度好。首先起始原料羧酸类模型药物经过氯丙酮的取代反应生成丙酮基酯，再经还原得羟基丙酯。后与被保护的氨基酸在催化剂作用下酯化得氨基酸酰氧基丙酯，最后通干燥氯化氢气体脱保护并成盐后得到目标产物。

本发明中齐墩果酸拟肽类二酯前药合成方法为：将齐墩果酸经过氯丙酮的取代反应生成齐墩果酸-丙酮基酯，用四氢吡喃保护齐墩果酸羟基再将产物3-O-(2-四氢吡喃基)-齐墩果酸-丙酮基酯还原得3-O-(2-四氢吡喃基)-齐墩果酸-2-羟基丙酯。再与BOC保护的氨基酸在DCC和DMAP催化下酯化得3-O-(2-四氢吡喃基)-齐墩果酸-2-叔丁氧甲酰基氨基酸酰氧基丙酯，加对甲苯磺酸和通干燥氯化氢气体脱保护并成盐后得到目标产物。

发明内容

本发明以齐墩果酸这一羧酸类药物作为模型药物，首次合成了1，2-丙二醇为连接臂的齐墩果酸拟肽类二酯前药，通过改变药物的化学结构和理化性质，增加其对肠道Pep T1的靶向性，提高药物在肠道的转运量，促进其口服吸收。

本发明成功合成了齐墩果酸的七种氨基酸或二肽酯类前药分别为：齐墩果酸L-Val酯(7a)、齐墩果酸L-Phe酯(7b)、齐墩果酸L-Ile酯(7c)、齐墩果酸D-Val-L-Val酯(9a)、齐墩果酸L-Val-L-Val酯(9b)、齐墩果酸L-Ala-L-Ile酯(9c)和齐墩果酸L-Ala-L-Val酯(9d)。

本发明中丙二醇为连接臂的齐墩果酸拟肽类二酯前药合成路线为：

Reaction conditions：a)ClCH₂COCH₃，DMF，K₂CO₃，60℃.b)CH₂Cl₂，r.t.c)NaBH₄，CH₃OH，0℃.d)Boc-amino acid，DCC，DMAP，CH₂Cl₂，r.t.e)p-CH₃C₆H₄SO₃H，CH₃OH，r.t.f)(C₂H₅)₂O，dry HCl gas，0℃，then NaHCO₃ aqueous solution.g)Boc-amino acid，DCC，DMAP，CH₂Cl₂，r.t.h)(C₂H₅)₂O，dry HCl gas，0℃.

由表1可知，齐墩果酸的拟肽类二酯前药的溶解度较齐墩果酸均有不同程度的提高：提高最多的是9c，提高了30倍以上；最少的是7c，提高了3.5倍。说明经过氨基酸或二肽修饰后的拟肽类二酯前药可以显著提高母体药物齐墩果酸的亲水性，这有利于药物的口服吸收。

表1 OA和七个前药在水中的平衡溶解度比较

本发明的药物是利用靶向Pep T1转运机制来提高吸收的，为了比较不同连接臂对药物吸收的影响，分别合成了连接臂为乙二醇和1，2-丙二醇的齐墩果酸L-Val酯和L-Phe酯前药，并比较了四种前药在pH6.0缓冲液中的渗透性，表2所示结果，乙二醇和1，2-丙二醇连接臂前药都显著提高，其中丙二醇连接臂前药在大鼠空肠段的吸收效果更好。

表2以乙二醇或丙二醇为连接臂的齐墩果酸L-Val和L-Phe二酯前药在大鼠空肠的P_eff比较

^*p＜0.01 The permeability of the prodrugs containing ethoxy vs that propylene glycol linkers

p＜0.01 The permeability of prodrugs vs that of OA

采用在体肠吸收法分别对本发明合成的齐墩果酸前药考察其膜渗透性和靶向性，通过测定在不同pH缓冲液和加抑制剂后不同时间点循环液中的浓度来计算渗透系数。Pep T1的转运是一个质子驱动的过程，肠道中的pH环境对底物的吸收起着关键作用，所以实施例中比较了pH6.0和pH 7.4的缓冲液对等摩尔浓度(0.1mM)齐墩果酸及其前药吸收的影响如表3。

表3 OA和七个前药在pH6.0和pH7.4缓冲液中在大鼠空肠的P_eff比较

^**p＜0.01 The permibility of the drugs in pH6.0 vs that in pH7.4

^*p＜0.05 The permibility of the drugs in pH6.0 vs that in pH7.4

p＜0.01 The permibility of the prodrugs in pH6.0 vs OA in pH6.0

Gly-Sar是已知的经典Pep T1抑制剂，实施例中还考察了pH 6.0灌流液(含0.1mM药物)中加入50mM Pep T1抑制剂Gly-Sar后，空肠肠壁对前药的吸收，见表4.除7b外，前药在pH6.0和pH 7.4两种缓冲液中空肠吸收存在极显著差异(p＜0.01)，说明pH对这些药物的肠壁透过有较大影响。在pH 6.0的缓冲液中，与齐墩果酸相比所有的前药的小肠吸收均有所增加。经组间t检验，用氨基酸或二肽修饰的齐墩果酸前药7a、9b和9c在空肠有效透过系数P_eff齐墩果酸均存在极显著性差异(p＜0.01)；由于Pep T1属于质子驱动转运器，这一结果表明这些前药的吸收可能与Pep T1的转运相关。灌流液中加入抑制剂Gly-Sar后，7b、7d和9c空肠吸收显著降低。经组间t检验，7b、7d和9c的有效透过系数P_eff与未加入抑制剂相比，存在极显著差异(p＜0.01)。说明Pep T1典型底物Gly-Sar能明显降低前药7b、7d和9c的小肠吸收，因此这三种前药和Gly-Sar存在相同的吸收机制，其吸收可能是由PepT1介导的主动转运过程。

表4外加与不加抑制剂条件下三个前药在大鼠空肠的P_eff比较

^**p＜0.01 The permibility of the drugs in pH 6.0 vs that in the present of Gly-Sar

本发明利用Caco-2细胞模型，考察了齐墩果酸及其前药的膜渗透率和对Pep T1的靶向性，并且以Pep T1天然底物Gly-Sar为抑制剂研究了前药吸收机制。Caco-2细胞是人结肠癌上皮细胞，其生理结构和生化特征类似于人小肠上皮细胞，细胞单层与空气或培养液接触的面称肠腔侧(apical side，AP)；与聚酯纤维膜接触的面称基底侧，即肠壁侧(basolateralside，BL)。AP面具有很多载体，如寡肽转运蛋白Pep T1、多药耐药转运蛋白P-gp，MDR等，这些转运蛋白在物质的跨膜转运过程中发挥着重要作用。由于齐墩果酸及其前药紫外吸收弱，转运抑制实验中其浓度低于HPLC检测限，本发明选择LC/MS/MS测定药物浓度。如表5结果表明：齐墩果酸7a，9b和齐墩果酸相比，其表观透过系数P_app分别明显提高了5.32倍和3.34倍(p＜0.01)。7b，7c，9c提高了2倍，9d提高了1.4倍(p＜0.01)。摄取实验前后各孔TEER没有显著性降低，在实验浓度下，药物溶液没有打开Caco-2细胞间紧密连接，不影响细胞功能。此结果说明在Caco-2模型中，齐墩果酸L-Val酯对Pep T1具有更高的亲和力。

表5 OA和七个前药在Caco-2单层细胞的P_app比较

^*p＜0.01 The apparent permeability coefficeient(P_app)of prodrugs vs that of OA

当有抑制剂Gly-Sar存在时，如表6，7a，9b和9c在Caco-2单层细胞AP→BL侧的转运分别降低了1.3倍，1.6倍和1.4倍(p＜0.01)。而9a没有显著变化(p＜0.05)，说明在Caco-2细胞模型中，Gly-Sar对其吸收没有抑制作用，其吸收的增加不是主要通过Pep T1介导的转运而是由其他途径。摄取实验前后各孔TEER没有显著性降低，药物溶液没有打开Caco-2细胞间紧密连接，不影响细胞功能。

表6外加与不加抑制剂条件下四个前药在Caco-2单层细胞的P_app比较

^**p＜0.01 The apparent permeability coefficeient(P_app)of prodrugs vs that in the present of Gly-Sar

^*p＜0.05 The apparent permeability coefficeient(P_app)of prodrugs vs that in the present of Gly-Sar

基于以上在体肠吸收和Caco-2单层细胞摄取试验的结果得到以下结论：①以1，2-丙二醇为连接臂的前药比乙二醇连接臂的前药渗透性好；②前药中连接不同氨基酸里L-Val酯前药吸收比其他氨基酸连接的前药吸收好；③前药中连接不同二肽，以L-Val-L-Val酯前药比其他二肽酯前药吸收好。

因此，本发明提供了通过Pep T1靶向吸收提高药物生物利用度的方法。另一方面，本发明提供了拟肽类二酯前药技术提高羧酸类药物口服吸收的方法

具体实施方式

本发明通过以下实施例对本发明作进一步的阐述，但并不受限于此。本发明所用的齐墩果酸购自南京泽朗医药科技有限公司，含量＞98％。

实施例1齐墩果酸-2-L-缬氨酸酰氧基丙酯盐酸盐的合成

1、齐墩果酸-丙酮基酯(2)

向齐墩果酸(8g，17.51mmol)的DMF(50ml)溶液中加入一氯丙酮(1.80g，19.49mmol)和碳酸钾(2.26g，16.30mmol)，60℃下搅拌反应，TLC跟踪至齐墩果酸反应完全。冷却至室温，反应液倒入冰水中，有大量固体析出，过滤，滤饼用冰水洗涤三次，干燥。柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝8∶1)，得白色固体(6.25g，69.73％)。m.p.205-208℃；¹H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：5.30-5.28(m，1H，CH＝C)，4.63-4.50(m，2H，O-CH ₂ -CO)，3.24-3.18(m，1H，C₃-H)，2.90-2.86(m，1H，C₁₈-H)，2.16(s，3H，COCH ₃)，1.14(s，3H，CH ₃)，0.99(s，3H，CH ₃)，0.93(s，3H，CH ₃)，0.91(s，3H，CH ₃)，0.90(s，3H，CH ₃)，0.78(s，3H，CH ₃)，0.72(s，3H，CH ₃)；IR(KBr，cm^-1)：3559.33(OH)，1724.27(C＝O).

2、3-O-(2-四氢吡喃基)-齐墩果酸-丙酮基酯(3)

将2，3-二氢(2.63g，31.25mmol)的CH₂Cl₂(20ml)溶液滴加到化合物2(3.2g，6.25mmol)和对甲苯磺酸吡啶盐(0.017g，0.069mmol)的CH₂Cl₂(40ml)溶液中，室温搅拌，TLC跟踪至反应完全。用饱和碳酸氢钠溶液(40ml)洗涤三次，饱和氯化钠(40ml)洗涤三次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝15∶1)，得白色固体(3.56g，95.57％)。m.p.147-150℃；¹H NMR(CDCl₃)：δ5.29(t，1H，J＝2.5，CH＝C)，4.73(br，1H，OCHO)，4.55-4.57(m，2H，OCH ₂ CO)，3.45-3.49(m，2H，OCH ₂ )，3.26-3.22(m，1H，C₃-H)，2.89-2.84(m，1H，C₁₈-H)，2.15(s，5H，O＝CCH ₂ ，O＝CCH ₃ )，1.20(s，3H，CH ₃ )，0.98-0.80(br，12H，4CH ₃ )，0.75(s，3H，CH ₃ )，0.72(s，3H，CH ₃ )；IR(KBr，cm^-1)：1724.56(C＝O).

3、3-O-(2-四氢吡喃基)-齐墩果酸-2-羟基丙酯(4)

将化合物3(3.56g，5.97mmol)的甲醇(150ml)溶液冰浴至0℃，分批加入硼氢化钠(2.27g，59.73mmol)，搅拌，TLC跟踪至反应完全。将反应液旋干除去甲醇，加入水，用乙酸乙酯萃取(50ml×3)。有机相用饱和氯化钠洗涤(50ml×3)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝15∶1)，得白色固体(3.02g，84.55％)。m.p.190-191℃；¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：5.30-5.29(m，1H，CH＝C)，4.80(br，1H，O-CH-O)，3.83-4.13(m，3H，O＝C-O-CH-CH ₂ -O)，3.47-3.51(m，2H，OCH ₂ )，3.23-3.18(m，1H，C₃-H)，2.90-2.85(m，1H，C₁₈-H)，1.14(s，3H，CH ₃)，0.98(s，3H，CH ₃)，0.92(s，3H，CH ₃)，0.90(s，3H，CH ₃)，0.90(s，3H，CH ₃)，0.78(s，3H，CH ₃)，0.72(s，3H，CH ₃)；IR(KBr，cm^-1)：1718.18(C＝O)，1260.43(OH)；ESI-MS：621.44829[M+Na]⁺，497.39874[M-C₅H₉O₂]⁺.

4、3-O-(2-四氢吡喃基)-齐墩果酸-2-叔丁氧甲酰基缬氨酸酰氧基丙酯(5a)的合成通法

将化合物4(1.2g，2.00mmol)，L-缬氨酸(2.40mmol)，DCC(0.50g，2.40mmol)，催化量DMAP溶入CH₂Cl₂(25ml)中，室温下搅拌过夜。过滤，滤液浓缩，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝15∶1)，得白色固体。

5、齐墩果酸-2-叔丁氧甲酰基缬氨酸酰氧基丙酯(6a)的合成通法

向化合物5(1.77mmol)的甲醇(150ml)溶液中加入催化量的对甲苯磺酸，室温搅拌至基本反应完全。旋干除去甲醇，加100ml水，碳酸氢钠溶液调pH至中性，乙酸乙酯萃取(50ml×3)，饱和氯化钠溶液洗涤(50ml×3)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1)，得白色固体。

6、齐墩果酸-2-缬氨酸酰氧基丙酯(7a)的合成通法

将化合物6用乙醚溶解，通入氯化氢干燥气体至溶液变浑浊(约2h)，旋干，油泵抽干，得盐酸盐产物。

齐墩果酸-2-L-缬氨酸酰氧基丙酯盐酸盐(7a)，液相纯度98.67％。m.p.119-122℃；¹H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：8.91(s，3H，NH₃)，5.28(s，1H，CH＝C)，5.21(br，1H，COCHN)，4.12(m，2H，COOCH ₂)，3.903.90(br，1H，CHOOC)，3.76-3.69(m，1H，OH)，3.23-3.20(m，1H，C₃-H)，2.86-2.82(m，1H，C₁₈-H)，1.13(s，3H，CH ₃)，0.98(s，3H，CH₃)，0.91-0.90(m，9H，3CH ₃ )，0.78(s，3H，CH ₃)，0.72(s，3H，CH ₃)；IR(KBr，cm^-1)：3422.93(OH)，1736.75(C＝O)，1601.66(NH₃ ⁺)；ESI-MS：614.5[M+H]⁺.

实施例2齐墩果酸-2-L-苯丙氨酸酰氧基丙酯盐酸盐的合成

该制备类似于实施例1，用L-苯丙氨酸代替缬氨酸得到齐墩果酸-2-L-苯丙氨酸酰氧基丙酯盐酸盐(7b)，液相纯度97.92％。m.p.132-135℃；¹H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：8.84-8.77(br，2H，NH ₃ ⁺Cl^-)，7.32-7.29(m，3H，arom)，7.17-7.14(m，2H，arom)，5.28(s，1H，CH＝C)，5.11(br，1H，COCHN)，4.00(br，2H，COOCH ₂)，3.49(t，1H，J＝6Hz，O＝C-O-CH-CH₂-O)，3.24-3.21(m，1H，C₃-H)，2.88-2.83(m，1H，C₁₈-H)，1.12(s，3H，CH ₃)，0.99(s，3H，CH₃)，0.94-0.84(m，9H，3CH ₃ )，0.78(s，3H，CH ₃)，0.73(s，3H，CH ₃)；IR(KBr，cm^-1)：3426.53(OH)，1736.66(C＝O)，1604.30(NH₃ ⁺)；ESI-MS：662.52179[M+H]⁺，684.45994[M+Na]⁺.

实施例3齐墩果酸-2-L-异亮氨酸酰氧基丙酯盐酸盐的合成

该制备类似于实施例1，用L-异亮氨酸代替缬氨酸得到齐墩果酸-2-L-异亮氨酸酰氧基丙酯盐酸盐(7c)，液相纯度98.16％。m.p.81-84℃；¹H-NMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)：8.44(s，3H，NH ₃)，5.18(s，1H，CH＝C)，5.12(br，1H，COCHN)，4.12-3.96(m，2H，COOCH ₂)，3.85(m，1H，CHOOC)，3.01-2.96(m，1H，C₃-H)，2.79-2.75(m，1H，C₁₈-H)，1.11(s，3H，CH ₃)，0.92-0.84(m，12H，4CH ₃ )，0.66(s，3H，CH ₃)，0.65(m，3H，CH₃)；IR(KBr，cm^-1)：3440.24(OH)，1737.05(C＝O)，1596.46(NH₃ ⁺)；ESI-MS：628.49790[M+H]⁺.

实施例4齐墩果酸-2-L-缬氨酸-D-缬氨酸酰氧基丙酯的合成

1、将实施例1最终产物，D-缬氨酸(1.54mmol)，DCC(0.32g，1.54mmol)，催化量DMAP加入到CH₂Cl₂(25m1)中，室温下搅拌过夜。过滤，滤液浓缩，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝8∶1)，得白色固体产物，齐墩果酸-2-叔丁氧甲酰基-L-缬氨酸-D-缬氨酸酰氧基丙酯。m.p.69-71℃；¹H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：6.45(m，1H，NH)，5.28(m，1H，CH＝C)，5.12(br，1H，COCHN)，5.00(br，1H，NH)，4.58-4.54(m，1H，COCHN)，4.15-4.13(m，1H，CHOOC)，4.04-3.99(m，2H，COOCH ₂)，3.24-3.21(m，1H，C₃-H)，2.87-2.83(m，1H，C₁₈-H)，1.13(s，3H，CH ₃)，1.01-0.88(m，12H，4CH ₃ )，0.78(s，3H，CH ₃)，0.72(m，3H，CH₃)；IR(KBr，cm^-1)：1730.59(C＝O)，1668.15(C＝O)，1303.45(NH)；ESI-MS：813.59864[M+H]⁺，835.58142[M+H]⁺.

2、齐墩果酸-2-L-缬氨酸-D-缬氨酸酰氧基丙酯(9a)的合成通法

将化合物8用乙醚溶解，通入干燥氯化氢气体至溶液变浑浊(约需2h)，倾去上清液，底部残留物真空抽干，得泡沫状白色固体，齐墩果酸-2-L-缬氨酸-D-缬氨酸酰氧基丙酯盐酸盐(9a)，液相纯度为96.83％。m.p.183-186℃；¹H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：8.25(s，3H，NH₃)，5.27(br，1H，CH＝C)，5.11(br，1H，COCHN)，5.00(br，1H，NH)，4.46(m，2H，COCHN，CHOOC)，4.11(m，2H，COOCH ₂)，3.23-3.18(m，1H，C₃-H)，2.85-2.81(m，1H，C₁₈-H)，1.13(s，3H，CH ₃)，0.98(s，3H，CH ₃)，0.92-0.90(m，9H，3CH ₃ )，0.78(s，3H，CH ₃)，0.71(m，3H，CH3)；IR(KBr，cm^-1)：1734.13(C＝O)，1684.80(C＝C)；ESI-MS：713.55010[M+H]+^.

实施例5齐墩果酸-2-L-缬氨酸-L-缬氨酸酰氧基丙酯合成

该制备同实施例4，D-缬氨酸换成L-缬氨酸。齐墩果酸-2-L-缬氨酸-L-缬氨酸酰氧基丙酯盐酸盐(9b)，液相纯度为98.54％。m.p.170-173℃；¹H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：8.26(s，3H，NH₃)，5.27(br，1H，CH＝C)，5.11(br，1H，COCHN)，5.02(br，1H，NH)，4.47-4.44(m，2H，COCHN，CHOOC)，4.13(m，2H，COOCH ₂)，3.22-3.18(m，1H，C₃-H)，2.83-2.80(m，1H，C₁₈-H)，1.10(s，3H，CH ₃)，0.98(s，3H，CH ₃)，0.92-0.90(m，9H，3CH ₃ )，0.79(s，3H，CH ₃)，0.71(m，3H，CH3)；IR(KBr，cm^-1)：1734.18(C＝O)，1682.97(C＝C)；ESI-MS：713.55010[M+H]⁺.

实施例6齐墩果酸-2-L-丙氨酸-L-异亮氨酸酰氧基丙酯盐酸盐合成

该制备同实施例4，D-缬氨酸换成L-丙氨酸。齐墩果酸-2-L-丙氨酸-L-异亮氨酸酰氧基丙酯盐酸盐(9c)，液相纯度为98.19％。m.p.164-166℃；¹H-NMR(300MHz，CDCl3)，δ(ppm)：8.28(s，3H，NH₃)，5.28(s，1H，CH＝C)，5.12(br，1H，COCHN)，4.34-3.91(m，2H，CHN，COOCH ₂CHOOC)，3.51-3.44(m，1H，OH)，3.20(m，1H，C₃-H)，2.86-2.82(m，1H，C₁₈-H)，1.13(s，3H，CH ₃)，0.99(s，3H，CH ₃)，0.90(s，9H，3CH ₃)，0.78(s，3H，CH ₃)，0.71(s，3H，CH ₃)；IR(KBr，cm^-1)：1734.47(C＝O)，1679.37(C＝C)；ESI-MS：699.56056[M+H]⁺，721.51297[M+Na]⁺.

实施例7齐墩果酸-2-L-丙氨酸-L-缬氨酸酰氧基丙酯盐酸盐合成

该制备同实施例4，D-缬氨酸换成L-丙氨酸。齐墩果酸-2-L-丙氨酸-L-缬氨酸酰氧基丙酯盐酸盐(9d)，液相纯度为96.94％。m.p.174-177℃；¹H-NMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)：8.81(m，1H，NH)，8.13(s，3H，NH ₃)，5.18(s，1H，CH＝C)，5.02(br，1H，COCHN)，4.34-4.29(m，2H，CHOOC，CHN)，4.14-3.91(m，2H，COOCH ₂)，2.99(m，1H，C₃-H)，2.79-2.74(m，1H，C₁₈-H)，1.09(s，3H，CH ₃)，0.98(s，3H，CH ₃)，0.96(s，3H，CH ₃)，0.89(s，3H，CH ₃)，0.84(s，3H，CH ₃)，0.67(s，3H，CH ₃)，0.65(s，3H，CH ₃)；IR(KBr，cm^-1)：1733.75(C＝O)，1681.31(C＝C)；ESI-MS：685.51587[M+H]⁺.

实施例8齐墩果酸-L-缬氨酸乙酯盐酸盐的合成

1、Boc保护缬氨酸的合成

将L-缬氨酸0.75g溶于2.5％氢氧化钠溶液25ml中，加入叔丁醇15ml，于冰浴(0℃)下滴加(Boc)2O。室温反应6-12h后，减压旋去大部分溶剂，粗品用水溶解后，乙醚洗涤(10ml×3)。将水相用1M盐酸调节pH至2，乙酸乙酯萃取(15ml×3)，无水硫酸钠干燥有机相，真空干燥。

2、齐墩果酸2-羟乙基酯的合成

将齐墩果酸(3.03g，6.64mmol)溶于DMF(40ml)，向其中加入2-溴乙醇(2.47g，19.93mmol)，碳酸钾(1.38g，9.97mmol)。室温反应6h后，抽滤。向滤液中加入50ml水，搅拌0.5h，抽滤水洗。产物为白色固体((3.04g，92％)，熔点186-188℃。

3、齐墩果酸缬氨酸乙酯的合成

将上述化合物齐墩果酸2-羟乙基酯溶于40ml无水二氯甲烷中，依次加入Boc-缬氨酸，DCC(1.2eq)，DMAP(0.5eq)。室温搅拌6-12h，抽滤。滤液旋干后，制砂，柱层析(PE/乙酸乙酯＝8∶1-6∶1)得化合物。

4、齐墩果酸缬氨酸乙酯盐酸盐的合成

将上述齐墩果酸缬氨酸乙酯溶于40ml无水乙醚中，通入干燥的HCl气体约0.5h，析出白色固体，抽滤后，乙醚洗涤滤饼，烘干。

齐墩果酸-L-缬氨酸乙酯盐酸盐按上述方法得到，产物为白色固体，纯度为99.16％(0.88g)，熔点222-227℃。[α]18.5D＝47.0(c＝0.17，MeOH)；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ0.72(s，3H，CH3)，0.78(s，3H，CH3)，0.99(s，3H，CH3)，1.14(s，3H，CH3)，1.46(brs，6H，2×CH3)，1.77(s，6H，2×CH3)，2.50(s，1H，C3-OH)，2.86(brs，1H，C18-H)，3.21(brs，1H，C3-H)，3.80(s，1H，CH)，4.20(brs，4H，OCH2CH2O)，5.31(s，1H，C12-H)，8.90(brs，3H，NH2·HCl)；MS(ESI)m/z＝600.6[M+H]+；IR(KBr，cm-1)v：3434，2946，1737，1727，1629，1464，1228，1032.

实施例8齐墩果酸-L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐的合成

该制备类似于实施例7，用L-苯丙氨酸代替缬氨酸得到齐墩果酸-L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐，产物为白色固体，纯度为98.31％(0.90g)，熔点101-104℃。[α]18.5D＝46.2(c＝0.18，MeOH)；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ0.73(s，3H，CH3)，0.77(s，3H，CH3)，0.89(s，6H，2×CH3)，0.98(s，3H，CH3)，1.13(s，3H，CH3)，2.86(d，1H，J＝13.8Hz)，3.20-3.24(m，1H，C3-H)，3.42-3.48(m，2H，CH2-C6H5)，4.18-4.35(m，4H，OCH2CH2O)，5.30(brs，1H，C12-H)，7.32(s，5H，C6H5)，8.80(brs，3H，NH2·HCl)；MS(ESI)m/z＝648.5[M+H]+；IR(KBr，cm-1)v：3434，2945，2872，1736，1629，1457，1202，1175，1046.

实施例9齐墩果酸前药理化性质的研究

齐墩果酸前药平衡溶解度的测定：精密称取药物5mg，置1.5ml离心管，加入1ml的纯净水，涡旋1min，使药物与溶剂混合均匀，置于37℃水浴中恒温振荡24h后，取适量离心(10000rpm×10min)。取上清液，用HPLC测定，用外标法计算药物在纯净水中的溶解度。

实施例10齐墩果酸前药大鼠在体肠吸收的研究

取自然饮水条件下禁食24h的SD大鼠，腹腔注射20％的乌拉坦1.5ml/kg，背位固定。沿腹中线打开腹腔，于三段空肠的始端和末端插管，结扎。以37℃恒温的生理盐水缓慢清洗肠管，直至流出液干净为止，排空生理盐水。接上恒流泵，以0.2ml/min的流速，用含药灌流液(0.1mM药物；0.1mM药物+50mM Gly-Sar)饱和已煮沸2h的灌流管路30min后，将肠管与灌流管道相连，平衡30min(流速0.2ml/min)达到稳态，以充满整个管路后流出的第一滴药液开始计时，于20、40、60、80、100、120min收集流出药液，取0.5ml加入4.5ml氢氧化钠，涡旋显色，在紫外分光光度计上测定吸光度。另取0.5ml离心(10000rpm，10min)，取上清进HPLC测定药物浓度。结束后测定肠段的长度和内径。

肠壁有效通透系数P_eff按以下公式计算：

$P_{\mathrm{eff}}=\frac{-Q\ln \frac{C_{\mathrm{out}\left(\mathrm{oorr}\right)}}{C_{\mathrm{in}}}}{2\mathrm{\πrl}}$

上式中C_in表示进肠管的灌流液中药物的浓度(mg/ml)；

C_out(corr)表示校正后出肠管的灌流液中药物的浓度(mg/ml)；Q表示灌流液的体积流速(0.2ml/min)；L表示被灌注的肠管的长度(cm)；r表示肠道的半径(cm)。C_out(corr)用以下等式计算：

C_out(corr)＝C_outV_out/V_in

上式中C_out表示出肠管的灌流液中药物的浓度(mg/ml)；V_out表示出肠管的灌流液的体积(ml)；V_in表示进肠管的灌流液的体积(ml)。

实施例10齐墩果酸前药在Caco-2细胞模型的转运研究

接种至Millicell^TM培养孔中的Caco-2细胞培养至21天后，用跨膜电阻仪测定跨膜电阻，各孔跨膜电阻(TEER)＞350Ω×cm²，符合实验要求。将配制的转运溶液和抑制溶液过滤除菌后，用预热至37℃的HEPES缓冲液洗涤生长有Caco-2的Millicell孔两次，再加入预热的HEPES缓冲液，37℃，5％CO₂条件下孵育15min，测定跨膜电阻后，吸弃HEPES。在AP侧(肠腔侧，供给池)加入含有受试药物的MES缓冲液(pH 6.0)400μl，作为供给液；在BL侧(基底侧，接受池)加入500μl空白HEPES(pH 7.4)作为接受液。将载有MillicellTM的24孔板于5％CO₂恒温(37℃，相对湿度90％)培养箱中温孵，分别在30，60，90，120min从接受池中吸取500μl接受液，同时补加500μl空白HEPES。2h摄取结束后测定各孔跨膜电阻。样品取上清进LC/MS/MS。

药物通过Caco-2细胞单层，从AP→BL的表观渗透系数P_app(cm/s)按以下公式计算：

P_app＝(ΔQ/Δt×A×C₀)

上式中ΔQ表示转运时间Δt内的转运量；A表示Millicell^TM膜面积(0.6cm²)；C₀表示Caco-2细胞单层AP侧的初始给药浓度。

Claims (7)

1.一种靶向前药制剂技术方法，这类Pep T1靶向拟肽二酯类前药的结构式I为：

式中：A1表示含有羧基模型药物残基；A2表示连接臂残基；A3为氨基酸或二肽残基。

2.根据权利要求1所述化合物，其特征在于：A1为羧酸类模型药物残基。模型药物可以选自熊果酸、齐墩果酸、乌苏酸、灯盏乙素、马兜铃酸A、青蒿琥酯、甘草酸、甘草次酸、黄芩苷、大黄酸、丹酚酸、丹参素、阿魏酸、没食子酸、桂皮酸及沙奎那韦、依那普利拉、西拉普利拉、氨卞西林、奥赛米韦羧酸、美拉加群等含有羧基的中药有效成分或西药。

3.根据权利要求1或2所述化合物，其特征在于：A2为乙二醇和1，2-丙二醇连接臂中的一种残基，分别是-(CH₂)₂-或-CH₂CH(CH₃)-，优选1，2-丙二醇连接臂残基。

4.根据权利要求1或3所述化合物，其特征在于：A3为L-Gly、D-Gly、L-Ala、D-Ala、L-Pro、D-Pro、L-Val、D-Val、L-Leu、D-Leu、L-Ile、D-Ile、L-Ser、D-Ser、L-Thr、D-Thr、L-Gln、D-Gln、L-Asn、D-Asn、L-Met、D-Met、L-Cys、D-Cys、L-Phe、D-Phe、L-Tyr、D-Tyr、L-Trp、D-Trp、L-Asp、D-Asp、L-Glu、D-Glu、L-Arg、D-Arg、L-Lys、D-Lys、L-His或D-His等的残基，优选L-Val残基。

5.根据权利要求1或3所述化合物，其特征在于：A3为二肽残基，其二肽为L-Val-L-Val、D-Val-L-Val、L-Ala-L-Val、L-Gly-L-Val、L-Phe-L-Gln、L-Gly-L-Gln、L-Gly-L-Gly、L-Ala-L-Ile或L-Phe-L-Val(右侧氨基酸在结构末端)等。优选L-Val-L-Val残基。

6.根据权利要求1或4或5所述化合物，其特征在于化合物I制备成盐酸盐。

7.根据权利要求1或3所述化合物的制备方法，以1，2-丙二醇为连接臂的前药合成方法包括：起始原料羧酸类模型药物经过氯丙酮的取代反应生成丙酮基酯，再经还原得羟基丙酯。后与被保护的氨基酸在催化剂作用下酯化得氨基酸酰氧基丙酯，通干燥氯化氢气体脱保护并成盐后得到目标产物。